جداسازی انواع باسیلوس‌ها از خاک پارک جنگلی یاس فاطمی و بررسی خواص پروبیوتیکی آنها

مقدمه

خاک به‌عنوان یکی از مهم‌ترین اکوسیستم‌های میکروبی محل رشد و تکثیر انواع مختلف میکروارگانیسم‌ها ازجمله باکتری‌ها، قارچ‌ها،جلبک‌ها، گلسنگ‌ها و پروتوزوآها است. در بین آنها باکتری‌ها فراوان‌ترین میکروارگانیسم‌های موجود در خاک هستند (1). Bacillus یک باکتری گرم مثبت، میله‌ای شکل، اسپورساز، هوازی یا بی‌هوازی اختیاری است. وجود این باکتری در خاک نشان‌دهندة طیف وسیعی از توانایی‌های فیزیولوژیکی این ارگانیسم برای رشد در هر محیط و رقابت مطلوب با ارگانیسم‌های دیگر موجود در محیط به‌دلیل قابلیت تشکیل اسپورهای بسیار مقاوم است. Bacillusها متابولیت‌هایی را تولید می‌کنند که دارای اثرات آنتاگونیستی بر سایر میکروارگانیسم‌ها هستند. گونه‌های Bacillus تشکیل‌دهندة اسپور به‌دلیل توانایی آنها در تحمل شرایط گوارشی سخت و مزایای سلامتی که به میزبان می‌دهد، به‌عنوان پروبیوتیک به بازار عرضه می‌شوند. پروبیوتیک‌ها مکمل‌های غذایی حاوی میکروارگانیسم‌های زنده‌ای هستند که برای سلامتی میزبان مفیدند. براساس تعریف جدید ارائه‌شده توسط WHO/FAO پروبیوتیک‌ها میکروارگانیسم‌های زنده‌ای هستند که اگر در مقادیر کافی تجویز شوند اثرات مفید سلامتی بر میزبان خواهند داشت.

ویژگی عمومی پروبیوتیک‌ها

 پروبیوتیک‌های ایدئال ویژگی‌های متعددی دارند؛ ازجمله مقاومت نسبت به اسید معده، املاح صفراوی، آنزیم‌های گوارشی و مراحل فرآوری و تولید، قابلیت اتصال به سلول‌های اپیتلیال روده، غیربیماری‌زا و غیرتهاجمی بودن، توانایی حفظ و پایداری ژنتیکی، توانایی مقابله با عوامل بیماری‌زا. همچنین، آنها جزئی از میکروفلوراها هستند، در تنظیم پاسخ‌های ایمنی نقش دارند و قابلیت کلونیزه‌شدن در دستگاه گوارش انسان را دارند .(2,3)

تجزیه و تحلیل تمام سویه‌های پروبیوتیک از Bacillus و Lactobacillus نشان می‌دهد این باکتری‌ها به‌عنوان دارو و مکمل‌های غذایی حیوانات، آبزیان و رژیم غذایی انسان‌ها استفاده می‌شوند. پروتئین‌های اسپورزا در حفظ تمام سویه‌های پروبیوتیک Bacillus ضروری هستند. اعضای Bacillus در شرایط کمبود مواد مغذی و استرس محیطی، اندوسپورهای خفته مقاوم را تشکیل می‌دهند که باعث می‌شود آنها در برابر pH پایین معده، تابش اشعه ماوراءبنفش، دمای بالا و حلال‌ها مقاوم باشند و بدون یخچال نگهداری شوند (4).

معیار ایمنی برای انتخاب پروبیوتیک

ارزیابی ایمنی یک پروبیوتیک با شناسایی صحیح سویه‌ها و شناسایی طبقه‌بندی یک میکروارگانیسم براساس یکپارچه‌سازی خواص فنوتیپی و ژنوتیپی ضروری است. متمایزکردن آن از خویشاوندان بیماری‌زا یا سایر اعضای میکروارگانیسم‌های مضر، شناسایی فنوتیپی باکتری‌های پروبیوتیک با استفاده از میکروبیولوژیک کلاسیک رویکردها برای شناسایی گونه‌ها مهم است؛ اما همیشه قابل اطمینان نیست و گونه‌های خاصی را نمی‌توان تنها با این روش‌ها تشخیص داد. شناسایی گونه‌های باسیلوس در سطح گونه، اغلب باید با استفاده از روش‌های مولکولی شناسایی سطح گونه‌ها تأیید شوند؛ با این حال، توالی (16S rRNA) DNA متکی بر تجزیه و تحلیل توالی 16S rRNA به تنهایی تکنیک کافی برای افتراق را فراهم نمی‌کند (5).

 برتری اسپورفرم‌ها بر فرم‌های رویشی

گونه‌های Bacillus توانایی اسپوراسیون را دارند و اندوسپور بیضی شکل در هر سلول تشکیل می‌دهند. آنها برای زنده‌ماندن در فشارهای محیطی و شرایط سخت رشد، نگهداری، ذخیره و توزیع سازندهای اسپور تحمل و ماندگاری زیادی در دمای شدید،  pHپایین، مایعات صفراوی، نمک، کم‌آبی بدن یا تغذیه نامناسب از خود نشان می‌دهند. باوجود هوازی یا بی‌هوازی اختیاری، این باکتری هنوز می‌تواند در شرایط هوازی تشکیل اسپور دهد (6).

اسپوراسیون Bacillus علاوه بر اینکه می‌تواند با تمام‌شدن مواد مغذی القا شود، با قراردادن سلول‌ها در بعضی شرایط نامساعد محیطی دیگر ازجمله افراطی‌بودن pH و دما نیز القا می‌شود. وجود اسپورها این اجازه را به آنها می‌دهد که در حرارت پایدار، ذخیره‌سازی طولانی‌مدت انجام شود و آماده‌سازی بدون نیاز به نگه‌داشتن در یخچال یا نیاز به کپسول‌سازی فراهم شود (7).

 Bacillus کاندید مناسب برای پروبیوتیک

اسپورهای Bacillus از طریق تعدیل سیسیتم ایمنی، حذف رقابتی از عوامل بیماری‌زای دستگاه گوارش و ترشح ترکیبات ضدمیکروبی که رشد باکتری‌های مضر را سرکوب می‌کنند، اثر پروبیوتیکی دارند. تعدادی از گونه‌های Bacillus به‌عنوان پروبیوتیک مؤثر و مفید شناخته شده‌اند؛ اما برخی از گونه‌های آن دارای ژن‌های ویرولانسی هستند که عامل اصلی بیماری‌اند؛ بنابراین، باید قبل از استفاده به‌عنوان پروبیوتیک ازنظر ایمنی بررسی شوند .(8,9)

 سویه‌های خاص Bacillus با خواص پروبیوتیک

جنس Bacillus شامل اعضای گرم مثبت اسپورساز هوازی یا هوازی اختیاری است. سویه‌های با خواص پروبیوتیک ادعاشده شامل Bacillus subtilis، Bacillus coagulans و Bacillus cereus هستند (10).

 مواد و روش‌ها

نمونه‌برداری از خاک

نمونه‌برداری از 6 نقطه با عرض جغرافیایی مختلف که در تماس مستقیم آفتاب نبود، با قاشق استریل از عمق 3 تا 8 سانتی‌متری خاک در دمای 30 درجه سانتی‌گراد در فصل بهار انجام شد. نمونه‌های خاک به داخل زیپ کیپ‌های استریل از قبل تهیه‌شده، منتقل و با رعایت موارد نمونه‌برداری میکروبی به آزمایشگاه منتقل شدند. ویژگی نقاط نمونه‌برداری‌شده نیز یادداشت شد که در جدول 1 آورده شده‌اند.

جدول 1: برخی پارامترهای نمونه‌های خاک و ویژگی نقاط نمونه‌برداری‌شده

Table 1: Selected Soil Sample Parameters and Characteristics of Sampling Point

کشت و جداسازی باسیلوس‌ها

نمونه‌ها پس از انتقال توسط الک استریلی به قطر 2 میلی‌متر الک شدند. 1 گرم از خاک الک‌شده به داخل لوله‌های آزمایش، ریخته و به آن 9 میلی‌لیتر آب مقطر استریل اضافه شد. سپس نمونه‌های سوسپانسیون خاک در بن‌ماری با درجه حرارت 80 سانتی‌گراد به مدت 20 دقیقه قرار داده شدند. با این روش تنها باکتری‌های اسپوردار خاک باقی ماندند. سپس 9 رقت پشت سر هم، تهیه و 1 میلی‌لیتر از رقت آخر بیرون ریخته شد. هر رقت در پلیت نوترینت آگار به روش پورپلیت کشت داده شد و پلیت‌ها به‌منظور ترکیب سوسپانسیون میکروبی با محیط کشت به‌طور چرخشی در جهت و خلاف جهت عقربه‌های ساعت روی میز چرخانیده و سپس در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 48 ساعت در شرایط هوازی انکوبه شدند.

 سپس کلنی‌ها ازلحاظ ماکروسکوپی بررسی شدند. کلنی باسیلوس‌ها معمولاً خشن، خشک، مضرس و شیری است؛ حتی اگر موکوئیدی باشد، در کشت‌های کهنه به‌صورت مضرس است. نمونه‌ها با اشکال متفاوت، جدا و برای مرحله رنگ‌آمیزی آماده شدند. گفتنی است تمامی کارهای این تحقیق با وسایل استریل و کنار شعله انجام گرفته‌اند.

 آزمایشات مورفولوژی و بیوشیمیایی

تست کاتالاز

آزمون به‌منظور شناسایی میکروارگانیسم‌هایی استفاده می‌شود که دارای آنزیم‌های کاتالاز هستند و قادرند با استفاده از آن پراکسید هیدروژن را تجزیه کنند. آزمایش کاتالاز برای تشخیص دو گروه از باکتری‌های گرم مثبت اسپوردار، یعنی باسیلوس‌ها و کلستریدیوم‌ها به کار می‌رود. به‌منظور انجام آزمایش، روی یک لام یک قطره از سوسپانسیون باکتری مدنظر قرار داده و سپس یک قطره از محلول 3 درصد پراکسید هیدروژن روی لام اضافه شد. در صورت مثبت‌بودن آزمایش، حباب‌های گاز اکسیژن بلافاصله مشاهده می‌شود.

 فعالیت همولیتیک

تست همولیتیک سویه‌های باکتریایی به‌صورت کشت خطی (زیگزاک) روی محیط بلادآگار (محیط پایه حاوی 5 درصد خون گوسفندی دفیبرینه) انجام شد و بعد به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. سویه‌های غیرهمولیتیک برای تجزیه و تحلیل بیشتر خاصیت پروبیوتیکی انتخاب شدند.

 تست تخمیر قندها

برای آزمون تخمیر کربوهیدرات‌ها، اغلب از معرف فنل رد استفاده می‌شود. برای این منظور به محیط پایه ذکرشده هربار یک قند به میزان 5/0 درصد اضافه شد؛ البته محیط پایه به‌صورت جداگانه در دمای 121 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه اتوکلاو شد و بعد از خنک‌شدن، هر یک از قندها با فیلتر سرنگی برای استریل‌شدن به محیط اضافه شدند. سپس محیط‌ها در لوله‌های آزمایش توزیع شدند و باکتری در آنها کشت داده شد و پس از کشت باکتری در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 48-24 ساعت انکوبه شدند؛ درنهایت، اگر باکتری قادر به تخمیر سوبسترای محیط کربوهیدراتی باشد، با تولید اسید pH را کاهش می‌دهد و معرف فنول رد در pH اسیدی از قرمز روشن یا گلبهی به زرد تغییر رنگ می‌دهد که این امر نشان‌دهندة مثبت‌بودن واکنش است.

 آزمون اندول و حرکت

هدف از این آزمون، بررسی توانایی باکتری‌ها در تجزیه اسیدآمینه تریپتوفان توسط آنزیم تریپتوفاناز و بررسی وضعیت حرکت باکتری است. در این آزمون از محیط نیمه‌جامد (سولفور.ایندول.موتیلیتی) استفاده شده است. باکتری به‌صورت کشت عمقی در محیط، تلقیح و بعد از گرماگذاری برای بررسی نتیجه، روی محیط کشت معرف کواکس اضافه شد. در صورت مثبت‌بودن تست اندول حلقة قرمز رنگی روی محیط ایجاد می‌شود. برای بررسی حرکت، اگر محیط کدر شده باشد یا در راستای تلقیح کدورت دیده شود، تست حرکت نیز مثبت است.

 آزمون هیدرولیز ژلاتین

این آزمون به‌منظور بررسی توانایی عده‌ای از میکروارگانیسم‌ها در هیدرولیز یا ذوب ژلاتین استفاده می‌شود. برای بررسی هیدرولیز ژلاتین از محیط نوترینت براث استفاده می‌شود که حاوی 12 درصد پودر ژلاتین است. باکتری به روش کشت عمودی در محیط، تلقیح و به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. سپس در یخچال با دمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 20 دقیقه قرار داده شد تا افتراق ژلاتینی که توسط دمای محیط ذوب شده است با ژلاتینی که توسط باکتری بعد از هیدرولیز تبدیل به مایع می‌شود، مشخص شود. بعد از این مدت کشت‌هایی که به حالت مایع باقی بمانند، دارای آنزیم ژلاتیناز هستند و نتیجه آزمون به‌علت هیدرولیز سریع ژلاتین، ژلاتیناز مثبت قوی گزارش می‌شود. کشت‌هایی که به حالت جامد باقی مانده‌اند، دوباره به مدت 5 روز انکوبه شدند و نتیجه آنها مجدداً بررسی می‌شود.

آزمون سیترات

این آزمون به‌منظور شناسایی میکروارگانیسم‌هایی به کار می‌رود که از سیترات به‌عنوان تنها منبع کربن استفاده می‌کنند. برای انجام این آزمون از محیط افتراقی سیمون سیترات آگار استفاده می‌شود. این محیط شامل سیترات سدیم به‌عنوان تنها منبع کربن محیط، املاح آمونیوم به‌عنوان منبع ازت و معرف بروموتیمول بلو (BTB) است. این معرف در pH خنثی به رنگ سبز و در  pH قلیایی به رنگ آبی دیده می‌شود. بعد از تهیه محیط و استرلیزاسیون، لوله‌های حاوی محیط به‌صورت مورب قرار داده شدند تا محیط سفت شود و سپس باکتری به‌صورت عمقی و در ادامه روی سطح مورب کشت داده شد. سپس محیط به مدت 48-24 در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شده است. اگر باکتری قادر به استفاده از محیط باشد، رنگ محیط به‌دلیل قلیایی‌شدن از رنگ سبز به رنگ آبی تغییر پیدا می‌کند.

 آزمون لیستیناز

برای تعیین لیستیناز، سویه‌ها روی محیط پایه نوترینت آگار حاوی تخم‌مرغ کشت داده شده‌اند. بدین منظور ابتدا تخم‌مرغ با آب گرم و صابون و سپس با الکل 70 درصد شسته شده است. تخم‌مرغ شکسته شد و زردة آن با 10 میلی‌لیتر آب مقطر استریل، مخلوط و بلافاصله به ارلن حاوی محیط نوترینت آگار منتقل شد که از قبل اتوکلاو شده و خنک است. سپس زرده هم زده شد و به مدت 48-24 ساعت در 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شده است. در صورت مثبت‌بودن تست، هاله‌ای اطراف کلونی‌های باکتری دیده می‌شود.

 نگهداری سویه‌ها

برای نگهداری سویه‌ها ذخیره‌سازی کوتاه‌مدت، به دو روش پاساژهای متوالی و کشت روی آگار شیب‌دار انجام شده است.

 شناسایی سویه برتر با استفاده از روش‌های مولکولی

پس از جمع‌آوری نمونه‌های باکتری مطالعه‌شده و غربالگری‌های مدنظر و همچنین پس از بررسی‌های بیوشیمیایی، برای شناسایی دقیق باکتری مجهول، روش مولکولی واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز یا PCR انجام شده است. به‌منظور شناسایی مولکولی باکتری مجهول در ابتدا DNA باکتری با استفاده از کیت استخراج شده است.

 استخراجDNA

استخراج DNA با استفاده از کیت خریداری‌شده از شرکت سیناکلون Catalog Number: EX6071 به روش ذیل انجام شده است:

1- کشت باکتری در محیط  LB broth(معادلml  1/5_*10⁸ Cfu/) به مدت 24 ساعت

2- اضافه‌کردن 400 میکرولیترLysis buffer  و ورتکس با بیشترین سرعت به مدت 20 ثانیه

3- اضافه‌کردن 300 میکرولیتر محلول precipitation و ورتکس با بیشترین سرعت به مدت 5 ثانیه

4- انتقال محلول به ستون و جمع‌آوری به‌وسیله پیپت

5- سانتریفیوژ تیوپ با دور  g-force13000 به مدت 1 دقیقه

6- انتقال به تیوپ جمع‌آوری جدید و اضافه‌کردن 400 میکرولیتر wash bufferⅠو سانتریفیوژ با دور g-force 13000 به مدت 1 دقیقه

7- شست‌وشوی ستون با 400 میکرولیتر wash buffer Ⅱ و سانتریفیوژ با دور g-force 13000 به مدت 1 دقیقه

8- شست‌وشوی ستون با 400 میکرولیتر  wash buffer Ⅱو سانتریفیوژ با دور g-force 13000 به مدت 1 دقیقه

9- قراردادن ستون در تیوب جمع‌آوری و سانتریفیوژ با دور g-force 13000 به مدت 1 دقیقه

10- اطمینان از انتقال ستون به تیوب 5/1 میلی‌لیتر جدید و اضافه‌کردن 30 میکرولیتر elution buffer گرم‌شده تا دمای 65 درجه سانتی‌گراد، انکوبه‌کردن به مدت 5-3 دقیقه در 65 درجه سانتی‌گراد و سانتریفیوژ با دور  g-force 13000 به مدت 1 دقیقه.

الکتروفورز نمونه‌های DNA

به‌منظور تأیید نمونه‌های DNA استخراج‌شده از ژل آگارز 1 درصد الکتروفورز استفاده شد. برای تهیه ژل از 25/0 پودر آگارز و 25 میلی‌لیتر بافر TBE استفاده شده است.

 واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)

به‌منظور تکثیر قطعه ژنی در ناحیه 16S rRNA سویه‌های برتر، با استفاده از دو پرایمر 27F و 1429R، DNA استخراج‌شده از باکتری به‌عنوان DNA الگو در دستگاه ترموسایکلر قرار گرفت. تکنیک PCR در 30 دور و با برنامه ذکرشده در جدول 2 انجام شده است. گفتنی است ترکیبات مخلوط واکنش برای  PCRدر جدول 3 در ضمیمه آمده‌اند.

جدول 2: برنامه PCR

Table 2: PCR Program

جدول 3: ترکیب مخلوط واکنش برای PCR

Table 3: Reaction Mixture Composition for PCR

به‌منظور تأیید  PCRانجام‌شده، الکتروفورز روی ژل آگارز 1 درصد الکتروفورز شد. شایان ذکر است ازآنجایی‌که پرایمرهای طراحی‌شده جزء پرایمرهای شناخته‌شده گزارش شده است، طول محصول این پرایمرها حدود 1487 جفت‌باز است؛ یعنی بازه‌ای که می‌توان به آن استناد کرد بین 1400 تا 1500 جفت‌باز است (11). به همین دلیل، در این پژوهش از DNA Marker 1500 bp استفاده شد. سپس به‌منظور شناسایی و تعیین توالی به آزمایشگاه ژنیران فرستاده شد.

 ترسیم درخت فیلوژنتیکی

پس از تحلیل توالی سویه مدنظر درخت فیلوژنتیک رسم شد. در این پژوهش رسم درخت فیلوژنتیک با استفاده از نرم‌افزار مگا 7 با روش پیوند همجواری  (Neighboor_Joining)انجام شد. به این صورت که هم‌ردیفی توالی ژن 16S rRNA نمونه‌ها به همراه تعدادی از گونه‌های جنس باسیلوس به روش ClastalW در برنامه مگا 7 انجام گرفت و سپس ارتباط تبارشناسی سویه‌ها با روش همجواری مشخص شد. اساس این روش حداقل‌کردن طول درخت است. فواصل فیلوژنتیکی با استفاده از روش حداکثر درست‌نمایی مرکب (Maximum composite likelihood method) محاسبه شدند و براساس واحدهای تعداد جایگزینی بازها در هر مکان بیان می‌شوند. شایان ذکر است ارزش بوت استریپ از 1000 تکرار در بالای شاخه‌ها نشان داده شده است و شاخه‌های بالای 50 درصد قابل استناد محسوب می‌شوند.

 بررسی خواص پروبیوتیکی

مقاومت به pH اسیدی تا قلیایی

به‌منظور بررسی مقاومت باکتری‌ها به اسید، از محیط نوترینت براث استریل استفاده شد که به کمک اسید کلریدریک  (HCL) 5 درصد نرمال و سود ( (NAOH5 درصد نرمال، pH در حد 2، 3، 4، 5، 6، 7، 8 و 9 تنظیم شد.

 100 میکرولیتر از باکتری‌های تازه کشت‌شده به این محیط، انتقال و در انکوباتور در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. توانایی رشد باکتری‌های مطالعه‌شده در ابتدا با مشاهده تغییرات کدورت، بررسی و نتایج به شکل مثبت یا منفی درج شد. سپس رشد سویه منتخب در زمان‌های 0، 4، 6، 8، 24، 48 و 72 ساعت در طول موج 600 نانومتر به‌وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد.

آنتی‌بیوگرام

به‌منظور بررسی حساسیت نمونه‌های باکتری به آنتی‌بیوتیک تست آنتی‌بیوگرام انجام شد. در ابتدا یک لوپ از باکتری مدنظر در لوله استریل حاوی 3-2 میلی‌لیتر آب مقطر یا سرم فیزیولوژی حل شد. با کمک سواپ استریل از سوسپانسیون تهیه‌شده نمونه برداشته و آب اضافی خارج شد. سوآپ آغشته به باکتری مدنظر روی محیط مولرهینتون آگار استریل در جهات مختلف به‌صورت متراکم کشت داده شد و با استفاده از پنس استریل دیسک‌ها با فاصله 24-20 میلی‌متر از یکدیگر و از لبه پلیت 5/1-1 سانتی‌متر روی محیط قرار داده شدند. سپس پلیت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 24-18 ساعت انکوبه شد. قطر هاله عدم رشد با خط‌کش یا کولیس، اندازه‌گیری و با جدول شرکت سازنده دیسک مقایسه شد. جواب‌ها ‌به صورت حساس (Sensetive)، نیمه‌حساس (Intermediate) و مقاوم (Resistant) گزارش می‌شوند. مقاومت آنتی‌بیوتیکی با استفاده از روش انتشار دیسک به محیط آگار انجام گرفت.

 بررسی مقاومت به گرما

با توجه به اینکه اسپور باسیلوس دمای 100 درجه سانتی‌گراد را 20 دقیقه یا حتی بیشتر می‌تواند تحمل کند، نمونه اولیه با غلظت نیم مک فارلند از هر نمونه در سرم فیزیولوژی، تهیه و به مدت 20 دقیقه در بن‌ماری 100 درجه (نقطه جوش) قرار داده شد. سپس از هر یک از لوله‌ها به‌صورت سریالی پورپلیت در محیط‌های نوترینت آگار، تهیه و به مدت 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. در دمای 101 درجه سانتی‌گراد، اسپورهای حساس به حرارت باسیلوس می‌توانند به فرم مقاوم تبدیل شوند.

 مقاومت به نمک سدیم کلرید

سویه‌ها در محیط نوترینت براث حاوی رقت‌های 2، 4، 6، 8 و 10 درصد از نمک سدیم کلرید کشت داده شدند. سپس لوله‌ها به مدت 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. جذب نوری باکتری‌ها در زمان‌های 0، 2، 4، 6، 8، 24، 48 و 72 ساعت اندازه‌گیری شد.

 بررسی مقاومت به نمک صفراوی

100 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتریایی تازه معادل نیم مک فارلند برداشت شد. این باکتری‌ها در شرایط استریل به محیط‌های نوترینت براث حاوی 3/0 درصد نمک صفراوی استریل و محیط کشت فاقد بایل (به‌عنوان بلانک) اضافه شدند. جذب نوری (OD) محیط‌ها قبل از گرمخانه‌گذاری در طول موج 600 نانومتر اندازه‌گیری شد. سپس رشد باکتری در زمان‌های 0، 2، 4، 6، 8، 24، 48 و 72 ساعت به‌وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 600 نانومتر بررسی شد. سپس ضریب بازدارندگی نمونه‌ها با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد.

Cinh=

ضریب بازدارندگی رشد Co-efficient of inhibition :Cinh

جذب نوری در محیط کشت بدون بایل ،پس از 8 ساعت گرمخانه گذاری T8 Control:

جذب نوری در محیط کشت بدون بایل، قبل از گرمخانه‌گذاری T0 Control:

جذب نوری در محیط کشت حاوی بایل، پس از 8 ساعت گرمخانه‌گذاری T8 Treatment:

جذب نوری در محیط کشت حاوی بایل، قبل از گرمخانه‌گذاری T0 Treatment:

اگر ضریب بازدارندگی کمتر از 5/0 باشد، باکتری پروبیوتیک ازنظر تحمل نمک صفرا قابل قبول است.

 فعالیت ضدمیکروبی

ابتدا از باکتری‌های پاتوژن (اشرشیا کولی، سالمونلا، استافیلوکوکوس اورئوس) سوسپانسیون نیم مک فارلند تهیه شد. سپس توسط سوآپ استریل از سوسپانسیون میکروبی، برداشت و روی محیط مولرهینتون آگار به‌صورت چمنی کشت داده شد. سپس حفره‌ای در مرکز هر پلیت توسط پیپت پاستور استریل، ایجاد و از سوسپانسیون باکتری مدنظر با سمپلر به میزان 10 میکرولیتر درون حفرات ایجادشده اضافه شد.

 نتایج

رنگ‌آمیزی گرم و تست کاتالاز

 برای شناسایی باکتری‌ها، تست‌های شناسایی براساس روش برجی انجام گرفت. کلونی‌های خالص به‌دست‌آمده در هر پلیت برای آزمون‌های رنگ‌آمیزی، تست کاتالاز و مورفولوژی در زیر میکروسکوپ قرار گرفتند (شکل 1).

 نتایج تست تخمیر قند

به‌منظور بررسی تولید گاز در محیط قندی گلوکز از لوله درهام استفاده شد. هرگونه تغییر رنگ از قرمز به زرد در محیط فنول رد حاوی منابع قندی نشان‌دهندة توانایی تخمیر قند مدنظر توسط باکتری است. در این آزمایش رنگ قرمز منفی و رنگ زرد و نارنجی پررنگ به‌صورت مثبت گزارش شده‌اند. با توجه به شکل 2، از بین 15 سویه جداشده، همه سویه‌ها توانایی تخمیر گلوکز را داشتند و 80 درصد سویه‌ها توانایی تخمیر مانیتول و آرابینوز و 4 سویه توانایی تخمیر قند گزایلوز را داشتند.

 شکل 1:  نمایی از اشکال باسیلی بنفش رنگ (گرم مثبت) زیر میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 100^*

Figure 1: View of Purple Bacillus Shapes (Gram-Positive) Under Light Microscope at 100x Magnification

 شکل 2: نتایج تست هیدرولیز قندها از چپ به راست گلوکز، مانیتول، آرابینوز، گزایلوز (تغییر رنگ لوله از رنگ قرمز نشان‌دهندة مثبت‌بودن تست است).

Figure 2: Results of Sugar Hydrolysis Test (From Left to Right: Glucose, Mannitol, Arabinose, Xylose). A Color Change from Red Indicates a Positive Test.

نتایج آزمون تولید اندول و حرکت

در محیط SIM سویه‌ها ازنظر ایجاد اندول و حرکت بررسی شدند (شکل 3). سویه‌های پروبیوتیکی بهتر است اندول مثبت باشند. کدورت در مسیر آنس در محیط کشت نشان‌دهندة حرکت مثبت باکتری است.

نتایج آزمون هیدرولیز ژلاتین

توانایی تولید آنزیم ژلاتیناز نیز در سویه‌های باکتریایی به‌عنوان شاخص دیگری از ارزیابی ایمنی بررسی شده است. این آنزیم می‌تواند ژلاتین و ترکیباتی مانند کلاژن، کازئین و ... را حذف کند. بررسی‌ها نشان می‌دهند در باکتری‌های بررسی‌شده ژن مرتبط با آنزیم ژلاتیناز تنها در 3 سویه وجود نداشتند. نتیجه تست ژلاتیناز اکثر سویه‌ها ژلاتین مثبت بوده است.

شکل 3: تست‌های افتراقی باکتری باسیلوس از چپ به راست عبارت‌اند از لیستیناز، سیترات، ژلاتیناز، حرکت، کاتالاز

Figure 3: Differential Tests for Bacillus Bacteria (From Left to Right: Lecithinase, Citrate, Gelatinase, Motility, Catalase).

 نتایج آزمون لیستیناز

در این آزمون سویه‌های دارای آنزیم لیستیناز می‌توانند در محیط ایجاد هاله کدر یا رسوبی کنند. علت ایجاد هاله در اطراف کلونی رهاشدن چربی‌های آزاد از امولوسیون زردة تخم‌مرغ، پس از شکسته‌شدن لیستین (لیستین در امولوسیون زردة تخم‌مرغ نقش پایدارکننده را به عهده دارد) و پروتئین‌های نامحلول زردة تخم‌مرغ است که بر اثر آزادشدن چربی‌ها رسوب می‌کند. تمامی سویه‌ها لیستیناز مثبت گزارش شدند که در شکل 3 آمده‌اند.

 نتایج آزمون‌های بیوشیمیایی و تست‌های تأییدی

با توجه به نتایج حاصل از آزمون‌های تست کاتالاز و سایر تست‌های تأییدی شامل تست سیترات، تست حرکت، تست تخمیر قندها، آزمون‌های هیدرولیز ژلاتین و لیستیناز، سویه مدنظر به‌صورت تخمینی به‌عنوان جنس باسیلوس مشخص شد. نتایج تست‌های بیوشیمیایی 15 سویه جداشده از خاک در جدول 4 آمده‌اند.

جدول 4: نتایج تست‌های بیوشیمیایی

Table 4: Results of Biochemical Tests

                                                                                   C2c    Marker

  شکل 4: الکتروفورز نمونه‌های PCR

Figure 4: Electrophoresis of PCR Samples

شکل 5: مشاهده هم‌ترازی توالی سویه C2c با استفاده از برنامه بیوانفورماتیکی BLAST در NCBI

Figure 5: Alignment of C2c Strain Sequence Using the Bioinformatics Program BLAST at NCBI

 شناسایی سویه‌های باسیلوس براساس روش‌های مولکولی

نتایج شناسایی مولکولی سویه برتر

برای تأیید شناسایی بیوشیمیایی، شناسایی مولکولی و توالی‌یابی 16S rRNA انجام شد.

1. استخراج DNA: استخراج DNA از سویه جداشده با استفاده از کیت خریداری‌شده از شرکت سیناکلونCatalog Number: EX6071 انجام شد. از آنجایی که در این پژوهش کیفیت و خلوص DNA برای ما بسیار اهمیت داشت، از کیت تجاری به‌جای روش جوشاندن استفاده شد (12).
2. تکثیر ژن 16S rRNA: با استفاده از پرایمرهای27F(5'-AGAGTTTGGATCMTGGCTCAG-3') و 1429R(5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3')، ژن 16S rRNA تکثیر شد. نتایج حاصل از نوارباندی تکثیریافته در شکل 4 آورده شده‌اند.
3. 3. توالی‌یابی: نتایج توالی‌یابی، نشان‌دهندة تشابه 100 درصد باکتری جداشده با Bacillus subtilis است و با توجه به نتایج حاصل از توالی‌یابی، سویه ما به‌طور دقیق با نام Bacillus subtilis CFR08 معرفی شد (شکل 5).

 رسم درخت فیلوژنتیکی

تجزیه و تحلیل توالی 16S rRNA سویه C2c به‌منظور تعیین موقعیت فیلوژنی این باکتری در میان سایر باکتری‌ها در شکل 6 نشان داد این سویه بیشترین قرابت ژنتیکی را با Bacillus subtilis CFR08  دارد. مقادیر Bootstrap بالا در محل انشعاب شاخه‌های درخت نشان می‌دهد درخت تبارزایی مدنظر درجه اعتماد بالایی دارد.

شکل 6: تجزیه و تحلیل توالی 16S rRNAجدایه  C2cبه‌منظور تعیین موقعیت فیلوژنی این باکتری در میان سایرباکتری‌ها در درخت فیلوژنتیکی سویه  C2cبا استفاده از نرم‌افزار Mega7

Figure 6: Analysis of 16S rRNA Sequence of C2c Isolate to Determine Phylogenetic Position of This Bacterium Among Other Bacteria in the Phylogenetic Tree of C2c Strain Using Mega7 Software

 نتایج آزمون‌های پروبیوتیک

ارزیابی بقای سویه‌ها در محیط اسیدی و قلیایی

کدورت حاصل از رشد سویه‌ها در pHهای 3، 4، 5، 6، 7، 8 و 9 بعد از 24 ساعت قابل مشاهده بود. در 2 pH هیچ کدورتی در محیط مشاهده نشد. گفتنی است توانایی رشد سویه‌های مطالعه‌شده در محیط بالا با مشاهده تغییرات کدورت و در زمان‌های مختلف بررسی شد و نتایج در جدول 5 به شکل مثبت و منفی درج شدند.

با توجه به مشاهده کدورت حاصل از رشد از بین 15 جدایه 11 سویه رشد در pHهای مختلف را داشتند و 4 سویه به‌دلیل نداشتن توانایی رشد در شرایط اسیدی حذف شدند. منحنی رشد سویه برتر در زمان‌های مختلف توسط دستگاه اسپکتروفتومتر ترسیم شد. طبق نتایج به‌دست‌آمده، سویه C2c بهترین رشد را در 4 pH در زمان‌های مختلف نشان داد و در 3 pH رشد باکتری به‌کندی صورت گرفت. طبق نتایج حاصل از نمودار 3-1 به نظر می‌رسد سویه مدنظر توانایی رشد در شرایط اسیدی را در زمان‌های مختلف دارد (جدول 6 و نمودار 1).

نمودار 1: تحمل به pH اسیدی سویه C2c

Figure 1: Acidic pH Tolerance of C2c Strain

جدول 5: رشد جدایه‌ها در شرایط اسیدی

Table 5: Growth of isolates in acidic conditions

جدول 6: نتایج  اسپکتروفتومتری سویه C2c در pH اسیدی

Table 6: Spectrophotometry Results of C2c Strain at Acidic pH

جدول 7 : نتایج حاصل از آنتی‌بیوگرام  

Table 7: Results of Antibiogram

نتایج آنتی‌بیوگرام

تمام 11 سویه حساسیت خود را به آنتی‌بیوتیک‌های ذکرشده به‌صورت هاله‌ای اطراف دیسک به نمایش گذاشتند (شکل 7). شایان ذکر است تمام باکتری‌ها به‌جز سویه C2c در برابر آنتی‌بیوتیک سفتازیدیم مقاوم بودند؛ به‌طوری‌که هاله‌ای در اطراف دیسک آنتی‌بیوتیکی مشاهده نشد. نتایج حاصل از آنتی‌بیوگرام در جدول 7 آمده‌اند.

شکل 7: نتایج تست آنتی‌بیوگرام

Figure 7: Results of Antibiogram Test

 توانایی رشد باسیلوس‌ها در دما و غلظت‌های مختلف نمک سدیم کلراید

سویه‌های آزمایش‌شده توانست دمای 100 درجه سانتی‌گراد را به مدت 20 دقیقه تحمل کند و تعداد باکتری‌های زنده پس از پورپلیت برابر یا بیشتر از 10⁵ تخمین زده شد.

در ادامه رشد 11 سویه‌ منتخبی که مقاومت و بقای قابل قبولی در شرایط اسیدی داشتند، در غلظت‌های نمک سدیم کلرید ارزیابی شدند. در بین 11 سویه رشد قابل قبولی در غلظت‌های ذکرشده از نمک سدیم کلرید مشاهده شد؛ به‌طوری‌که در غلظت 2 درصد، کدورت حاصل از رشد بسیار زیاد بود. رشد تعدادی از باکتری‌ها در غلظت 8 درصد کاهش یافت؛ اما سویه C2c در تمام غلظت‌های نمک سدیم کلرید رشد چشمگیری داشت. بدین منظور رشد سویه C2c در زمان‌های مختلف توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد و نتایج در جدول 8 ثبت شدند.

نتایج فعالیت همولیتیک

مشاهده یک منطقه سبز اطراف کلنی را هیدرولیز جزئی (آلفا همولیز) و هیدرولیز کامل توسط یک منطقه شفاف را بتا همولیز می‌گویند و در صورت نبود واکنش اطراف کلنی گاما همولیز گزارش می‌شود (شکل 8). سویه‌های باسیلوس با خواص پروبیوتیکی همولیز منفی بودند. از بین 11 سویه مطالعه‌شده، 3 سویه α همولیتیک و 4 سویه β همولیتیک بودند؛ درنهایت، 4 سویه خالص همولیز منفی (ɣ همولیتیک) باقی ماندند که مطالعات روی آنها صورت گرفت.

جدول 8: نتایج اسپکتروفتومتری سویه C2c در غلظت‌های مختلف نمک سدیم کلرید

Table 8: Spectrophotometry Results of C2c Strain at Different Concentrations of Sodium Chloride

شکل 8: نتایج تست فعالیت همولیتیک

Figure 8: Results of Hemolytic Activity Test

 نتایج تست مقاومت به نمک صفراوی

طبق پروتکل شماره 19459 استاندارد ملی ایران، برای تعیین میزان مقاومت به صفرا در باکتری‌ها معمولاً از غلظت‌های نزدیک به شرایط بدن انسان (غلظت 3/0) استفاده می‌شود. 4 سویه قادر به رشد در 3/0 درصد نمک صفرا در زمان‌های 0، 5، 10، 20 و 24 ساعت بودند. پس از گذشت  5 ساعت تنها 2 سویه بیشترین میزان رشد را در غلظت 3/0 درصد نمک صفرا از خود نشان دادند. نتایج مربوط به رشد باکتری در حضور 3/0 درصد نمک صفراوی در جدول 9 نشان دادند از بین 4 سویه، C2c توانایی رشد بیشتری در حضور این نمک دارد (نمودار 2).

 نتایج فعالیت ضدمیکروبی

در بررسی فعالیت ضدمیکروبی مشخص شد سویه C2c علیه پاتوژن‌های سالمونلا و اشرشیا کلی و استاف اورئوس، اثر ضدمیکروبی بهتری از خود نشان داده و هاله‌های شفافی در اطراف چاهک‌ها ایجاد کرده است.

جدول 9: نتایج اسپکتروفتومتری سویه C2c در غلظت 3/0 درصد نمک صفراوی

Table 9: Spectrophotometry Results of C2c Strain at 0.3% Bile Salt Concentration

نمودار 2: منحنی رشد سویه C2c را در محیط حاوی اکس گال (نمک صفراوی) در زمان‌های متفاوت نشان می‌دهد. همان‌طور که مشاهده می‌شود سویه C2c محیط حاوی نمک صفراوی را در زمان‌های مختلف تحمل کرده و در شرایط صفراوی رشد قابل  قبولی داشته است.

Figure 2: The growth curve of strain C2c in a medium containing X-gal (bile salt) at different time points is shown. As observed, strain C2c tolerated the bile salt-containing medium over various time intervals and exhibited acceptable growth under bile conditions.

بحث و نتیجه‌گیری

با توجه به کاربردهای محصولات پروبیوتیک در پیشگیری و درمان بیماری‌ها، پروبیوتیک‌های مبتنی بر خاک به‌دلیل استحکام، ماندگاری طولانی و توانایی بهبود هضم، تحریک سیستم ایمنی و کمک به حفظ میکروبیوتای روده سالم درخور توجه قرار گرفته‌اند. (SBO)Soil-based organism ارگانیسم مبتنی بر خاک بیش از 100 گونه مختلف از میکروب‌ها را شامل می‌شود که به‌طور طبیعی در خاک یافت می‌شوند. بیشتر SBOهای استفاده‌شده در پروبیوتیک‌های مبتنی بر خاک اسپورساز هستند. SBOها در برابر گرما و اسید مقاوم هستند. همچنین، احتمال بیشتری برای زنده ماندن در دستگاه گوارش فوقانی و رسیدن به روده بزرگ دارند. به باکتری‌های پروبیوتیک تشکیل‌دهندة اسپور ازلحاظ علمی و تجاری توجه گسترده‌ای شده است. در میان آنها گونه‌های باسیلوس بیشترین مطالعه را به‌عنوان باکتری‌های گرم مثبت دارند. استفاده از باسیلوس به‌عنوان محصولات پروبیوتیک به‌خصوص به‌دلیل توانایی ذاتی آنها در تشکیل اندوسپورها با بقا و تحمل در محیط و تولید تعداد زیادی متابولیت باارزش با توانایی درمانی زیستی و تحریک ایمنی همراه است. در این پژوهش علاوه بر آزمایش‌های مورفولوژی و بیوشیمیایی برای شناسایی جنس باسیلوس، تست لیستیناز نیز در دستور کار قرار گرفت. هدف از انجام تست لیستیناز در این پژوهش افتراق بین گونه‌های خاص در جنس باسیلوس بود. سویه‌های باسیلوس جداسازی‌شده همگی لیستیناز مثبت بودند و از آنجایی که وجود فعالیت لیستیناز در برخی باکتری‌های پروبیوتیک ممکن است ابتدا به‌عنوان یک ویژگی پاتوژنیک در نظر گرفته شود، با این حال، این ویژگی همیشه به معنای بیماری‌زایی نیست (13).

نقش لیستیناز در مکانیسم رقابت زیستی و فعالیت‌های مختلف این آنزیم در روده شامل پردازش لیپیدها و تنظیم متابولیسم در باکتری‌های پروبیوتیک نباید نادیده گرفته شود. به عبارتی دیگر، عملکرد لیستیناز در پروبیوتیک‌ها بیشتر به‌عنوان یک ویژگی تنظیمی یا رقابتی در نظر گرفته شود و نه لزوماً نشانه‌ای از پاتوژنیسیته (14)؛ با وجود این، انجام آزمایش‌های برون‌تن و لزوم ارزیابی بیشتر سویه‌ها ازنظر فاکتورهای پاتوژنی مانند تولید توکسین و سایر فاکتورهای ویرولانس، برای ارائه ارزیابی دقیق‌تر ضروری است.

میکروارگانیسم‌های پروبیوتیک اسیدهای معده و صفراوی را تحمل می‌کنند و همچنین در برابر آنزیم‌های گوارشی مقاوم‌اند. Islam, V.H در سال 2011، روی باسیلوس آمیلولیکویی فانشینز در خاک‌های شمال شرقی هیمالیا به‌عنوان یک پروبیوتیک آزمایش کرد. در این مطالعه 4 سویه در مقابل اسید و نمک صفراوی 44/0 درصد مقاومت نشان دادند. هدف از این آزمایش ارزیابی خواص پروبیوتیک باکتری باسیلوس آمیلولیکویی فانشینز در خاک هیمالیا بود (15)؛ اما در این پژوهش ما خواص پروبیوتیکی باسیلوس سوبتیلیس را بررسی کردیم که ازنظر گونه با مطالعه Islam, V.H متفاوت بود. کرمی و همکارانش در سال 1390، 140 ایزوله باسیلوس را از فضولات تازه از 8 مرغداری اراک جدا کردند تا خصوصیات پروبیوتیکی ایزوله‌ها شامل مقاومت به اسید و صفرا و پپسین و تولید ترکیبات ضدمیکروبی را بررسی کنند. نتایج نشان داده‌اند نیمی از ایزوله‌ها توانایی رشد در نمک سدیم کلرید 10 درصد را داشتند و سویه شماره 8 آن به اسید کلریدریک، مقاوم و سویه شماره 5 نیز 100 درصد به نمک‌های صفراوی مقاوم بوده است. همچنین، تمامی سویه‌ها دارای فعالیت ضدمیکروبی علیه پاتوژن‌های معمول مانند ایکولای و سالمونلا بودند (16). در این پژوهش نیز خصوصیات پروبیوتیکی باسیلوس‌ها طبق تست‌های پروبیوتیکی مشابه تحقیق کرمی و همکارانش انجام شد و نتایج حاصل با نتایج آنها مطابقت داشتند؛ فقط تفاوت در محیط جداسازی بوده است که باسیلوس سوبتیلیس در مطالعه حاضر از خاک جداسازی شد، اما در تحقیق کرمی و همکارانش باسیلوس از فضولات تازه از مرغداری اراک جداسازی شده است. همچنین در مطالعه Ammar Algburi و همکارانش در سال 2016، ایمنی و خواص پروبیوتیک باسیلوس آمیلولیکویی فانشینز B-1895 و باسیلوس سوبتیلیس KATMIRA1933 بررسی شدند. اندوسپورهای باسیلوس آمیلولیکویی فانشینز و باسیلوس سوبتیلیس به غلظت 3/0 درصد از نمک‌های صفراوی و 3 pH-2 pH به مدت 4 ساعت مقاوم بودند؛ این نتایج با نتایج حاصل از پژوهش ما مطابقت داشتند (17). براساس مطالعه Xiaohua Guo و همکارانش، سویه باسیلوس سوبتیلیس MA139 مقاومت کامل به 2 pH و نمک‌های صفراوی با غلظت 3/0 درصد را داشته است. همچنین، بالاترین فعالیت ضدمیکروبی را در برابر اشرشیا کلی و سالمونلا و استافیلوکوکوس اورئوس نشان داده است (18). نتایج ما نیز در پژوهش حاضر حاکی از این بود که باسیلوس سوبتیلیس جداسازی‌شده می‌تواند به‌عنوان پروبیوتیک استفاده شود. با این تفاوت که باسیلوس سوبتیلیس جداشده در این پژوهش قابلیت زنده‌ماندن در 2 pH را نداشت. در مطالعه دیگری که Kristoffersen و همکارانش انجام دادند، میزان رشد 40 سویه باسیلوس در برابر غلظت‌های 005/0 تا 2/0 نمک صفرا آزمایش شد. نتایج نشان می‌دهند سویه‌های باسیلوس سرئوس و باسیلوس مگاتریوم، فقط قادر به تحمل میزان 005/0 نمک صفرا بوده‌اند؛ درحالی‌که در این مطالعه سویه باسیلوس سوبتیلیس قادر به تحمل میزان 3/0 درصد نمک صفرا است (19). در مطالعه Aslim و همکارانش در سال 2002، گزارش شد سویه‌های باسیلوس سوبتیلیس، باسیلوس مگاتریوم و باسیلوس تورنجنسیس در برابر پاتوژن‌های اشرشیا کلی و یرسینیا انتروکولیتیکا اثر ضدمیکروبی از خود نشان دادند و در برابر این پاتوژن‌ها مقاوم بودند. نتایج ما نیز در این پژوهش حاکی از مقاومت باسیلوس سوبتیلیس در برابر پاتوژن‌های اشرشیا کلی، سالمونلا و استافیلوکوکوس اورئوس بوده است. همچنین، Galarza-Seeber تأثیر 12 نوع آنتی‌بیوتیک را بر دو سویه باسیلوس سوبتیلیس و باسیلوس مگاتریوم بررسی کرد. نتایج این بررسی نشان داده‌اند این دو سویه نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های نووبیوسین، سفتیوفور، کلیندامایسین، اریترومایسین و باسیتراسین، مقاوم و نسبت به سایر آنتی‌بیوتیک‌ها (اسپتینومایسین، تریپل سولفاتت، تتراسایکلین، ارمتوپریم، پنی‌سیلین، نئومایسین و جنتامایسین) حساس بودند (20). در مطالعه حاضر نیز باسیلوس سوبتیلیس نسبت به کلیندامایسین، تتراسایکلین و جنتامایسین حساس بود. مطالعه‌ای در سال 1994 توسط Beecher و Wong به‌منظور بررسی فعالیت همولیتیک انجام شد. آنها نشان دادند 36 درصد سویه‌ها فاقد فعالیت همولتیک و 64 درصد آنها الگوی ناپیوسته‌ای از فعالیت همولیتیک از خود نشان داده‌اند که پس از بررسی حضور یا عدم حضور ژن‌های همولیتیک، تمامی سویه‌ها فاقد این ژن بودند. حضور یک الگوی ناپیوسته همولیتیک معمولاً مرتبط با حضور BL در باسیلوس است (21)؛ اما در مطالعه حاضر، 7 سویه دارای فعالیت همولیتیک به‌صورت آلفا و بتا بودند و از آنجایی که یکی از معیارهای مهم پروبیوتیک ایدئال، نداشتن فعالیت همولیتیکی است، در این مطالعه 4 نمونه فاقد فعالیت همولیتیکی بودند. مطالعه Mohkam نشان داده است برخی از گونه‌های باسیلوس به‌ویژه گروه‌های سوبتیلیس و پومیلوس توالی‌های ژن 16S rRNA مشابهی دارند که شناسایی آنها براساس تجزیه و تحلیل 16S rRNA سخت است. برای رفع این اشکال تجزیه و تحلیل توالی  rpoBو recA همراه با انگشت‌نگاری چندشکلی (RAPD PCR) به‌عنوان یک روش جایگزین برای تمایز گونه‌های باسیلوس درخور توجه قرار گرفت .(22,23) در این مطالعه نیز تجزیه و تحلیل ژن 16S rRNA به روش PCR به‌عنوان روش شناسایی مولکولی انتخاب شد.

در مطالعه حاضر وجود باکتری‌های مختلف باسیلوس از نواحی مختلف پارک جنگلی یاس فاطمی و کاربرد احتمالی آن به‌عنوان پروبیوتیک نشان داده شد. سویه باسیلوس جداسازی‌شده از این نواحی، به‌دلیل تحمل بالایی که به شرایط اسیدی و نمک صفراوی، به‌عنوان مهم‌ترین ویژگی باکتری‌های پروبیوتیک داشت و همچنین مقاومت به برخی از آنتی‌بیوتیک‌ها و فعالیت ضدباکتریایی آن علیه پاتوژن‌های Escherichia coli، Salmonella و Staphylococcus aureus با نام Bacillus subtilis CFR08 به‌عنوان یک پروبیوتیک بالقوه شناسایی شد؛ اما درنهایت با توجه به اینکه در این پژوهش آزمایش‌های لازم روی حیوان آزمایشگاهی برای بررسی توانایی باکتری به چسبندگی به سلول‌های اپی‌تلیال و ارزیابی هیدروفوبیسیته آن انجام نگرفت، پیشنهاد می‌شود تحقیقات بیشتری شامل آزمایش‌های in-vivo و بررسی‌های مولکولی انجام گیرد تا پتانسیل کامل این سویه ازلحاظ ایمنی و کارایی آن در بهبود سلامت موجودات زنده و کاربرد آن به‌عنوان یک پروبیوتیک بالفعل اثبات شود.