بررسی ویژگی‌های ضداکسیدکنندگی و ضدآمیلوئیدی نانوذرات طلا بیوسنتزشده توسط باسیلوس سرئوس PTCC 1015

مقدمه

تولید نانوذرات مشتق‌شده از فلزات در دهه‌های اخیر افزایش چشمگیری داشته است. نانوذرات به دسته‌ای از ذرات گفته می‌شوند که حداقل اندازه‌ای کمتر از 100 نانومتر داشته باشند. نسبت سطح به حجم بالای نانوذرات موجب واکنش‌پذیری بالای آنها می‌شود و همچنین شکل و اندازه متفاوت این ذرات تأثیر مستقیم بر فعالیت زیستی آنها دارد. خواص ضدباکتریایی، ضدسرطانی و آنتی‌اکسیدانی نانوذرات فلزی باعث شده است طیف وسیعی از کاربردهای بیولوژیکی را داشته باشند (1). نانوذرات را می‌توان با استفاده از روش‌های فیزیکی، شیمیایی و زیستی تولید کرد. روش‌های شیمیایی و فیزیکی دارای معایبی مانند استفاده از مواد شیمیایی، هزینه بالا، تولید محصولات جانبی خطرناک و مراحل پیچیده خالص‌سازی محصول نهایی هستند؛ درحالی‌که سنتز زیستی نانوذرات با استفاده از عصاره گیاهان و میکروارگانیسم‌ها به‌دلیل فرایندی ساده، مقرون‌به‌صرفه بودن، زیست سازگاری و عدم نیاز به فشار، دمای بالا و مواد شیمیایی خطرناک روشی ارجح برای تولید نانوذرات محسوب می‌شود. سنتز سبز نانوذرات توسط گیاهان و طیف وسیعی از ارگانیسم‌ها ازجمله سیانوباکتری‌ها، قارچ‌ها، اکتینومیست‌ها و باکتری‌ها انجام می‌شود (2).

سویه‌های مختلف باکتریایی به‌عنوان منبع زیستی برای سنتز نانوذرات عمل می‌کنند؛ با این حال، تمام سویه‌های باکتریایی قادر به سنتز نانوذرات نیستند. قابلیت سنتز نانوذرات به عواملی مانند فرایندهای متابولیک و وجود آنزیم‌های احیاکننده بستگی دارد. احیای یون‌های فلزی توسط NADH ردوکتاز یکی از مکانیسم‌هایی است که باکتری‌ها با آن نانوذرات فلزی را سنتز می‌کنند؛ برای مثال، باسیلوس لیکنی فورمیس[1] با ترشح NADPH و آنزیم‌های وابسته به NADPH مانند نیترات ردوکتاز، Ag⁺ را به Ag⁰ تبدیل می‌کند (3). سویه مقاوم به نقره، سودوموناس استوتزری[2] AG259 که تجمع داخلی نانوذرات نقره در آن مشاهده شده است، از آنزیم ردوکتاز وابسته به NADH برای سنتز نانوذرات نقره استفاده می‌کند (4). در مطالعه Kang و همکاران (2023)، نانوذرات طلا و نقره با استفاده از مایع رویی کشت لاکتی پلانتی باسیلوس[3] سنتز شدند. نانوذرات طلا و نقره به‌ترتیب اشکال کروی با اندازه‌های 54/100 و 51/129 نانومتر را نشان دادند (5). در مطالعه‌ای دیگر توسط Kang و همکاران، نانوذرات طلا و اکسید روی با استفاده از سویه لوکونوستوک[4] جداشده از کیمچی سنتز شدند. نانوذرات طلا دارای اشکال کروی و با اندازه 77/47 نانومتر بودند؛ درحالی‌که نانوذرات اکسید روی مورفولوژی میله‌ای و اندازه 77/173 نانومتر را نشان دادند (6).

ترکیبات فعال اکسیژن[5] ROS)) مانند اکسید نیتریک (NO)، رادیکال هیدروکسیل (OH^•)، آنیون سوپراکسید (^-•O₂) و پراکسید هیدروژن (H₂O₂) طی تنفس میتوکندریایی تولید می‌شوند؛ با این حال، وجود سیستم‌های دفاعی در ارگانیسم‌های سالم موجب حفظ تعادل اکسیداتیو می‌شود. اختلال در تعادل پرواکسیدانی - آنتی‌اکسیدانی باعث تنش اکسیداتیو می‌شود. این ترکیبات بسیار واکنش‌پذیر و سمی هستند که تولید بیش‌ازحد آنها ممکن است باعث آسیب به لیپیدها، DNA، کربوهیدرات‌ها، پروتئین‌ها و درنتیجه بروز بیماری‌های مختلف شود (7). تشکیل ROS با مصرف اکسیژن و عملکرد اکسیدازها در طول تنفس میتوکندریایی مرتبط است. براساس یافته‌ها، علت بیماری‌های مخرب، ازجمله سرطان، مشکلات عروق مغزی و دیابت با آسیب ناشی از اکسیداسیون مرتبط است. افزایش تولید ROS رابطه مستقیمی با افزایش سیتوکین‌های التهابی دارد (8). آنتی‌اکسیدان‌ها برای جلوگیری از تنش اکسیداتیو، آسیب‌های سلولی و DNA و همچنین جلوگیری از اختلالات مزمن مانند سرطان و بیماری‌های قلبی مورد نیاز هستند. فعالیت آنتی‌اکسیدانی نانوذرات فلزی در تحقیقات قبلی مشخص شده است؛ برای مثال، مطالعه Boomi و همکاران (2020) نشان داد نانوذرات طلا سنتزشده با استفاده از عصاره برگ گیاه آکالیفا ایندیکا[6] فعالیت آنتی‌اکسیدانی چشمگیری برای حذف رادیکال‌های آزاد ۲و۲ دی‌فنیل-۱-پیکریل هیدرازیل[7] (DPPH) دارند (9). علاوه بر این، فعالیت آنتی‌اکسیدانی سایر نانوذرات فلزی ازجمله نانوذرات مس (10)، نقره (11)، اکسید روی (12) و سلنویم (13) در مطالعات قبلی مشخص شده است. در این میان، نانوذرات طلا به‌دلیل مقاومت در برابر اکسیداسیون توجه محققان را به خود جلب کرده‌اند (14). نانوذرات فلزی می‌توانند با انتقال هیدروژن یا الکترون به‌عنوان آنتی‌اکسیدان عمل کنند. در فرایند انتقال الکترون، اهدای الکترون از ترکیبات آنتی‌اکسیدان منجر به کاهش مولکول‌های اکسیداتیو می‌شود؛ درحالی‌که در انتقال هیدروژن، از بین بردن رادیکال‌های آزاد توسط اتم‌های هیدروژن رخ می‌دهد. مشخص شده است نانوذرات فلزی ازجمله نانوذرات طلا و نقره جاذب قوی یون‌های سوپراکسید، رادیکال‌های اکسید نیتریک، DPPH و رادیکال‌های هیدروکسیل هستند (15).

آلزایمر یک بیماری تحلیل‌برنده سیستم عصبی وابسته به سن است که دو سوم از جمعیت‌های سالخورده بالای 65 سال را تحت‌تأثیر قرار می‌دهد (16). تجمع غیرطبیعی پروتئین آمیلوئید بتا در خارج سلول‌های عصبی و پروتئین تائو در داخل این سلول‌ها دو نشانه اصلی این بیماری هستند که به‌ترتیب با عنوان پلاک‌های آمیلوئیدی و کلاف‌های نوروفیبریلاری شناخته می‌شوند. این تجمعات غیرطبیعی سبب اختلال در ارتباطات شبکه نورونی و تخریب آنها می‌شود. پروتئین‌های آمیلوئید بتا پس از جذب توسط میکروگلیا باعث آسیب‌های اکسیداتیو و التهابی می‌شود و درنهایت موجب اختلال عملکرد سیناپسی و مهار مولکول‌های پیام‌رسان در حافظه می‌شود (17). اختلالات عصبی مختلف، ازجمله بیماری پارکینسون، بیماری هانتینگتون، آلزایمز و زوال عقل به‌طور گسترده برای تحویل داروهای هدفمند مغز بررسی شده‌اند (18). نانوابزارهای مختلفی مانند لیپوزوم‌ها، نیوزوم‌ها، میسل‌ها، نانوذرات پلیمری، نانوذرات فلزی و نانوذرات لیپیدی جامد، طراحی و توسعه یافته‌اند تا داروهای هدفمند مغز را با ایمنی، کارایی و پایداری بالا انتقال دهند (19). در میان تمام نانوابزارها، نانوذرات فلزی خواص فیزیکوشیمیایی و بیولوژیکی متمایزی را در مقیاس‌های بالاتر نشان می‌دهند. این خواص منحصربه‌فرد نانوذرات فلزی به‌دلیل نسبت سطح به حجم بالا، افزایش پایداری و واکنش‌پذیری آنها است (20). سد خونی مغزی مشکل اصلی هدف قرار دادن دارو برای هر بیماری عصبی است. نانوذرات فلزی به‌راحتی می‌توانند از سد خونی مغزی عبور کنند (21). التهاب عصبی منجر به مرگ سلول‌های عصبی می‌شود و خطر ابتلا به آلزایمر را افزایش می‌دهد. گزارش شده است نانوذرات مختلف ازجمله نانوذرات طلا، نقره (Ag)، پلاتین (Gupta,  #18) و روتنیوم (Ru) قادرند سطح سایتوکاین‌های پیش‌التهابی مانند TNF-α، IL-6 و IL-1 را کاهش دهند و با کاهش سطح آنزیم استیل‌کولین استراز و کاسپازها خطر ابتلا به آلزایمر را کاهش دهند (22).

نانوذرات طلا به‌دلیل سمیت پایین، خواص کاتالیزوری و ویژگی منحصربه‌فرد خود یعنی رزونانس پلاسمون سطحی کاربرد گسترده‌ای در تصویربردرای زیستی، دارورسانی و سایر زمینه‌ها دارند. علاوه بر این، فعالیت‌های ضدمیکروبی، ضدسرطانی، آنتی‌اکسیدانی، ضدالتهابی و ضددرد نانوذرات طلا در مطالعه‌های قبلی مشخص شده است (11). این نانوذرات همچنین دارای توانایی اتصال به پروتئین آلبومین سرم انسانی[8] (HSA) هستند (23). در این تحقیق از باکتری باسیلوس سرئوس¹¹ برای سنتز نانوذرات طلا استفاده شد. ویژگی‌های مطلوب باسیلوس سرئوس ازجمله سازگاری با طیف وسیعی از شرایط محیطی، توانایی کاهش فلزات سنگین و تحمل غلظت بالای آن در برابر یون‌های فلزی، آن را به گزینه‌ای مناسب برای سنتز نانوذرات فلزی تبدیل کرده است (24, 25). از آنجایی که مطالعه مشابهی درزمینة سنتز نانوذرات طلا توسط این گونه باکتری انجام نشده است، مطالعه حاضر با هدف سنتز نانوذرات طلا با استفاده از باسیلوس سرئوس PTCC 1015 و بررسی اثرات ضداکسیدکنندگی و ضدآمیلوئیدی بر نانورشته‌های آلبومین سرم گاوی به‌عنوان یک پروتئین مدل انجام شد.

 مواد و روش‌ها

مواد شیمیایی و سویه باکتری استفاده‌شده

تمام مواد شیمیایی استفاده‌شده در این تحقیق شامل هیدروژن تتراکلروآئورات (HAuCl₄)، گلوتاتیون، آلبومین سرم گاوی و ۲و۲ دی‌فنیل-۱-پیکریل هیدرازیل (DPPH) از شرکت سیگما آلدریچ (میزوری، آمریکا ) تهیه شدند. کنگو رد از شرکت مرک (دارمشتات، آلمان) خریداری شد. سویه باسیلوس سرئوس PTCC 1015 از مرکز کلکسیون میکروارگانیزم‌های صنعتی ایران (تهران، ایران) به‌صورت لیوفیلیزه تهیه شد. برای فعال‌سازی سویه، پودر لیوفیلیزه با اضافه‌کردن 500 میکرولیتر محیط آبگوشت مغذی[9] (NB) به‌صورت سوسپانسیون درآورده و در محیط آگار مغذی[10] (NA) در دمای 30 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 ساعت کشت داده شد.

 سنتز نانوذرات طلا توسط باسیلوس سرئوس PTCC 1015

سنتز زیستی نانوذرات طلا با استفاده از باسیلوس سرئوس PTCC 1015 انجام شد. سویه باکتریایی در محیط MGYP[11] براث حاوی گلوکز (10 گرم بر لیتر)، عصاره مالت (3 گرم بر لیتر)، پپتون (5 گرم بر لیتر) و عصاره مخمر (3 گرم بر لیتر) تلقیح و به مدت 48 ساعت در شیکر انکوباتور با سرعت 200 دور در دقیقه و با دمای 30 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شد. سپس کشت باکتریایی به مدت20 دقیقه و با سرعت g 6000 سانتریفیوژ شد. مایع رویی حاصل از سانتریفیوژ خالی شد و رسوب سلولی 3 مرتبه با محلول نمک فسفات بافری[12] (PBS) شست‌وشو داده شد. برای سنتز نانوذرات طلا، محلول 1 میلی‌مولار HAuCl₄ در آب دیونیزه، تهیه و pH آن با استفاده از سود 1/0 مولار روی 7 تنظیم شد. 2 گرم از زیست‌توده میکروبی به 100 میلی‌لیتر محلول HAuCl₄ اضافه شد و به مدت 48 ساعت در انکوباتور شیکر 37 درجه سانتی‌گراد با سرعت 200 دور در دقیقه تحت همزن قرار گرفتند (26).

 بررسی ویژگی‌های نانوذرات طلا

تغییر رنگ محلول و آنالیز UV-vis

اولین مشخصه سنتز نانوذرات طلا با تغییر رنگ مخلوط HAuCl₄ در حضور سوسپانسیون توده زنده میکروبی بررسی شد. علاوه بر این، نمونه‌ها با سرعت 15000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ شدند و طیف جذب محلول رویی حاصل از سانتریفیوژ در محدوده 800-300 نانومتر برای مشاهده پیک جذب خاص نانوذرات طلا با استفاده از اسپکتروفتومتر UV-vis (Shimadzu, UV Pharma spec 1700) اندازه‌گیری شد (27).

آنالیز پراش اشعه ایکس[13] (XRD)

ساختار کریستالی نانوذرات با استفاد از آنالیز پراش اشعه ایکس (Philips PW 1800, Netherlands) انجام شد. نمونه‌ها تحت تابش اشعه ایکس با طول موج λ = 1.540598 Å قرار گرفتند و آنالیز با زوایای پراش

(θ2) 80-0 درجه سانتی‌گراد و گام 05/0 در هر ثانیه انجام شد (28).

آنالیز مادون قرمز تبدیل فوریه[14] (FTIR)

گروه‌های عاملی موجود در نانوذرات با استفاده از آزمون مادون قرمز تبدیل فوریه بررسی شدند. برای این منظور، نمونه‌ها با برومید پتاسیم (KBr) مخلوط شدند و برای حذف رطوبت تحت خلأ قرار گرفتند. نمونه‌های پودرشده با استفاده از پرس به‌صورت گلوله درآمدند و طیف جذبی آنها در محدوده طول موج 400-4000 نانومتر توسط اسپکترومتر FTIR شرکت Thermo Fisher Scientific مدل Nicolet Avatar ) (Waltham, USA) 360 ثبت شد (29).

 آنالیز میکروسکوپ الکترونی عبوری[15] (TEM)

اندازه و مورفولوژی نانوذرات سنتزشده با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری تعیین شدند. نمونه‌ها برای تصویربرداری TEM، ابتدا با استفاده از حمام اولتراسونیک در آب پراکنده شدند و 10 میکرولیتر از سوسپانسیون تهیه‌شده روی شبکه مسی با پوشش کربن قرار داده و در محفظه خلأ خشک شد. سپس تصویر برداری با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری انجام شد (29).

آنالیز میکروسکوپ الکترونی روبشی[16] (Zeinivand,  #36)

ساختار سطحی نانوذرات سنتزشده با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی بررسی شد. به‌منظور تصویربرداری SEM، نانوذرات با لایه‌ای نازک از طلا پوشانده شدند و تصویربرداری با میکروسکوپ الکترونی روبشی (Tescan Vega, Czech Republic ) انجام شد (29).

آنالیز پراش انرژی پرتو ایکس[17] (EDX)

تجزیه و تحلیل عنصری نانوذرات با استفاده از آزمون پراش انرژی پرتو ایکس مشخص شد. به‌طور خلاصه پس از برخورد الکترون‌ها به نمونه، انرژی پرتو ایکس ساطع‌شده از نمونه توسط میکروسکوپ SEM مجهز به افزونه EDX اندازه‌گیری شد (29).

 بررسی خاصیت آنتی‌اکسیدانی نانوذرات طلا در حذف رادیکال‌های DPPH

فعالیت آنتی‌اکسیدانی نانوذرات سنتزشده با استفاده از آزمون DPPH بررسی شد (30). DPPH در اتانول به فرم رادیکالی خود تبدیل می‌شود و در طول موج 517 نانومتر، بیشترین مقدار جذب را دارد. این ترکیب پس از واکنش با ماده آنتی‌اکسیدان احیا می‌شود و جذب آن در طول موج 517 نانومتر کاهش می‌یابد و رنگ محلول از ارغوانی به زرد تغییر می‌کند. ابتدا 100 میلی‌لیتر محلول 1/0 مولار DPPH در اتانول تهیه شد. سپس 2 میلی‌لیتر از این محلول به 2 میلی‌لیتر از غلظت‌های مختلف نانوذرات طلا (1-2/0 میکروگرم بر میلی‌لیتر) اضافه شد و به مدت 30 دقیقه در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد و شرایط تاریکی انکوبه شد. از گلوتاتیون نیز به‌عنوان استاندارد استفاده شد. سپس جذب نمونه‌ها در طول موج 517 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر، اندازه‌گیری و درصد مهار رادیکال‌های آزاد DPPH با استفاده از رابطه زیر محاسبه شد.

100 X جذب نمونه کنترل / جذب نمونه تیمار - جذب نمونه کنترل = درصد مهار رادیکال DPPH

 سنجش فعالیت آنتی‌آمیلوئیدوژنیک نانوذرات طلا

پتانسل ضدآمیلوئیدی نانوذرات طلا با استفاده از بافر کنگورد اندازه‌گیری شد (31). ابتدا آلبومین سرم گاوی با غلظت 5 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر در بافر فسفات-سیترات (3pH  ) تهیه شد. سپس غلظت‌های 2/0، 4/0، 8/0، 6/1و 2/3 میکروگرم به‌ازای میلی‌لیتر از نانوذرات طلا به 400 میکرولیتر از محلول آلبومین سرم گاوی اضافه شدند و به مدت 48 ساعت روی همزن مغناطیسی با دمای 60 درجه سانتی‌گراد و سرعت 100 دور در دقیقه قرار گرفت. کنگورد با غلظت 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر در محلول PBS تهیه شد. سپس برای طیف‌سنجی کنگورد، 100 میکرولیتر از نمونه‌های آمیلوئیدی تهیه‌شده در حضور نانوذرات طلا با 1900 میکرولیتر از بافر کنگورد ترکیب شد و پس از 10 دقیقه انکوباسیون در دمای اتاق، میزان جذب نمونه‌ها توسط اسپکتروفتومتر در محدوده 400 تا 600 نانومتر، خوانده و منحنی آن رسم شد.

 آنالیز آماری

تمام اطلاعات به‌دست‌آمده در این تحقیق از میانگین ± انحراف معیار از سه تکرار برای هر آزمون بود. آنالیز آماری به کمک آزمون t-test انجام پذیرفت. ارزش (0.05p<) ازنظر آماری معنی‌دار در نظر گرفته شد. در مطالعه فعالیت ضدآمیلوئیدی، بررسی آماری میانگین نتایج به‌دست‌آمده از سه تکرار براساس آزمون حداقل اختلاف معنی‌دار (Least significant difference) انجام شد.

نتایج

بررسی ویژگی‌های نانوذرات

تغییر رنگ محلول و آنالیز UV-vis

همان‌طور که در شکل 1 نشان داده شده است، تغییر رنگ محلول HAuCl₄ پس از افزودن عصاره باسیلوس سرئوس از زرد کم‌رنگ به قرمز ارغوانی بیان‌کنندة احیای یون‌های طلا و سنتز نانوذرات طلا بود. علاوه بر این، طیف‌سنجی UV-vis وجود یک پیک جذبی قوی در طول‌موج 560 نانومتر را نشان داد که مشخصه سنتز نانوذرات طلا است. (شکل 2).

آنالیز مادون‌قرمز تبدیل فوریه (FTIR)

طیف مادون‌قرمز تبدیل فوریه (FTIR) نانوذرات سنتزشده در محدوده طول موج cm^-1 400-4000 نشان داده شده است (شکل 3). دو پیک جذبی پهن در شکل مشخص است که یکی در طول موج cm⁻¹ 3253 مربوط به ارتعاشات جذب مولکول‌های آب روی گروه O−H متصل‌شده به نانوذرات طلا است و دیگر پیک مشاهده‌شده در طول موج cm⁻¹ 1580 مربوط به تشکیل پیوند با گروه C−N است (5).

آنالیز پراش اشعه ایکس (XRD)

اندازه بلورهای نانوذرات طلا براساس نتایج به‌دست‌آمده از XRD و به کمک رابطه شرر محاسبه شد. طیف پراش اشعه ایکس نانوذرات طلا سنتزشده 4 پیک شارپ را در ° 1/38، ° 3/44، ° 5/64 و ° 7/77 به‌ترتیب با زوایای میلر 111، 200، 220 و 311 نشان داد که سنتز نانوذرات طلا را تأیید می‌کند (شکل 4)

آنالیز میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM)

همان‌طور که در تصاویر میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) نشان داده‌ شده است، نانوذرات سنتزشده دارای مورفولوژی کروی با اندازه 15-10 نانومتر بودند (شکل 5).

آنالیز میکروسکوپ الکترونی روبشی (Zeinivand,  #36)

تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی (Zeinivand,  #36) نیز بیان‌کنندة تجمع نانوذرات با میانگین اندازه 70 نانومتر بودند که با بزرگ‌نمایی‌های 1 میکرومتر ، 500 و 200 نانومتر مشخص شده‌اند (شکل 6).

آنالیز پراش انرژی پرتوایکس (EDX)

براساس آنالیز پراش انرژی پرتوایکس (EDX)، حضور پیک مربوط به اتم طلا در محدوده Kev 5/1 و عدم حضور عناصر دیگر بیان‌کنندة خلوص نانوذرات طلا بود (شکل 7).

شکل 1. تغییر رنگ مخلوط واکنش از زرد به قرمز ارغوانی پس از افزودن زیست‌توده میکروبی باسیلوس سرئوس به محلول HAuCl4 که بیان‌کنندة سنتز نانوذره طلا بود (از چپ به راست تغییر رنگ مشخص شده است).

Fig1. The colour change of the reaction mixture from yellow to purple-red after the addition of B. cereus microbial biomass to the HAuCl₄ solution indicates the synthesis of gold nanoparticles (from left to right, showing the specified colour change).

 شکل 2. طیف اسپکتروفتومتر UV-vis نانوذرات طلا سنتزشده توسط باسیلوس سرئوس PTCC 1015 در مقایسه با عصاره باسیلوس سرئوس. (NPs: نانوذرات طلا، Supernatant: عصاره باسیلوس سرئوس). مقادیر به‌دست‌آمده از میانگین ± انحراف معیار از سه تکرار برای هر آزمون است. (0.05p<)

Fig 2. The UV-vis spectrophotometer spectrum of gold nanoparticles synthesized by B. cereus PTCC 1015 is compared with that of the B. cereus extract. (NPs: gold nanoparticles, supernatant: Bacillus cereus extract). The values obtained represent the mean ± standard deviation of three replicates for each assay. (p<0.05)

شکل 3. نمودار طیف مادون‌قرمز تبدیل فوریه نانوذرات طلا سنتزشده توسط باسیلوس سرئوس PTCC 1015

Fig 3. Fourier transform infrared spectrum of gold nanoparticles synthesized by B. cereus PTCC 1015.

شکل 4. طیف پراش اشعه ایکس نانوذرات طلا سنتزشده توسط باکتری باسیلوس سرئوس PTCC 1015

Fig 4. X-ray diffraction spectrum of gold nanoparticles synthesized by B. cereus PTCC 1015.

شکل 5. تصاویر میکروسکوپ الکترونی عبوری نانوذرات طلای سنتزشده توسط باسیلوس سرئوس PTCC 1015. اندازه ذرات 10 تا 15 نانومتر است.

Fig 5. Transmission electron microscope images of gold nanoparticles synthesized by B. cereus PTCC 1015 show particles in the size range of 10 to 15 nm.

شکل 6. تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی نانوذرات طلای سنتزشده توسط باسیلوس سرئوس PTCC 1015.

الف- بزرگ‌نمایی 1 میکرومتر، ب- بزرگ‌نمایی 500 نانومتر، ج- بزرگ‌نمایی 200 نانومتر

Fig 6. Scanning electron microscope images of gold nanoparticles synthesized by B. cereus PTCC 1015. A - 1 µm resolution, B - 500 nm resolution, C - 200 nm resolution.

شکل 7. نمودار پراش انرژی پرتوایکس نانوذرات طلا سنتزشده توسط باسیلوس سرئوس PTCC 1015

Fig 7. Energy dispersive X-ray spectroscopy spectrum of gold nanoparticles synthesized by B. cereus PTCC 1015.

سنجش فعالیت آنتی‌اکسیدانی نانوذرات طلا

نتایج آزمون DPPH نشان دادند فعالیت آنتی‌اکسیدانی نانوذرات طلا به‌صورت وابسته به غلظت است؛ به‌طوری‌که با افزایش غلظت نانوذرات، خاصیت آنتی‌اکسیدانی آنها نیز افزایش می‌یابد. همان‌طور که در شکل 8 نشان داده شده است، اثر مهارکنندگی نانوذرات از غلظت 6/0 میکروگرم بر میلی‌لیتر شروع شده است و بالاترین اثر مهارکنندگی رادیکال‌های DPPH با میزان 12/98 درصد در غلظت 1 میکروگرم بر میلی‌لیتر مشاهده شد. همچنین مقادیر ₅₀ IC برای نانوذرات طلا و گلوتاتیون (کنترل) به‌ترتیب به میزان 8/0 و 6/0 میکروگرم بر میلی‌لیتر بود (0.05p<).

شکل 8. مهار رادیکال DPPH توسط غلظت‌های مختلف نانوذرات طلا در مقایسه با گلوتاتیون. مقادیر به‌دست‌آمده از میانگین ± انحراف معیار از سه تکرار برای هر آزمون است. (0.05p<)

Fig 8. Inhibition of DPPH radicals by different concentrations of gold nanoparticles compared to glutathione. The values obtained represent the mean ± standard deviation of three replicates for each test. (p< 0.05)

مهار تولید نانورشته‌های آمیلوئیدی توسط نانوذرات طلا

برای بررسی فعالیت ضدآمیلوئیدی نانوذرات طلا سنتزشده، طیف جذبی (شدت جذب) فیبریل‌های آمیلوئیدی در حضور غلظت‌های مختلف نانوذرات (0، 2/0، 4/0، 8/0، 6/1 و 2/3 میکروگرم بر میلی‌لیتر) اندازه‌گیری شد. همان‌طور که در شکل 9 نشان داده شده، بیشترین درصد مهار تشکیل رشته‌های آمیلوئیدی در غلظت 2/3 میکروگرم بر میلی‌لیتر است. براساس آزمون حداقل اختلاف میانگین (LSD) نتایج به‌دست‌آمده بین گروه‌های تیمار در طول موج بین 480 و 520 نانومتر معنادار است. این اختلاف در غلظت 2/3 میکروگرم بر میلی‌لیتر نسبت به غلظت‌های پایین‌تر بیشتر مشاهده شد. به این ترتیب، نتیجه گرفته می‌شود فعالیت ضدآمیلوئیدی نانوذرات طلا وابسته به غلظت بوده است و در غلظت 2/3 میکروگرم بر میلی‌لیتر بیشترین مقدار را دارد.

شکل 9. میزان طیف جذبی نانوفیبریل‌های آمیلوئیدی تشکیل‌شده در حضور غلظت‌های 0، 2/0، 4/0، 8/0، 6/1 و 2/3 میکروگرم بر میلی‌لیتر نانوذرات طلا سنتزشده توسط باسیلوس سرئوس PTCC 1015. (0.05p<)

Fig 9. Absorption spectrum of amyloid nanofibrils formed in the presence of 0.0, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, and 3.2 μg/mL concentrations of gold nanoparticles synthesized by B. cereus PTCC 1015. (p< 0.05)

بحث و نتیجه‌گیری

در طول دو دهه گذشته، فناوری نانو دستخوش جهش‌های عظیمی شده و به یکی از پررونق‌ترین حوزه‌های تحقیقاتی تبدیل شده است. ذرات در مقیاس نانو، خواص کاتالیزوری، مغناطیسی، الکتریکی، مکانیکی، نوری، شیمیایی و بیولوژیکی بهتری از خود نشان می‌دهند. از کاربردهای فناوری نانو در حوزه پزشکی می‌توان به تولید عوامل ضدباکتریایی، ضدقارچی، ضدویروسی، ضدالتهاب، ضدسرطان، ضددیابت و آنتی‌اکسیدانی اشاره کرد. سنتز سبز نانوذرات با توجه به کارایی آنها در پزشکی و علوم زیستی در سال‌های اخیر افزایش یافته است. همچنین، افزایش آگاهی نسبت به شیمی سبز و فرایندهای زیستی، استفاده از روش‌های سازگار با محیط زیست را برای تهیه غیررسمی نانو مواد ضروری کرده است. سنتز بیولوژیکی نانوذرات را می‌توان با استفاده از مجموعه وسیعی از منابع مانند گیاهان و محصولات گیاهی، جلبک‌ها، قارچ‌ها، مخمرها، باکتری‌ها و ویروس‌ها انجام داد (32). در پژوهش حاضر سنتز زیستی نانوذرات طلا با احیای یون‌های هیدروژن تتراکلرو آئورات (HAuCl₄) توسط زیست‌توده میکروبی باسیلوس سرئوس PTCC 1015 پس از گذشت 48 ساعت انجام شد که با تغییر رنگ مخلوط واکنش از سفید مایل به زرد به قرمز ارغوانی مشخص شد. به‌طور مشابه، در مطالعه Khan و همکاران (2023) نیز تغییر رنگ مخلوط واکنش هیدروژن تتراکلرو آئورات و بتا-کاریوفیلن[18] از زرد به قرمز پس از تولید نانوذرات طلا مشاهده شد (33). علاوه بر این، بررسی اسپکتروفتومتری UV-vis وجود پیک جذبی در طول موج ۵۶۰ نانومتر، سنتز نانوذرات طلا در مطالعه ما را تأیید کرد. در مطالعه  Kangو همکاران (2023)، نانوذرات طلا بیوسنتزشده طیف جذبی را در ناحیه 560 نانومتر نشان دادند که با مطالعه حاضر مطابقت دارد (5). در مطالعه‌ای دیگر، Reddy و همکاران (2010)، با استفاده از توده زیستی باکتری باسیلوس سوبتیلیس[19] و محلول  HAuCl₄ موفق به سنتز نانوذرات طلا شدند؛ با این حال، مدت زمان سنتز نانوذرات 72 ساعت و بیشتر از مطالعه حاضر بود (34). براساس تصاویر میکروسکوپ الکترونی، نانوذرات سنتزشده دارای اشکال کروی و قطر کمتر از 100 نانومتر بودند که با مطالعات قبلی مطابقت دارد (5, 6).

تنش اکسیداتیو وضعیتی است که در آن اکسیدان‌ها به ماکرومولکول‌ها ازجمله پروتئین‌ها، اسیدهای نوکلئیک و لیپیدهای تشکیل‌دهندة غشای سلولی آسیب می‌رسانند. بسیاری از بیماری‌ها ازجمله دیابت، فشارخون بالا، تصلب شرایین، بیماری مزمن انسدادی ریه[20] (COPD)، سرطان و آلزایمر با تنش اکسیداتیو مرتبط هستند (35). در مطالعه حاضر، توانایی نانوذرات طلا در مهار رادیکال‌های آزاد DPPH ارزیابی شد. ^• DPPH (2،2-دی‌فنیل-1-پیکریل هیدرازیل) یک رادیکال آزاد آلی پایدار با رنگ بنفش تیره و جذب قوی در طول موج 517 نانومتر است که با پذیرش هیدروژن یا الکترون از ترکیبات آنتی‌اکسیدانی کاهش می‌یابد و به ترکیب پایدار 2و2 دی‌فنیل 1- پیکریل هیدرازین (DPPH-H) مایل به زرد کم‌رنگ تبدیل می‌شود. براساس نتایج، مهار رادیکال‌های آزاد توسط نانوذرات سنتزشده وابسته به غلظت بود و غلظت 8/0 میکروگرم بر میلی‌لیتر از نانوذرات باعث مهار 50 درصدی رادیکال‌های آزاد شد. همچنین مقدار ₅₀IC گلوتاتیون که به‌عنوان یک ماده آنتی‌اکسیدان استاندارد در این مطالعه استفاده شده است، برابر با 6/0 میکروگرم به‌ازای میلی‌لیتر بود. یکی از مکانیسم‌های آنتی‌اکسیدانی نانوذرات سنتزشده ممکن است توانایی آنها در اهدای الکترون یا یون هیدروژن به رادیکال‌های آزاد DPPH برای خنثی‌کردن آنها باشد (15). به‌طور مشابه، در مطالعه‌ای که زینتی‌وند و همکاران (2022) انجام دادند، نانوذرات طلا سنتزشده توسط اگزوپلی‌ساکارید لاکتوباسیلوس پاراکازئی[21] در غلظت 50 میکروگرم بر میلی‌لیتر باعث مهار 81 درصد رادیکال‌های آزاد DPPH شد (36). علاوه بر این، فعالیت آنتی‌اکسیدانی نانوذرات سنتزشده ممکن است به‌دلیل فعالیت تقلیدی کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز باشد که امکان حذف ترکیبات فعال اکسیژن را فراهم می‌کند (37). مطالعه و همکاران در سال 2010 این فرضیه را تقویت می‌کند. آنها نشان دادند تیمار موش‌های دیابتی با نانوذرات طلا باعث افزایش سطوح گلوتاتیون، سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز در مقایسه با گروه تیمارنشده می‌شود (38).

آلزایمر یک بیماری تخریب‌کنندة عصبی است که باعث آسیب‌های پیش‌رونده و برگشت‌ناپذیر زبان و حافظه می‌شود. این بیماری نه‌تنها در افراد مسن، بلکه در افراد مبتلا به بیماری‌های مزمن مانند دیابت نیز بروز می‌کند (39). از دست دادن حافظه و بی‌ثباتی رفتاری از ویژگی‌های اساسی این بیماری است (40). آلزایمر عمدتاً با اختلال شناختی شروع می‌شود و سپس به‌تدریج نورون‌های حسی و حرکتی را مختل می‌کند (41). پاتوژنز آلزایمر شامل تنش اکسیداتیو، التهاب و تخریب عصبی، اختلال در تنظیم کلسیم، اختلال در عملکرد میتوکندری، تشکیل گره‌های نوروفیبریلاری، الیگومریزاسیون آمیلوئید، سمیت سیناپسی و دیسومئوستاز یون‌های فلزی مانند آهن، مس و روی است (42). آلزایمر عمدتاً به‌دلیل تجمع پلاک‌های آمیلوئید بتا تولیدشده توسط پروتئین پیش‌ساز آمیلوئید بتا، تشکیل گره‌های نوروفیبریلاری، اختلال عملکرد عصبی، تولید ترکیبات فعال اکسیژن، کاهش متابولیسم انرژی مغز، تنش ردوکس در مغز و التهاب عصبی ایجاد می‌شود (43).

عدم توانایی عبور از سد خونی مغزی، یک محدودیت مهم داروهای موجود برای درمان بیماری آلزایمر است (44). با استفاده از درمان‌های مبتنی بر فناوری نانو، این محدودیت برطرف می‌شود. نانوذرات فلزی ازطریق دارورسانی هدفمند یک رویکرد درمانی مفید برای مدیریت بیماری آلزایمر محسوب می‌شوند (18). مهم‌ترین علت بیماری آلزایمر تجمع پروتئین آمیلوئید بتا است و درمان‌هایی کـه موجب کاهش این پروتئین می‌شوند، بهبود علائم بیماری آلزایمر را سبب می‌شوند؛ بنابراین، اگر تولید نانورشته‌های آمیلوئیدی در حضور ترکیبی مهار شود، می‌تواند بر اثرات درمانی آن برای کاهش عوارض ناشی از بیماری آلزایمر دلالت داشته باشد. در پژوهش حاضر با بررسی نتایج حاصل از طیف‌سنجی کنگورد مشـخص شد نانوذرات طلا سنتزشده توانایی کاهش تولید پروتئین آمیلوئید را دارند. براساس نتایج، بیشترین میزان مهار رشته‌های آمیلوئیدی (96 درصد) در غلظت 2/3 میکروگرم بر میلی‌لیتر از نانوذرات طلا مشاهده شد. در توافق با یافته‌های ما، مطالعه‌ای دیگر نشان داد نانوذرات طلا کونژوگه‌شده با گلوتاتیون از تجمع پروتئین‌های آمیلوئید بتا جلوگیری می‌کنند (45). این یافته‌ها فعالیت ضدآمیلوئیدی نانوذرات طلا را برجسته می‌کند.

ترکیبات فعال اکسیژن و تنش اکسیداتیو یک عامل مهم در پیشرفت بیماری‌های عصبی ازجمله آلزایمر هستند. بسیاری از مطالعات افزایش تنش اکسیداتیو در مغز بیماران مبتلا به آلزایمر را نشان داده‌اند؛ ازجمله افزایش سطح ایزوپروستان آلفا در مایع مغزی-نخاعی (46) و لوب‌های پیشانی و گیجگاهی (47)، آکرولئین در آمیگدال و شکنج هیپوکامپ-پاراهیپوکامپ (48). همچنین، افزایش سطح اکسیداسیون DNA هسته‌ای و میتوکندریایی در لوب‌های پیشانی، آهیانه‌ای و گیجگاهی مغز بیماران مبتلا به آلزایمر در مقایسه با افراد سالم مشاهده شده است (49). علاوه بر تنش اکسیداتیو، فعالیت التهابی در مغز با افزایش تولید آمیلوئید موجب مرگ نورون‌های سالم و کاهش توانایی سلول‌های میکروگلیال برای حذف پلاک‌های آمیلوئید شده است که رابطه مستقیمی با پیشرفت بیماری آلزایمر دارد (50). طبق تحقیقات انجام‌شده، افزایش سطح سرمی پروتئین واکنشی [22]C (CRP) در میانسالی با زوال عقل و بیماری آلزایمر مرتبط است (51). مطالعات اخیر نشان داده‌اند استفاده طولانی‌مدت از داروهای ضدالتهاب غیراستروئیدی[23] (NSAIDs) پیامدهای ارزشمندی برای جلوگیری از زوال عقل و بیماری آلزایمر دارند (52). براساس این یافته‌ها، ترکیبات آنتی‌اکسیدانی و ضدالتهابی نقش مهمی در محافظت عصبی و جلوگیری از بیماری آلزایمر دارند. مهار فعال‌شدن مسیرهای سیگنالینگ NF-kB و MAPK و همچنین کاهش ترشح سیتوکین‌های پیش‌التهابی توسط نانوذرات طلا گزارش شده است (53-55)؛ بنابراین، یکی از مکانیسم‌های نانوذرات طلا برای مقابله با بیماری آلزایمر ممکن است مداخله با مسیرهای سیگنالینگ القاکنندة التهاب و کاهش ترشح سیتوکین‌های پیش‌التهابی باشد. مطالعه ما نشان داد نانوذرات طلا سنتزشده توسط باسیلوس سرئوس PTCC 1015 به‌طور چشمگیری موجب مهار رادیکال‌های آزاد DPPH می‌شوند. خاصیت آنتی‌اکسیدانی نانوذرات طلا همراه با مهار رشته‌های آمیلوئیدی در مطالعه حاضر، پتانسیل ضدآمیلوئیدی نانوذرات سنتزشده را تقویت می‌کند.

نتیجه‌گیری

در مطالعه حاضر نانوذرات طلا با اشکال کروی و اندازه 70-20 نانومتر با استفاده از عصاره باسیلوس سرئوس سنتز شدند. این کار نشان داد نانوذرات طلا بیوسنتزشده پتانسیل بالایی در حذف رادیکال‌های آزاد DPPH و مهار تولید رشته‌های آمیلوئیدی در شرایط آزمایشگاهی دارند. براساس این یافته‌ها، نانوذرات سنتزشده ممکن است در جلوگیری از تشکیل پلاک‌های آمیلوئیدی در مغز مفید باشند؛ با این حال، انجام مطالعات درون تنی و کشف مکانیسم‌های ضدآمیلوئیدی نانوذرات سنتزشده ضروری است.

[1] Bacillus licheniformis

[2] Pseudomonas stutzeri

[3] Lactiplantibacillus

[4] Leuconostoc

[5] Reactive oxygen species

[6] Acalypha indica

[7] 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

[8] Human serum albumin

[9] Nutrient broth

[10] Nutrient agar

[11] Malt extract Glucose Yeast extract Peptone

[12] phosphate buffered saline solution

[13] X-Ray Diffraction (XRD)

[14] Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR)

[15] Transmission Electron Microscopy 31.Zeinivand M, Aghaei Ss, Zargar M, Ghasemzadeh MA. Synthesis of Gold Nanoparticles Using Exopolysaccharide from Lactobacillus Paracasei and Evaluation of their Antibacterial, Anti-biofilm, and Antioxidant Properties. Journal of Microbial Biology. 2022;11(42):67-83.

[16] Scanning electron microscopy 31.       Ibid.

[17] Energy Dispersive X- ray Spectrometer (EDX)

[18] β-caryophyllene

[19] Bacillus subtilis

[20] Chronic obstructive pulmonary disease

[21] Lactobacillus paracasei

[22] C-reactive protein

[23] Nonsteroidal anti-inflammatory drugs