تأثیر تنظیم کننده‌های رشد گیاهی و محرک‌های زیستی بر کالوس‌زایی گیاه پروانش

مقدمه

استفاده از گیاهان دارویی همزمان با آغاز بشریت و زندگی انسان بر روی کره زمین است. انسان‌های نخستین بدون هیچ شناخت و اطلاعاتی از ترکیبات موجود در این گیاهان از آن‌ها استفاده می­کردند، امّا امروزه اهمیت این گیاهان و ترکیبات موجود در آن‌ها در زندگی بشر اهمیت چشمگیری پیدا کرده ‌است. امروزه حدود 80 درصد از مواد دارویی مورد استفاده بشر به طور مستقیم و یا غیر مستقیم از گیاهان دارویی تأمین می‌شود، به طوری که از بین 252 داروی تائید شده توسط سازمان بهداشت جهانی 11 درصد آن را داروهایی با منشاء گیاهی تشکیل می‌دهند (Kumar et al., 2022). گیاه پروانش با نام علمی Catharanthus roseous از خانواده آپوسیناسه است و در نقاط مختلف ایران با نام­های متفاوتی شناخته شده است که از جمله آن­ها می­توان به قصاب­مصری، گل تلفنی و ونکه­ی صغیره اشاره کرد. گیاه پروانش بومی مناطق جنوب شرقی و شرق ماداگاسکار است و در مناطق گرمسیری نیز یافت می‌شود. پروانش دارای سطح پلوئیدی 16=n2 است. راه‌های مختلفی جهت پرورش این گیاه وجود دارد. امروزه استفاده از کشت درون شیشه‌ای در داخل اتاقک‌های رشد گیاهی و محیط‌های کشت جامد و مایع یکی از این روش‌ها است. کشت سلول در شرایط آزمایشگاهی سبب می­شود که بتوانیم دارای متابولیت­های ارزشمند در تمام فصول و با مقدار و کیفیت مورد نظر باشیم (Sharafi et al., 2014). در کشت بافت از قسمت‌های مختلف گیاه می­توان استفاده کرد. در روش کشت درون شیشه‌ای این گیاه از بافت‌ها و اندام‌هایی از جمله کالوس، ریشه های موئین، ساقه، برگ و ... می­توان جهت تولید گیاهچه و تغییر در میزان آلکالوئید‌ها استفاده نمود (Ahmadi et al., 2012). نقش اصلی هورمون‌های گیاهی تنظیم تمام فرآیندهای فیزیولوژیکی و رشد گیاه است. ساختارهای هورمون‌ها مانند اکسین، سیتوکینین، جیبرلین، اسیدآبسزیک، اتیلن، پلی‌آمین‌ها، جاسمونات، اسید سالیسیلیک و بر اسیتوستروئیدها متنوع هستند. در میان هورمون‌ها، اکسین وسیتوکینین برای تنظیم بسیاری از فرآیندهای رشد، نمو و کشت بافت ضروری است. اکسین سبب رشد ریشه و سیتوکینین هورمون مهارکننده رشد ریشه است (Schaller et al., 2015; Hagen & Guilfoyle, 2002; Bajguz & Piotrowska, 2009; Schaller et al., 2015). وزن مولکولی هورمون‌های گیاهی بسیار پائین است و در غلظت میکرومولار و کمتر عمل می‌کنند. نقش اصلی هورمون‌های گیاهی تنظیم تمام فرآیندهای فیزیولوژیکی و رشد گیاه است. در زمینه تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی بر ریز ازدیادی و تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاه پروانش، پژوهش‌های متعددی انجام شده است. (2019) Rahman et al. و (2017)Kumari & Ra  نشان داده‌اند که ترکیب‌های مختلف اکسین و سیتوکینین، به طور قابل توجهی بر وزن خشک کالوس و میزان تولید آلکالوئیدهای وین‌بلاستین و وین‌کریستین تأثیر می‌گذارند. به طور خاص، غلظت 3 میلی‌گرم در لیتر BAP و 3 میلی‌گرم در لیتر NAA بیشترین وزن خشک را ایجاد کرده، و ترکیب2.4-D /NAA حداکثر میزان وین‌بلاستین و وین‌کریستین را به همراه داشته است. در مقابل، IAA/NAA سبب کاهش بیوسنتز آلکالوئیدها شده است. همچنین، (2011) Singh et al. گزارش کردند ریزنمونه‌های هیپوکوتیل در محیط کشت MS حاوی 1 میلی‌گرم در لیتر BAP و 1 میلی‌گرم در لیتر NAA، در شرایط تاریکی، بیشترین پاسخ القای کالوس (99%) را در مدت 10 روز نشان داده‌اند. این یافته‌ها نشان می‌دهند که انتخاب مناسب تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی و شرایط محیطی، نقش مهمی در بهینه‌سازی ریزازدیادی و تولید ترکیبات دارویی در گیاه پروانش دارد. اسیدآسکوربیک یک ویتامین محلول در آب است و جزء متابولیت‌های مهم در گیاهان محسوب می‌شود که در اکثر فرآورده‌های گیاهی به ویژه مرکبات، گوجه فرنگی، گیاهان سبز و سیب‌زمینی به مقدار زیادی وجود دارد. از سوی دیگر، اسید آسکوربیک در شرایط طبیعی به شکل احیا شده ‌است که در نتیجه فعالیت دو آنزیم دی‌هیدروآسکوربات‌ ردوکتاز و مونو هیدرو آسکوربات ‌ردوکتاز است. اسید آسکوربیک به عنوان یک آنتی‌اکسیدان در گیاهان مطرح می­شود که در ارتباط با دیگر ترکیبات آنتی‌اکسیدانی بوده و با پاکسازی اشکال اکسیژن واکنشی، گیاه را در برابر تنش‌های اکسیداتیو حفاظت می­کند (Smirnoff, 1996). اسید آسکوربیک می‌تواند چرخه سلولی، تقسیم سلولی و رشد سلولی را در گیاهان تعدیل کند و بدین ترتیب، در رشد و نمو گیاهی درگیر شود. پژوهش‌های مختلف نشان می‌دهند هر جا فعالیت میتوزی زیاد باشد، مقدار اسید آسکوربیک هم در S به G زیاد است و حضور آن برای عبور از مرحله چرخه سلولی، ضروری است. این ماده، توسط کوتاه کردن زمان G و تحریک ورود به مرحله S، سبب کوتاه شدن زمان چرخه سلولی شده و با دخالت در این چرخه، منجر به افزایش رشد سلول گیاهی می‌شود ‌(Smirnoff, 1996). عصاره مخمر به عنوان یک منبع طبیعی برای بسیاری از تیامین‌ها، موادمعدنی، ریبوفلاوین‌ها، نیاسین، پیریدوکسین و ویتامین B₁، B₂، B₃، B₁₂، سیتوکینین و مواد مغذی همچنین ترکیبات آلی کربوهیدرات‌ها، پروتئین‌ها، اسید نوکلئیک‌ها و لیپیدها است. محتوای اکسین و سیتوکینین در عصاره مخمر بسیار بالا است (Keramati et al., 2011). عصاره مخمر با تأثیرگذاری بر هورمون‌های گیاهی، بهبود شرایط محیطی و افزایش فعالیت‌های متابولیکی می‌تواند به تقویت فرآیند کالوس‌زایی کمک کند. این تأثیرات می‌تواند به افزایش کیفیت و تعداد کالوس‌های تولید شده در آزمایش‌های کشت بافت گیاهی منجر شود. علاوه بر عصاره مخمر، ملاتونین نیز به عنوان یک تنظیم‌کننده رشد گیاهی نقش مهمی در کالوس‌زایی دارد؛ این هورمون با خواص آنتی‌اکسیدانی خود، به کاهش استرس اکسیداتیو در بافت‌های گیاهی کمک کرده و می‌تواند فرآیند تقسیم سلولی و تمایز سلولی را تحریک نماید، در نتیجه سبب بهبود تشکیل و رشد کالوس می‌شود. ملاتونین (ان-استیل 5- متوکسی تریپتامین) در سال 1958 اولین بار از غده پینه‌آل گاوی شناسایی و جدا شد و در گیاهان تک لپه و دولپه نیز در سال 1995 شناسایی و جداسازی شد. ملاتونین در گیاهان نقش‌های متنوعی دارد که عبارتند از: 1) تنظیم ریتم شبانه‌روزی 2) تنظیم رشد و نمو گیاه 3) آنتی‌اکسیدان قوی 4) حفظ تمامیت غشاء و جلوگیری از پراکسیداسیون لیپید 5) تأثیر بر دستگاه فتوسنتز 6) مقاومت گیاه در برابر تنش‌های محیطی (Olumi & Ahmadi Mousavi, 2012). هدف از این پژوهش، بررسی بهترین روش ضدعفونی بذر با بیشترین درصد زنده­مانی و ارزیابی سطوح مختلف هورمون­های گیاهی، اسید آسکوربیک ، ملاتونین و عصاره مخمر بر کالوس‌زایی گیاه پروانش است.

مواد و روش‌ها

مواد گیاهی

در این پژوهش، بذرهای گیاه پروانش از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه شد.

ضدعفونی و کشت بذر

برای تعیین روش ضدعفونی مناسب بذرهای گیاه پروانش، از درصدهای مختلف هیپوکلریت سدیم استفاده شد: ابتدا بذرها با آب دیونیزه اتوکلاو شده شستشو داده شدند، سپس بذرها به سه قسمت تقسیم شد: قسمت اول بذرها ابتدا در الکل 70% به مدت 3 دقیقه غوطه‌ور شده سپس با آب دیونیزه شستشو داده شد و بعد با هیپوکلریت سدیم 5/1 درصد به مدت 20 دقیقه ضدعفونی شدند. در نهایت بذرها 3 مرتبه با آب دیونیزه اتوکلاو شده و هر بار به مدت 5 دقیقه شستشو داده شدند. تمامی روش‌های ذکر شده برای دو قسمت دیگر نیز تکرار شد ولی برای یک قسمت از هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد و برای قسمت دیگر از هیپوکلریت سدیم 5 درصد استفاده شد. سپس بذرهای ضدعفونی شده توسط کاغذ صافی اتوکلاو شده خشک شدند. در نهایت توسط پنس استریل در محیط کشت MS بدون هورمون کشت شده و تا زمان جوانه‌زنی در اتاقک رشد در تاریکی و دمای 2±24 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند. پس از ظاهر شدن جوانه‌ها، در قفسه‌های اتاقک رشد با دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار گرفتند.

بررسی ترکیب هورمونی مناسب کالوس­زایی

پس از رسیدن گیاهچه­ها به سن مناسب (8 برگی)، برگ­ها به قطعات 5/0 تا 1 سانتی­متری برش داده شده و به عنوان ریز نمونه بر روی محیط کشت MS حاوی ترکیبات مختلف هورمون­های گیاهی 2.4-D (5/0، 1 و 5/1 میلی­گرم در لیتر)، NAA (5/0، 1 و 3 میلی­گرم در لیتر) و BAP (5/0، 1 و 3 میلی­گرم در لیتر) کشت شدند (جدول 3) و تحت دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و دمای 25 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند و پس از گذشت 4 هفته درصد کالوس­زایی و وزن تر کالوس اندازه­گیری شد.

بررسی تأثیر اسیدآسکوربیک بر کالوس­زایی

پس از تعیین بهترین ترکیب هورمون‌های گیاهی (1 NAA+ 1 BAP)، تأثیر غلظت‌های مختلف اسیدآسکوربیک بر کالوس­زایی در این محیط کشت مورد ارزیابی قرار گرفت. به علت حساس بودن اسید آسکوربیک به دمای بالا از فیلتر سر سرنگی برای استریل آسکوربیک اسید استفاده شد و پس از اتوکلاو کردن محیط کشت و سرد شدن آن تا دمای حدود 45-40 درجه سانتی‌گراد، غلظت‌های مورد نیاز برای مقادیر 50، 100 و 150 میلی‌گرم در لیتر به محیط‌های کشت افزوده شد. ریزنمونه‌های برگی به قطعات کوچک تقسیم شدند و بر روی این محیط کشت­ها قرار داده‌ شدند. پس از رشد کالوس، درصد کالوس­زایی و وزن تر کالوس‌ها اندازه‌گیری و با یکدیگر مقایسه شدند.

بررسی تأثیر ملاتونین و عصاره مخمر بر کالوس‌زایی

محیط کشت مورد استفاده، محیط MS دارای هورمون‌های NAA و BAP به میزان 1 میلی‌گرم در لیتر بودکه قبل از اتوکلاو غلظت‌های مورد نیاز ملاتونین برای مقادیر 50، 100 و 150 میلی‌گرم در لیتر به محیط‌های کشت افزوده شد. همچنین عصاره مخمر نیز قبل از اتوکلاو در غلظت­های 50، 100 و 150 میلی­گرم در لیتر به محیط کشت افزوده شد. ریزنمونه­های کالوس بر روی محیط کشت­ها قرار داده شدند و پس از گذشت 20 روز میزان رشد کالوس­ها مورد ارزیابی قرار گرفت.

تجزیه و تحلیل آماری

آزمایش­ها بر پایه طرح کامل تصادفی در سه تکرار انجام شد. تجزیه و تحلیل آماری داده‌های آزمایش‌ توسط نرم افزار SPSS و مقایسه میانگین نیز توسط آزمون دانکن در سطح احتمال 5% انجام شد. نمودارها با نرم‌افزار Microsoft office Excel 2016 رسم شد.

نتایج

تعیین مناسب ترین روش ضدعفونی

نتایج حاصل از تجزیه واریانس (جدول 1) نشان دادند بین تیمارهای ضدعفونی از نظر آلودگی باکتریایی، آلودگی قارچی و زنده‌مانی بذور اختلاف معنی‌داری وجود داشت. علاوه بر این با توجه به نتایج به دست آمده (شکل 1) مشاهده شد که بیشترین درصد زنده‌مانی در تیمار ضدعفونی با هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد (شکل 2) و کمترین درصد زنده‌مانی در تیمار ضدعفونی با هیپوکلریت سدیم 5 درصد مشاهده شد (شکل 3). بیشترین درصد آلودگی مربوط به ضدعفونی با الکل 70% و هیپوکلریت سدیم 5/1% و کمترین درصد آلودگی مربوط به ضدعفونی با الکل 70% و هیپوکلریت سدیم 5% است.

جدول1 - تجزیه واریانس تأثیر تیمارهای مختلف ضدعفونی بر میزان آلودگی و زنده­مانی ریزنمونه برگی

Table 1 - Analysis of variance of the effect of different disinfection treatments on the percentage of contamination and live leaf explants

** معنی‌داری در سطح احتمال 1٪                                                                          

**Significant at 1% probability level

شکل 1- تأثیر روش ضدعفونی بر درصد ریزنمونه­های زنده و غیر آلوده، دارای آلودگی قارچی و دارای آلودگی باکتریایی در پروانش. ضدعفونی اول: ضدعفونی با اتانول 70% و هیپوکلریت سدیم 5/1%، ضدعفونی دوم: ضدعفونی با اتانول 70% و هیپوکلریت سدیم 5/2%، و ضدعفونی سوم: ضدعفونی با اتانول 70% و هیپوکلریت سدیم 5%. حروف مختلف نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال 1 درصد است. میانگین ارائه شده دارای حداقل 3 تکرار است.

Figure 1- Effect of disinfection methods on the percentage of viable and non-infected explants, fungally contaminated and bacterially contaminated in Provansh. First disinfection: disinfection with 70% ethanol and 1.5% sodium hypochlorite, second disinfection: disinfection with 70% ethanol and 2.5% sodium hypochlorite, and third disinfection: disinfection with 70% ethanol and 5% sodium hypochlorite. Different letters indicate significant differences at the 1% probability level. The average presented has at least 3 replicates.

شکل 2- گیاهچه‌های حاصل از بذرهای زنده و غیرآلوده مربوط به تیمار ضدعفونی با هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد.

Figure 2- Seedlings from live, uncontaminated seeds treated with 2.5% sodium hypochlorite.

شکل 3- ریزنمونه‌ها با آلودگی قارچی و باکتریایی.

Figure 3 - Explants with fungal and bacterial contamination.

تعیین محیط کشت مناسب کالوس‌زایی

ریزنمونه‌های برگی پس از انتقال به محیط‌های کالوس‌زایی حاوی غلظت‌های مختلف NAA و BAP و 2,4-D پس از گذشت 8 تا 10 روز شروع به متورم شدن و تولید کالوس کردند (شکل 4). بر اساس نتایج تجزیه واریانس، تیمارهای مختلف از نظر وزن ‌تر کالوس و درصد کالوس‌زایی اختلاف معنی­داری در سطح احتمال یک درصد داشتند ( جدول 2). با توجه به نتایج حاصل از مقایسه میانگین (جدول 3) بیشترین وزن تر کالوس (866/0و 862/0 گرم) در محیط کشت MS حاوی 1 میلی‌گرم در لیتر NAA و 1 میلی‌گرم در لیتر BAP و همچنین محیط کشت MS حاوی 1 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D و 5/0 میلی‌گرم در لیتر BAP مشاهده شد. کمترین وزن کالوس (0378/0) نیز در محیط کشت MS بدون هورمون مشاهده شد و همچنین بیشترین درصد کالوس‌زایی(23/95) در محیط کشت MS  حاوی 1 میلی‌گرم در لیتر NAA و 1 میلی‌گرم در لیتر BAP و نیز محیط کشت MS حاوی 1 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D و 5/1 میلی‌گرم در لیتر BAP مشاهده شد. کمترین درصد کالوس‌زایی (14/57) نیز در محیط کشت MS حاوی 1 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D و 5/0 میلی‌گرم در لیتر BAP مشاهده شد (شکل 5).  

شکل 4- الف) ریزنمونه‌های برگی پس از انتقال به محیط‌ کالوس‌زایی، ب) شروع کالوس­زایی ریزنمونه‌ها پس از گذشت حدود 2 هفته.

Figure 4- A) Leaf explants after transfer to callus medium, B) Start of callus formation of explants after about 2 weeks.

جدول 2- تجزیه واریانس درصد کالوس‌زایی و وزن ‌تر کالوس پروانش تحت تاثیر ترکیبات هورمونی مختلف

Table 2- Analysis of variance of callus formation percentage and fresh weight of callus seedlings under the influence of different hormonal compounds

^** معنی‌دار در سطح احتمال 1%           

**Significant at the 1% probability level

جدول 3- میانگین درصد کالوس‌زایی و وزن‌ تر کالوس در ترکیبات هورمونی مختلف. میانگین ارائه شده دارای حداقل 3 تکرار است.

Table 3- Average callus formation percentage and callus fresh weight in different hormone combinations. The average presented has at least 3 replicates.

 حروف مختلف نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال 1 درصد است.

Different letters indicate significant differences at the 1% probability level.

شکل 5- 1) کالوس‌زایی حاوی تیمار 1 شامل 5/0 میلی‌گرم در لیتر NAA و 5/0 میلی‌گرم بر لیتر BAP 2) تیمار 2 شامل 5/0 میلی‌گرم در لیتر NAA و 1 میلی‌گرم در لیتر BAP، 3) تیمار 3 شامل 1 میلی‌گرم در لیتر NAA و 5/0 میلی‌گرم در لیتر BAP، 4) تیمار 4 شامل 1 میلی‌گرم در لیتر NAA و 1 میلی‌گرم در لیتر BAP، 5) تیمار 5 شامل 3 میلی‌گرم در لیتر NAA و 3 میلی‌گرم در لیتر BAP، 6) تیمار 6 محیط کشت MS بدون هورمون، 7) تیمار 7 شامل 5/1 میلی­گرم در لیتر BAP و 1 میلی­گرم در لیتر 2.4-D، 8)تیمار 8 شامل 1 میلی­گرم در لیتر BAP و 5/0 میلی­گرم در لیتر 2.4-D، 9)تیمار 9 شامل 5/0میلی­گرم در لیتر BAP و 1 میلی­گرم در لیتر 2.4-D

Figure 5- 1) Callus formation containing treatment 1 including 0.5 mg/L NAA and 0.5 mg/L BAP 2) Treatment 2 including 0.5 mg/L NAA and 1 mg/L BAP, 3) Treatment 3 including 1 mg/L NAA and 0.5 mg/L BAP, 4) Treatment 4 including 1 mg/L NAA and 1 mg/L BAP, 5) Treatment 5 including 3 mg/L NAA and 3 mg/L BAP, 6) Treatment 6 MS culture medium without hormones, 7) Treatment 7 including 1.5 mg/L BAP and 1 mg/L 2.4-D, 8) Treatment 8 including 1 mg/L BAP and 0.5 mg/L 2.4-D, 9) Treatment 9 including 0.5 mg/L BAP and 1 mg/L 2.4-D

تأثیر اسید آسکوربیک بر کالوس‌زایی

نتایج حاصل از تجزیه واریانس (جدول 4) نشان دادند غلظت­های مختلف اسیدآسکوربیک اختلاف معنی­داری با هم دارند. ریزنمونه‌های کشت شده در محیط کشت بدون اسید آسکوربیک و محیط کشت دارای 50 میلی‌گرم در لیتر اسید آسکوربیک تقریبا به­طور همزمان شروع به کالوس‌زایی کردند و حدود دو هفته پس از کشت اولین آثار تشکیل کالوس در آن‌ها مشاهده شد. امّا کالوس‌های حاصل پس از چند روز شروع به قهوه‌ای شدن کردند و همچنین دارای اندازه و حجم کمی بودند. ریز نمونه‌های کشت شده در تیمار 100 و 150 میلی‌گرم در لیتر اسید آسکوربیک نیز تقریباً همزمان شروع به کالوس‌زایی کردند و کالوس‌های حاصل دارای اندازه و حجم بزرگ­تری بودند و قهوه‌ای نشدند (شکل 6). بالاترین درصد کالوس‌زایی (190/86) متعلق به تیمار 150 میلی‌گرم در لیتر اسید آسکوربیک و کمترین درصد تشکیل کالوس (439/50) هم در تیمار شاهد مشاهده شد. بالاترین وزن تر کالوس در تیمار 150 میلی‌گرم در لیتر اسید آسکوربیک (0872/0) مشاهده شد که کمترین تغییر رنگ (قهوه‌ای شدن) را داشت. همچنین در تیمار 50 میلی‌گرم در لیتر و شاهد بیشترین میزان قهوه‌ای شدن کالوس‌ها مشاهده شد (جدول 5).

جدول 4- جدول تجزیه واریانس کالوس­زایی در غلظت‌های مختلف اسید آسکوربیک

Table 4 - Analysis of variance of callus formation at different concentrations of ascorbic acid

^** معنی‌داری در سطح احتمال 1%                                                             

**Significant at the 1% probability level

جدول 5- میانگین درصد کالوس‌زایی و وزن ‌تر کالوس در غلظت‌های مختلف اسید آسکوربیک. میانگین ارائه شده دارای حداقل 3 تکرار است.

Table 5- Average callus formation percentage and callus fresh weight at different concentrations of ascorbic acid. The average presented has at least 3 replicates.

 حروف مختلف نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال 1 درصد است.

Different letters indicate significant differences at the 1% probability level.

تأثیر ملاتونین و عصاره مخمر بر کالوس‌زایی

نتایج حاصل از تجزیه واریانس (جدول 6) نشان دادند بین غلظت­های مختلف عصاره مخمر و ملاتونین از نظر کالوس‌زایی و وزن ‌تر کالوس اختلاف معنی‌داری وجود دارد. نتایج حاصل از مقایسه میانگین (جدول 8) نشان داد که بیشترین درصد کالوس‌زایی (100 درصد) مربوط به عصاره مخمر در غلظت‌های مختلف و شاهد است. همچنین بیشترین وزن ‌تر کالوس (633/0 گرم) مربوط به عصاره مخمر با غلظت 150میلی‌گرم در لیتر بود همچنین کمترین درصد کالوس‌زایی(16/66) مربوط به ملاتونین در غلظت 150میلی‌گرم در لیتر و کمترین وزن تر کالوس(038/0) مربوط به ملاتونین در غلظت 150 میلی‌گرم در لیتر است (شکل 7).

شکل 6- ریزنمونه‌های قهوه‌ای شده کالوس شاهد (چپ)، ریزنمونه سالم کالوس غلظت 150 میلی­گرم در لیتر اسید آسکوربیک (راست).

Figure 6- Browned explants of control callus (left), healthy explant of callus with a concentration of 150 mg/L of ascorbic acid (right)

شکل 7- کالوس‌زایی در محیط کشت MS حاوی 1 میلی­گرم در لیتر NAA همراه با 1 میلی­گرم در لیتر BAP، با اعمال تیمار ، غلظت 150 ملاتونین(الف) و مخمر(ب) و شاهد (ج)

Figure 7- Callus formation in MS culture medium containing 1 mg/L NAA with 1 mg/L BAP, with treatment, concentration of 150 melatonin (a) and yeast (b) and control (c)

جدول 6- تجزیه واریانس درصد کالوس‌زایی و وزن ‌تر کالوس پروانش تحت تأثیر غلظت‌های مختلف عصاره مخمر و ملاتونین

Table 6- Analysis of variance of callus formation percentage and fresh weight of callus of Provence under the influence of different concentrations of yeast extract and melatonin

** معنی‌داری در سطح احتمال 1

**Significant at the 1% probability level

شکل 8- میانگین درصد کالوس‌زایی و وزن ‌ترکالوس تحت تأثیر غلظت­های مختلف عصاره مخمر و ملاتونین. میانگین ارائه شده دارای حداقل 3 تکرار است.

Figure 8- Average callus formation percentage and callus weight under the influence of different concentrations of yeast extract and melatonin. The average presented has at least 3 replicates.

بحث

بررسی روش­های ضدعفونی بذر گیاه پروانش نشان دادند بهترین تیمار ضدعفونی با توجه به بیشترین درصد ریزنمونه زنده و کمترین درصد آلودگی باکتریایی و قارچی ریزنمونه بذر با تیمار ضدعفونی هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد است. در ریزنمونه‌های بذر ضدعفونی شده با هیپوکلریت سدیم 5 درصد نسبت به غلظت‌های 5/2 و 5/1 درصد میزان آلودگی کمتر ولی زنده‌مانی پائینی را نشان داد. بررسی مناسب‌ترین محیط کشت با ترکیبات هورمونی مختلف نشان داد که با توجه به بیشترین درصد کالوس‌زایی و بیشترین وزن‌‌تر کالوس بهترین محیط برای کالوس‌زایی ریزنمونه‌های برگ، محیط MS حاوی 1 میلی‌گرم بر لیتر NAA و 1 میلی‌گرم بر لیتر BAP است. البته پژوهش‌های زیادی جهت بررسی محیط مناسب کالوس‌زایی گیاه پروانش صورت گرفته است. در یک پژوهش، (2011) Singh et al. نشان دادند استفاده از 1 میلی‌گرم در لیتر BAP و 1 میلی‌گرم در لیتر NAA در محیط کشت MS سبب ایجاد بالاترین پاسخ القای کالوس (99%) پس از 10 روز در ریزنمونه‌های هیپوکوتیل می‌شود. این نتایج به وضوح نشان‌دهنده اهمیت غلظت‌ها و ترکیب‌های تنظیم‌کننده‌های رشد در القای کالوس و افزایش ریزازدیادی هستند. پژوهش‌های بعدی نشان دادند تغییر غلظت و ترکیب اکسین و سیتوکینین می‌تواند تأثیرات قابل توجهی بر روی وزن خشک و بیوسنتز آلکالوئیدها داشته باشد. (2019) Rahman et al. توسط غلظت‌های 3 میلی‌گرم در لیتر BAP و 3 میلی‌گرم در لیتر NAA به بیشترین وزن خشک در کالوس پروانش دست یافتند. این موضوع نشان‌دهنده این است که تنظیم ترکیب‌ها و غلظت‌ها می‌تواند به بهبود ویژگی‌های رشد گیاه و تولید ترکیبات مفید کمک کند. در پژوهش دیگر، (2010) Kalidass et al. به بررسی اثر ترکیبات مختلف اکسین و سیتوکینین در تولید وین‌کریستین از رشد کالوس پرداختند. نتایج آن‌ها نشان داد ترکیب 1 میکرومولار NAA و 5/0 میکرومولار BAP بیشترین تولید وین‌کریستین را به همراه داشت. این نکته نشان می‌دهد که نه تنها غلظت، بلکه نوع ترکیبات اکسین و سیتوکینین نیز در بهینه‌سازی تولید متابولیت‌های ثانویه مهم است. (2012)Udhaya Arivalagan et al.  نیز تأثیر نوع و غلظت تنظیم‌کننده‌های رشد بر کالوس‌زایی گیاه کاتوک را بررسی کردند و نشان دادند که محیط کشت MS با ترکیب خاصی از NAA و kin سبب کالوس‌زایی بالایی می‌شود. این نتایج به اهمیت محیط کشت و ترکیبات موجود در آن در فرآیند کشت بافت تأکید می‌کند. در نهایت،(2023)  AlQaseer & Al-Rekaby با بررسی پاسخ پروانش به محرک‌های رشد خارجی بیان کردند که در محیط MS با 1 میلی‌گرم از NAA و kin، بهترین رشد رویشی مشاهده شد. این پژوهش‌ها به وضوح نشان دهنده اهمیت تنظیم‌کننده‌های گیاهی در بهبود رشد و تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاه پروانش و کشت بافت به‌طور کلی است.

نتایج حاصل از کالوس‌زایی در غظت‌های مختلف اسید آسکوریک نیز نشان داد که بالاترین درصد کالوس‌زایی، متعلق به تیمار 150 میلی‌گرم در لیتر اسید آسکوربیک و پس از آن تیمار 100 میلی‌گرم در لیتر بود. همچنین کالوس‌های حاصل دارای اندازه و حجم بزرگتری بودند و قهوه‌ای نشدند. به طورکلی اسید آسکوربیک تأثیر مثبت و معناداری بر رشد کالوس‌ها داشت و مقدار 150میلی‌گرم در لیتر آن سبب شد تا کالوس‌هایی با اندازه بزرگتر و بدون تغییر رنگ داشته باشیم. کالوس‌زایی تحت تیمار ملاتونین و عصاره مخمر نیز مورد بررسی قرار گرفت که بیشترین درصد کالوس‌زایی و بیشترین وزن‌تر کالوس در غلظت 150میلی‌گرم بر لیتر عصاره مخمر مشاهده شد. با توجه به نتایج به دست آمده نشان داده شد عصاره مخمر به علت افزایش فعالیت­های هورمون­های گیاهی سبب افزایش کالوس­زایی شده و ملاتونین سبب کاهش کالوس­زایی گیاه می­شود، زیرا هرچه میزان غلظت ملاتونین افزایش پیدا کند عمل بازدارنده بر رشد کالوس­ها دارد.