تأثیر متیل جاسمونات بر رشد و تولید ترکیبات فنلی در کالوس گیاهDracocephalum polychaetum Bornm.

تنوع و پراکنش بالای گیاهان خانواده نعناء Lamiaceae در ایران، این گیاهان را به یکی از مهم­ترین خانواده­های گیاهی در فلور ایران تبدیل کرده است (Jamzad, 2013) گیاه Dracocephalum polychaetum Bornm. یا مفرو یکی از گیاهان دارویی از اعضای خانواده Lamiaceae و بومی ایران بوده و تنها در ارتفاعات کوه­های هزار واقع در جنوب استان کرمان می­روید (Boroomand et al., 2018; Khodami et al., 2011). خواب پیچیده‌ی بذر، رشد در ارتفاعات زیاد و هوای سرد از جمله عوامل محدودیت رویش و پراکنش این گونه‌ی گیاهی در منطقه جغرافیایی خاص است. همچنین تغییرات اقلیمی، کاهش بارندگی و برداشت بی‌رویه انسان سبب کاهش روز افزون جمعیت این گیاه در زیستگاه خود شده است (Mehrabani et al., 2005). حضور متابولیت‌های ثانویه ارزشمندی همچون مونوترپن‌ها مانند پریل آلدهید و لیمونن و ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی مانند آپیژین، لوتئولین، نارینجین، کوئرستین، روتین، رزمارینیک اسید، تیمول و کاروکرول سبب خواص درمانی و اهمیت دارویی این گیاه شده است (Mehrabani et al., 2005; Taghizadeh et al., 2019). متابولیت­های ثانویه طیف وسیعی از ترکیبات تولید شده توسط گیاهان هستند که عملکرد­های مختلفی در گیاهان دارند. این ترکیبات در ارتباطات گیاه با محیط اطراف خود، دفاع گیاهان و مقابله با شرایط تنش نقش دارند (Hartmann, 2007; Jan et al., 2021). بیش از 2140000 متابولیت ثانویه در گیاهان شناخته شده (Durairaj et al., 2018) و ترکیبات فنلی بزرگ‌ترین گروه متابولیت‌های ثانویه به شمار می‌روند. ترکیبات فنلی به­عنوان آنتی‌اکسیدان‌های قوی گیاهی به خنثی­سازی تنش اکسیداتیو ناشی از تنش‌های زیستی و غیرزیستی و دفاع از گیاه در برابر آفات و انگل­ها می‌پردازند (Wuyts et al., 2006) و یکی از عوامل ایجاد رنگ و بو در گیاهان هستند (Zhang et al., 2022). همانطور که ترکیبات فنلی به عنوان آنتی‌اکسیدان با خاموش‌سازی گونه‌های فعال اکسیژن از آسیب به گیاه در برابر تنش‌ اکسیداتیو جلوگیری می‌کنند، حضور این ترکیبات در رژیم غذایی انسان به واسطه خواص آنتی‌اکسیدان، ضد التهاب، ضد ویروس، ضد تومور و آنتی‌آلرژیک نیز نقش بسزایی در بهبود سلامت انسان دارند (Vergara-Martínez et al., 2021; Zhang et al., 2022). گروه‌های متعدد ترکیبات فنلی از جمله فنولیک اسیدها، فلاونوئیدها، استیلبن‌ها، کومارین‌ها، تانن‌ها، لیگنین‌ها و غیره همگی از مشتقات مسیر بیوسنتزی فنیل پروپانوئید هستند که طی این مسیر بیوسنتزی، آمینواسیدهای فنیل‌آلانین و تیروزین به عنوان پیش ماده با فعالیت آبشاری آنزیم‌ها به سنتز فنیل پروپانوئیدها می‌پردازند (Marchiosi et al., 2020; Vogt, 2010). آنزیم‌های PAL یا PTAL، آنزیم­های آغاز کننده سنتز ترکیبات فنلی و کلیدی در تنظیم بین مسیر شیکیمات و مسیر بیوسنتز فنیل پروپانوئیدها هستند که جریان کربن بین متابولیسم اولیه و ثانویه را تنظیم می­کنند (Barros & Dixon, 2020).

اگرچه استفاده از متابولیت‌های ثانویه در صنایع دارویی، غذایی، آرایشی و عطرسازی اهمیت اقتصادی فراوانی دارد، اما سنتز این ترکیبات در گیاهان به کندی انجام شده و کمتر از 1% از وزن خشک گیاهان را به خود اختصاص می‌دهند (Namdeo, 2007). از طرفی برداشت بی­رویه گیاهان دارویی از زیستگاه‌های طبیعی خود سبب تخریب زیستگاه و کاهش شدید در جمعیت طبیعی این گیاهان و رویارویی این گیاهان با خطر انقراض شده است. از این رو جهت بهره برداری پایدار از این منابع ارزشمند گیاهی، روش‌های مختلفی از جمله زراعی سازی این گیاهان، سنتز شیمیایی این ترکیبات و استفاده از روش‌های بیوتکنولوژی پیشنهاد شده که استفاده از روش‌های بیوتکنولوژی یکی از مناسب‌ترین راه‌ها جهت افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه است ( Halder et al., 2019; Iannicelli et al., 2020). به کمک روش­های بیوتکنولوی با کشت سلول، بافت و اندام گیاهی و یا ریزازدیادی گیاهان و به کارگیری راهبرد­های مختلفی مانند انتخاب لاین سلولی با توانایی تولید محصول بیشتر، اصلاح محیط کشت و استفاده از محرک­ها (Elicitation)، کشت ریشه موئین، کشت سلول در مقیاس بزرگ در راکتورهای زیستی، بیوترانسفورماسیون (Biotransformation) وplant cell immobilization  (تثبیت سلول‌های گیاهی) می­توان تولید متابولیت­های ثانویه را بدون تخریب زیستگاه و با حفظ تنوع زیستی افزایش داد (M. Halder et al., 2019; Madani et al., 2021; Namdeo, 2007). براساس مطالعات پیشین در میان انواعی از روش‌های کشت سلول و بافت گیاهی، کشت کالوس، سوسپانسیون سلولی و ریشه‌های موئین پتانسیل بالاتری در تولید متابولیت‌های ثانویه در مقیاس صنعتی دارند. معمولاً در محل زخم در گیاه، توده‌ی سلولی تمایز نیافته‌ای تحت عنوان کالوس تجمع می‌یابد. جهت به کارگیری کالوس در بیوتکنولوژی می‌توان این توده سلولی تمایز نیافته را از تمامی بخش‌های گیاه با استفاده از هورمون‌های رشد گیاهی (اکسین و سیتوکینین) در کشت درون شیشه‌ای (in-vitro) به دست آورد. سلول‌های کالوس در بسیاری از صفات مشابه با سلول‌های تمایز نیافته مریستمی هستند و قابلیت تمایز یابی به انواع بافت، اندام و گیاه کامل را دارند. استفاده از کالوس جهت تولید متابولیت‌های ثانویه در مقیاس بالا، تولید آنتی‌بادی و پروتئین‌های نوترکیب درمانی و باززایی گیاهان زراعی و باغبانی از کالوس را می‌توان مواردی از کابرد‌های کشت کالوس برشمرد (Efferth, 2019). تا امروز تعداد کمی از متابولیت­های ثانویه برای مصارف دارویی، عطرسازی، آرایشی و صنایع غذایی در مقیاس صنعتی تولید شده­اند که شامل کشت سوسپانسون سلولی Lithospermum erythrorhizon برای تولید شیکونین و Captis japanica برای تولید بربرین، کشت سلول در Coleus blumei برای تولید رزمارینیک اسید، Papaver somniferum برای تولید سانگواینارین و  Taxus bervifoliaبرای تولید پاکلی تاکسل است (Madani et al., 2021). استفاده از روش کشت کالوس در افزایش تولید رزمارینیک اسید در گیاه Salvia miltiorrhiza (Morimoto et al., 2004). و کوئرستین از کالوس گیاه Chrysanthemum cinerariefolium (Purwianingsih et al., 2016) مؤثر بوده است.

یکی از روش‌های مؤثر در افزایش تجمع متابولیت‌های ثانویه در گیاهان استفاده از محرک‌ها (Elicitation) است. محرک‌ها مولکول­های سیگنال با منبع زیستی و غیر زیستی هستند که سبب فعال شدن پاسخ­های تنش و سیستم دفاعی در سلول شده و منجر به افزایش سنتز و تجمع متابولیت­های ثانویه در سلول می­شوند (Halder et al., 2019; Thakur et al., 2019) جاسمونیک اسید و مشتقات آن مانند متیل­جاسمونات، گروهی از هورمون­های رشد گیاهی هستند که یکی از مهم­ترین نقش­های آن­ها القاء پاسخ­های دفاعی در برابر انواعی از تنش‌های زیستی و غیرزیستی است (Yu et al., 2018)، همین ویژگی، جاسمونات­ها بویژه متیل جاسمونات (MJ) را به یکی از مهم­ترین محرک­ها جهت افزایش تولید و تجمع متابولیت­های ثانویه تبدیل کرده است (Ruan et al., 2019). هنگام حضور متیل­جاسمونات در محیط کشت سلول­های گیاهی، MJ به گیرنده‌های سطح غشاء سلول متصل شده و سبب فعال‌سازی مسیر سیگنالینگ و پراکسیداسون لیپید­های غشایی شده و تولید ROS (Reactive oxygen species) در سلول افزایش می­یابد. ROS در غلظت­های کم، مولکول­های پیام‌رسان ثانویه هستند که تولید مولکول­های سیگنال مانند جاسمونیک­اسید، سالیسیلیک­­اسید، اتیلن و نیتریک­اکسید را در گیاه تحریک می­کند و سبب بیان ژن­های پاسخ به تنش در سلول از جمله بیان ژن‌های مرتبط با مسیرهای بیوسنتز متابولیت‌های ثانویه می­شود (Ho et al., 2020; Hu et al., 2009). همچنین MJ به عنوان یک مولکول سیگنال، سبب تحریک فعالیت آنزیم­های تولیدکننده­ ROS (NADPH اکسیداز) و تولید ROS بیشتر می­شود. تولید بیش از حد رادیکال­های آزاد، سلول را دچار تنش اکسیداتیو می­کند. حضور غلظت بالایی از رادیکال­های آزاد در سلول، سلول را دچار آسیب می­کند. برای جلوگیری از آسیب به سلول، سیستم آنتی‌اکسیدانی آنزیمی و غیر آنزیمی سلول از جمله متابولیت‌های ثانویه از جمله فنل­ها وارد عمل می­شود که به پاک‌سازی و مقابله با رادیکال های آزاد می­پردازد (Ho et al., 2020). بنابراین، با توجه به اهمیت گیاه مفرو از نظر دارویی و پژوهش­های بسیار اندک انجام شده بر روی این گیاه، هدف از انجام این پژوهش بررسی اثر غلظت‌های مختلف متیل­جاسمونات به عنوان یک محرک زیستی بر رشد و تولید ترکیبات فنلی به عنوان بخشی از سیستم دفاع آنتی­اکسیدانی غیر آنزیمی و تأثیر بر فعالیت آنزیم PAL و TAL در مسیر بیوسنتز این ترکیبات در کالوس گیاه D. polychaetum Bornm. است.

مواد و روش‌ها

القاء کالوس و تیمار متیل جاسمونات

بذرهای گیاه D. poltchaetum پس از استریل شدن جهت رشد هیپوکوتیل، به مدت 28 روز در محیط MS+10 mg/l GA₃    کشت و سپس در تاریکی و دمای 2±23 سانتی­گراد قرار داده شدند. سپس هیپوکوتیل به دست آمده به عنوان ریز نمونه جهت القاء کالوس در محیط کشت MS+4mg/L BAP+1.5mg/L NAA به همراه 20 گرم در لیتر ساکاروز و آگار 6/0%  قرار داده شد (Taghizadeh et al., 2020). جهت تیماردهی، پس از چند مرحله واکشت، کالوس­ها به محیط کشت حاوی غلظت‌های0، 10، 25، 50، 100 و 150 میکرومولار متیل جاسمونات منتقل شدند. پس از گذشت 14 روز از تیماردهی، کالوس­ها برداشت و جهت اندازه‌گیری پارامترهای رشد و فیزیولوژیکی، در دمایºC70 - نگهداری شدند.

سرعت رشد کالوس

جهت بررسی اثر غلظت‌های مختلف تیمار متیل جاسمونات بر رشد کالوس، اختلاف وزن تر سلول‌ها در روز صفر و روز 14 (انتهای مدّت تیماردهی) و میانگین سرعت رشد کالوس (CGR) (Callus Growth Rate) با اندازه‌گیری اختلاف قطر کالوس در روز‌های صفر، 7 و 14 مورد بررسی قرار گرفت (Golkar et al., 2017).

محتوای فنل کل، فلاونوئید و فلاونول‌ها

500 میلی­گرم از وزن تر کالوس برداشت شده در روز 14 به همراه 2 میلی‌لیتر متانول 80% سائیده شد و هموژنات حاصل به مدّت 15 دقیقه و با دور rpm 3000 شد و محلول رویی جهت اندازه‌گیری محتوای فنل کل، فلاونوئید کل و فلاونول مورد استفاده قرار گرفت. جهت اندازه گیری محتوای فنل کل از روش Folin-ciocalteau، به 250 میکرولیتر از عصاره متانولی، 750 میکرولیتر معرف  Folin-ciocalteu ( 10 %) اضافه و ورتکس شد. سپس 500 میکرولیتر سدیم کربنات 5/7 % اضافه شد و نمونه­ها به مدت 75 دقیقه در دمای محیط و تاریکی انکوبه شدند. مقدار جذب نمونه­ها در طول موج 765 نانومتر در مقابل بلانک خوانده و سپس محاسبه محتوای فنل کل توسط منحنی استاندارد گالیک اسید انجام شد. نتایج حاصل بر حسب میلی­گرم گالیک اسید بر حسب گرم وزن تر سلول گزارش شد (Singleton et al., 1999).

جهت اندازه‌گیری محتوای فلاونوئید از روش آلومینیوم کلراید (Chang et al., 2002) استفاده شد. ابتدا به 100 میکرولیتر عصاره، 200 میکرولیتر متانول 80% ،200 میکرولیتر آلومینیوم کلراید (10%) و 200 میکرولیتر محلول سدیم استات یک مولار اضافه شد و پس از اندکی ورتکس کردن به مدت 30 دقیقه در تاریکی و دمای اتاق نگهداری شد. مقدار جذب نمونه­ها در طول موج 415 نانومتر اندازه‌گیری و نتایج حاصل با منحنی استاندارد کوئرستین و برحسب میلی­گرم کوئرستین بر گرم وزن تر سلول­ها گزارش شد.

برای اندازه‌گیری محتوای فلاونول، 250 میکرولیتر عصاره به همراه 250 میکرولیتر محلول آلومینیوم کلرید 2% و 5/1 میلی‌لیتر محلول سدیم استات 5% ترکیب شده و به مدت 5/2 ساعت در تاریکی و در دمای اتاق قرار گرفت. جذب کمپلکس زرد رنگ تشکیل شده در طول موج 440 نانومتر خوانده شد. مقدار فلاونول موجود در هر نمونه به کمک منحنی استاندارد کوئرستین و برحسب میلی­گرم کوئرستین بر گرم وزن تر سلول‌ها گزارش شد.

فعالیت آنزیم‌های PAL و TAL

برای استخراج و سنجش فعالیت آنزیم­های PAL بر اساس روش Beaudoin و همکاران (Beaudoin-Eagan & Thorpe, 1985) 300 میلی­گرم از کالوس تازه با 5/1 میلی­لیتر بافر تریس – کلریدریک اسید50 میلی مولار (8=pH) حاوی 2-مرکاپتو اتانول 4/14 میلی مولار و 5% PVP (Polyvinylpyrrolidone) درون هاون چینی روی یخ (دمای ºC4) هموژنایزر شد. سپس مخلوط حاصل به مدت 20 دقیقه و با دور rpm 10000  در دمای ºC4 سانتریفیوژ و محلول رویی جداسازی و به لوله­های جدید منتقل شد.

برای سنجش فعالیت آنزیم PAL به 8/1 میلی‌لیتر بافر واکنش تریس- هیدروکلریک اسید 500 میکرو مولار (8=pH) حاوی 6 میکرومول فنیل آلانین به عنوان سوبسترای آنزیمPAL  و جهت انجام واکنش بین آنزیم و سوبسترا، نمونه­ها به مدّت 60 دقیقه در بن ماری با دمای 37 درجه سانتی­گراد قرار گرفت و در انتها با افزودن 50 میکرولیتر محلول هیدروکلریک اسید 5 نرمال به مخلوط واکنش، واکنش آنزیمی متوقف شد و مقدار ترانس-سینامیک اسید تشکیل شده، محصول آنزیم PAL، با خواندن شدت جذب در طول موج 290 نانومتر با اسپکتروفتومتر انجام شد. فعالیت ویژه آنزیم PAL با در نظر گرفتن ضریب خاموشی آن­ محاسبه و برحسب نانو مول تولید محصول در میلی‌گرم پروتئین کل بر گرم وزن تر کالوس گزارش شد.

جهت سنجش میزان فعالیت آنزیم TAL، به 8/1 میلی­لیتر بافر تریس- کلریدریک اسید 500 میکرومولار (8=pH) حاوی 5/5 میکرو مول تیروزین به عنوان سوبسترا، 200میکرولیتر عصاره­ی آنزیمی اضافه شد و جهت انجام واکنش بین آنزیم و سوبسترا، نمونه­ها به مدت 60 دقیقه در بن ماری با دمای 37 درجه سانتی گراد قرار گرفت و در انتها با افزودن 50 میکرولیتر محلول هیدروکلریک اسید 5 نرمال به مخلوط واکنش، واکنش آنزیمی متوقف شد. مقدار p-کوماریک اسید تشکیل شده، حاصل فعالیت آنزیم TAL، با اندازه­گیری شدت جذب در طول موج 333 نانومتر به کمک دستگاه اسپکتروفتومتر بررسی و فعالیت ویژه­ی آنزیم بر حسب نانومول p-کوماریک اسید تولید شده در میلی­گرم پروتئین کل بر گرم وزن تر کالوس گزارش شد (Beaudoin-Eagan & Thorpe, 1985).

ﺗﺠﺰﯾـﻪوﺗﺤﻠﯿـﻞ آﻣﺎری دادهﻫﺎ ﺑﺎ ﻧـﺮم اﻓـﺰار آﻣـﺎری SPSS نسخه 26 اﻧﺠـﺎم ﺷـــﺪ.  ﻣﻘﺎﯾﺴــﻪ میانگین داده­ها با آزمون دانکن در ﺳـﻄﺢ اﺣﺘﻤﺎل5درﺻﺪ اﻧﺠﺎم ﺷﺪ. ﺑـﺮای رﺳـﻢ ﻧﻤﻮدارﻫـﺎ از ﻧﺮم اﻓﺰار Excel اﺳﺘﻔﺎده ﺷﺪ.

نتایج

اثر متیل جاسمونات بر رشد کالوس

جهت بررسی تأثیر متیل جاسمونات بر رشد سلول‌ها، اختلاف وزن تر سلول‎ها در ابتد (روز صفر) و انتهای تیمار (روز 14) و همچنین میانگین سرعت رشد کالوس در روزهای 0، 7 و 14 مورد بررسی قرار گرفت. همانطور که در شکل 1-a مشاهده می‌شود، غلظت‌های 10، 25 و 50 میکرومولار متیل جاسمونات سبب افزایش وزن تر کالوس نسبت به شاهد شدند. این افزایش در تیمار 10 و 50 میکرومولار متیل جاسمونات نسبت به شاهد معنی­دار بود. بیشترین افزایش در وزن تر در تیمار 50 میکرومولار (67/1 برابر بیشتر نسبت به شاهد) مشاهده شد. با افزایش غلظت تیمار به 100 و 150 میکرومولار، متیل جاسمونات سبب کاهش معنی­دار در وزن تر و رشد کالوس‌ها شد. در سلول‌های تیمار شده با بیشترین غلظت متیل جاسمونات کاهش رشد 53 درصدی در وزن تر کالوس نسبت به شاهد مشاهده شد. همچنین میانگین سرعت رشد کالوس در این پژوهش روندی مشابه با اختلاف وزن تر سلول‌ها نشان داد. متوسط نرخ رشد در کالوس‌های تحت تیمار با غلظت‌های پائین متیل جاسمونات نسبت به شاهد افزایش معنی­دار و با افزایش غلظت تیمار روند کاهشی در نرخ رشد مشاهده شد. غلظت­های 10 و 25 میکرومولار متیل جاسمونات سبب افزایش معنی­داری (به ترتیب 46/1 و 66/1 برابری) در میانگین سرعت رشد کالوس در مقایسه با شاهد شد. نرخ سرعت رشد در غلظت 50 و 100 میکرومولار تفاوت معنی­داری نسبت به نمونه شاهد نشان نداد و در کالوس­های تیمار شده با غلظت 150 میکرومولار، کاهش 48/31 درصدی نسبت به نمونه شاهد مشاهده شد (شکل 1-b).

شکل 1- اثر غلظت‌های مختلف متیل جاسمونات بر وزن تر (a) و نرخ رشد (b) در کالوس گیاه D. polychaetum. ∆: تفاوت وزن تر کالوس در روز صفر و 14. مقادیر براساس میانگین سه تکرار  SE نشان داده شده و حروف نامشابه معرف معنی­دار بودن براساس آزمون دانکن (P≤0.05) است.

Figure 1- Effect of the methyl jasmonate (MJ) concentrations (0, 10, 25, 50, 100 and 150 μM) on the (a) Fresh weight, and (b) Callus growth rate (CGR) in D. polychaetum callus. ∆: The weight difference of the callus from Day 0 to Day 14. Data are mean values of three replicates ± SE. Dissimilar letters indicate significant differences based on Duncan’s test (P≤0.05).

اثر متیل جاسمونات بر محتوای فنل کل، فلاونوئید و فلاونول‌ها

در این پژوهش محتوای فنل کل، فلاونوئید و فلاونول‌ها تحت تأثیر غلظت‌های مختلف متیل جاسمونات مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد غلظت‌های 25 و 50 میکرومولار متیل جاسمونات محتوای فنل کل را به طور معنی­دار و به ترتیب 56/1 و 68/1 برابر نسبت به نمونه شاهد افزایش داد در حالی­که سایر غلظت‌های تیمار سبب ایجاد تفاوت معنی­داری در محتوای فنل کل نسبت به نمونه شاهد نشدند (شکل 2-a). کالوس‌های تحت تیمار با غلظت‌های 25، 50، 100 و 150 میکرومولار متیل جاسمونات همگی افزایش معنی­داری در محتوای فلاونوئید کل نسبت به شاهد نشان دادند. اگرچه بین این غلظت‌های تیمار اختلاف معنی­داری وجود نداشت، با این حال با افزایش غلظت تیمار، محتوای فلاونوئیدی روند افزایشی از خود نشان داد. در کالوس‌های تیمار شده با غلظت 10 میکرومولار متیل جاسمونات کاهش معنی­داری در محتوای فلاونوئیدی مشاهده شد (شکل2-b). محتوای فلاونول در کالوس‌های تحت تیمار با تمامی غلظت‌‌های متیل جاسمونات به غیر از غلظت 25 میکرومولار نسبت به نمونه شاهد به طور معنی­داری افزایش یافت. این افزایش در کالوس تحت تیمار با غلظت 100 میکرومولار به حداکثر مقدار خود رسیده و محتوای فلاونول در این غلظت از تیمار حدود 4/2 برابر نسبت به سلول‌های شاهد بیشتر بود (شکل 2-c).

شکل 2- تأثیر غلظت‌های مختلف متیل جاسمونات بر محتوای فنل کل (a)، فلاونوئید (b) و فلاونول (c) در کالوس گیاه D. polychaetum. مقادیر براساس میانگین سه تکرار  SE نشان داده شده و حروف نامشابه معرف معنی دار بودن براساس آزمون دانکن (P≤0.05) است.

Figure 2: Effect of the methyl jasmonate (MJ) concentrations (0, 10, 25, 50, 100 and 150 μM) on the (a) total phenol content; (b) flavonoid content and (c) flavonol content in D. polychaetum callus. Data are mean values of three replicates ± SE. Dissimilar letters indicate significant differences based on Duncan’s test (P≤0.05).

اثر متیل جاسمونات بر فعالیت آنزیم PAL و TAL

براساس نتایج شکل3، تیمار کالوس با غلظت‌های مختلف متیل جاسمونات سبب افزایش معنی­دار فعالیت آنزیم‌های فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL) و تیروزین آمونیالیاز (TAL)، آنزیم‌های کلیدی و آغازگر مسیر بیوسنتز فنیل پروپانوئیدها، شد. غلظت­های 10، 25، 50 و 100 میکرومولار متیل جاسمونات به طور معنی­داری سبب افزایش فعالیت آنزیم TAL نسبت به شاهد شد. بیشترین فعالیت آنزیم TAL مربوط به تیمار 50 میکرومولار بود که افزایشی02/3 برابری نسبت به شاهد نشان داد (شکل 3-a). کالوس‌های تحت تیمار با غلظت 25 و 50 میکرومولار متیل جاسمونات نیز افزایش معنی‌داری در فعالیت آنزیم PAL نسبت به شاهد نشان دادند. مشابه با آنزیم TAL، بیشترین افزایش در فعالیت آنزیم PAL نیز در کالوس تحت تیمار 50 میکرومولار متیل جاسمونات مشاهده شد، که این افزایش حدود 36/2 برابر بیشتر نسبت به نمونه شاهد بود (شکل 3-b).

شکل 3- اثر غلظت‌های مختلف متیل جاسمونات بر فعالیت آنزیم‌های  (a) تیروزین آمونیالیاز (TAL) و (b) فنیل‌آلانین آمونیالیاز (PAL) در کالوس گیاه D. polychaetum. مقادیر براساس میانگین سه تکرار  SE نشان داده شده و حروف نامشابه معرف معنی دار بودن براساس آزمون دانکن (P≤0.05) است.

Figure 3. Effect of the methyl jasmonate (MJ) concentrations (0, 10, 25, 50, 100 and 150 μM) on the (a) TAL activity and (b) PAL activity in D. polychaetum callus. Data are mean values of three replicates ± SE. Dissimilar letters indicate significant differences based on Duncan’s test (P≤0.05).

همبستگی بین صفات مختلف

همبستگی بین صفات بررسی شده در جدول 1 قابل مشاهده است. بین صفات بررسی شده فلاونوئید و فلاونول نسبت به افزایش غلظت تیمار همبستگی مثبت و معنی­دار نشان دادند و سایر صفات با نسبت به افزایش غلظت تیمار همبستگی منفی نشان دادند. بین وزن تر کالوس با صفات اندازه‌گیری شده مانند نرخ رشد کالوس، محتوای فنل کل و فعالیت آنزیم‎های PAL و TAL همبستگی مثبت و معنی­داری مشاهده شد. در حالی‌که بین این صفت و محتوای فلاونوئید و فلاونول همبستگی منفی مشاهده شد که این همبستگی تنها در محتوای فلاونوئیدی معنی­دار بود. نرخ رشد کالوس علاوه بر وزن تر تنها با محتوای فلاونوئیدی همبستگی مثبت و معنی­داری نشان داد و همبستگی بین نرخ رشد و سایر صفات معنی­دار نبود. محتوای فلاونوئیدی و فلاونولی بررسی شده با یکدیگر همبستگی مثبت و معنی­داری نشان دادند. محتوای فنل کل همبستگی مثبت، معنی­دار و قابل توجهی با فعالیت آنزیم PAL و TAL نشان داد. همچنین همبستگی میان فعالیت آنزیم PAL و فعالیت آنزیم TAL نیز مثبت و معنی­دار بود.

جدول 1- ضرایب همبستگی بین صفات مختلف در کالوس گیاه D. polychaetum تحت غلظت­های مختلف متیل جاسمونات. MJ: متیل جاسمونات، CGR: نرخ رشد کالوس، FW: وزن تر، TPC: محتوای فنل کل، TFD: محتوای فلاونوئید، TFL: محتوای فلاونول، PAL: آنزیم فنیل‌آلانین آمونیالیاز و TAL: آنزیم تیروزین آمونیالیاز.

Table 1- Trait correlation between different traits of D. polychaetum callus under methyl jasmonate treatment. MJ: Methyl jasmonate, CGR: Callus growth rate. FW: fresh weight, TPC: total phenolic compound, TFD: total flavonoid content, TFL: total flavonol content, TAL: tyrosine ammonia lyase, PAL: phenylalanine ammonia-lyase.

** معنی­داری در سطح 1% و * معنی داری در سطح 5%

* and ** significant at P≤ 0.05 and P≤0.01 respectively

تجزیه مولفه­های اصلی (PCA)

نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل اجزای اصلی (PCA) دسته­بندی بین کالوس­های شاهد و تحت تیمار با غلظت­های مختلف متیل جاسمونات را تأئید کرد و روابط بین صفات مورد پژوهش را نشان داد (شکل 3). اجزای اصلی (PC₁) و (PC₂) به ترتیب 67/97 و 32/3 درصد از کل واریانس در سلول­های تیمار شده و شاهد را تشکیل می­دهند. بر این اساس، سلول های تحت تیمار با متیل­جاسمونات به چهار گروه تقسیم­بندی شدند. گروه اول شامل کالوس‌‌های شاهد بود. کالوس­های تیمار شده با غلظت­های 10 و 25 میکرومولار متیل­جاسمونات گروه دوم را تشکیل دادند که به دلیل مقدار وزن تر و سرعت رشد نسبی بیشتر در یک گروه قرار گرفتند. طبق تجزیه و تحلیل PCA، غلظت 50 میکرومولار متیل جاسمونات سبب افزایش مقدار فنل کل، فلاونول، آنزیم PAL و TAL شد که گروه سوم کالوس­های تحت تیمار با متیل جاسمونات را تشکیل دادند. همچنین، سلول­های تحت تیمار با غلظت­های بالاتر، 100 و 150 میکرومولار متیل جاسمونات گروه چهارم را تشکیل دادند که سطح قابل توجهی از فلاونوئید را نشان دادند.

شکل 4- ﻧﻤﺎﯾﺶدوﺑﻌﺪی تجزیه مولفه های اصلی (PCA) ﺻﻔﺎت مورد بررسی تحت تیمار متیل جاسمونات (0، 10، 25، 50، 100 و 150 میکرومولار). CGR: نرخ رشد کالوس، FW: وزن تر، TPC: محتوای فنل کل، TFC: محتوای فلاونوئید، PAL: آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز و TAL: آنزیم تیروزین آمونیالیاز.

Figure 4- PCA biplot of the analyzed responses of D. polychaetum callus to methyl jasmonate (0, 10, 25, 50, 100 and 150 μM) treatments. CGR: Callus growth rate. FW: fresh weight, TPC: total phenolic compound, TFC: total flavonoid content, TAL: tyrosine ammonia lyase, PAL: phenylalanine ammonia-lyase.

بحث

جاسمونات­ها گروهی از هورمون­های گیاهی هستند که در کنار سایر هورمون­های درون گیاه متناسب با سیگنال­های درون و برون سلولی رشد، نمو و دفاع گیاهان را تنظیم می­کنند (Sohn et al., 2022). به کارگیری محرک‌ها در افزایش سنتز متابولیت‌های ثانویه، می‌تواند همراه با تغییرات زی‌توده نیز باشد. بر اساس نتایج به­دست آمده از شکل 1 و نتایج حاصل از PCA، غلظت‌های پائین متیل جاسمونات رشد را تحریک و غلظت‌های بالا سبب مهار رشد شد. نتایج حاصل از ضریب همبستگی تأیید­کننده این ارتباط است که بین رشد و غلظت­های مختلف متیل جاسمونات رابطه عکس وجود دارد (جدول 1). احتمالاً غلظت‌های پائین متیل جاسمونات سبب تحریک رشد و تقسیم سلولی شده و مهار رشد در غلظت‌های بالای متیل جاسمونات را می‌توان به نقش فیزیولوژیک آن در بروز پاسخ‌های پیری، تخریب کلروفیل و کاهش سیتوکینین‌های فعال نسبت داد (Andi et al., 2019; Sohn et al., 2022). همچنین ممکن است تنش اکسیداتیو و تولید بیش از حد رادیکال‌های آزاد درون سلول‌های تحت تیمار با غلظت‌های بالای متیل جاسمونات دلیلی بر مهار رشد باشد (Yazdanian et al., 2021). مشابه با نتایج به دست آمده در این پژوهش، کالوس گیاه Carum carvi نیز تحت تیمار با غلظت پائین متیل جاسمونات (25 میکرومولار) بیشترین نرخ رشد را نشان داد و با افزایش غلظت تیمار مهار رشد مشاهده شد (Rahmati et al., 2023). همچنین بر اساس پژوهشی، غلظت 25 میکرومولار متیل جاسمونات سبب افزایش رشد در سوسپانسیون سلولی دو گونه‌ی O. basilicum و O. sanctum شد، که با افزایش غلظت متیل جاسمونات رشد کاهش یافت (Mathew & Sankar, 2012). در کالوس گیاه Allium jesdianum تحت تیمار با غلظت‌های 0، 25، 50 و 100 میکرومولار متیل جاسمونات، با افزایش غلظت تیمار، کاهش نرخ رشد و وزن تر مشاهده شد (Yazdanian et al., 2021). احتمالا غلظت بالای متیل جاسمونات بطور مستقیم و غیر مستقیم از طریق ایجاد تنش اکسیداتیو و تولید بیش از حد رادیکال‌های آزاد درون سلولی سبب آسیب به سلول، کاهش رشد و کاهش تولید ترکیبات فنلی با اثر گذاری بر مسیر بیوسنتز این ترکیبات شده است.

ترکیبات فنلی بخشی از سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانی غیرآنزیمی هستند و متیل­جاسمونات به عنوان مولکول سیگنال، با اثر بر بیان ژن­های پاسخ­های دفاعی، بیان عوامل تنظیمی ( فعال‌کننده و یا مهار­کننده­ها) ژن­های کدکننده­ آنزیم­های مسیر بیوسنتز متابولیت­های ثانویه، به تنظیم مسیر­های بیوسنتز کننده آن­ها و تجمع این ترکیبات در سلول و خنثی­سازی رادیکال­های آزاد و مقابله با تنش اکسیداتیو می­پردازند (Gharechahi et al., 2013; Li et al., 2022). این ترکیبات به علت حضور گروه‌های هیدروکسیل و متوکسی فراوان در ساختمان خود، به الکترون و هیدروژن دهندگان قوی تبدیل شده­اند که پتانسیل بالایی در به دام انداختن و خنثی­سازی رادیکال‌های آزاد دارند (Dumanović et al., 2021). این آنتی‌اکسیدان‌های قوی با روش­های متعددی مانند جاروب کردن رادیکال­های آزاد، انتقال هیدروژن، خاموش کردن اکسیژن یکتایی، کلات کردن یون‌های فلزی و همکاری با پراکسیدازها جهت پاکسازی H₂O₂ به خنثی سازی عوامل اکسید کننده و رادیکال­های آزاد در سلول می­پردازند. فنل­ها در واکنش آنتی­اکسیدانی خود به رادیکال­های فنوکسیل تبدیل شده و با واکنش با آسکوربات احیاء شده و به حالت اولیه­ی خود باز می­گردند (Khanpour-Ardestani, 2015). بر اساس نتایج حاصل، افزایش متیل جاسمونات سبب افزایش محتوای ترکیبات فنلی، فلاونوئید و فلاونول شد. در تأئید این موضوع، بررسی ضریب همبستگی بین صفات مختلف نشان داد که بین غلظت متیل جاسمونات با فلاونول و فلاونوئید همبستگی مثبت و معنی­داری وجود دارد که نشان می­دهد با افزایش غلظت متیل جاسمونات و احتمالا افزایش تنش ایجاد شده در سلول، تولید و تجمع این ترکیبات در جهت تقویت سیستم دفاعی سلول افزایش یافته است. بر اساس پژوهش­های پیشین، نقش محرک‌ها در افزایش تولید و تجمع متابولیت‌های ثانویه در کشت درون شیشه‌ای بارها گزارش شده­است (Ram et al., 2013). متیل­جاسمونات با فعالیت سیگنالینگ خود به فعال­سازی سیستم دفاع آنتی­اکسیدانی گیاه و بیوسنتز ترکیبات فنلی پرداخته است. احتمالا سلول جهت مقابله با اثرات مخرب رادیکال­های تولید شده، تجمع ترکیبات فنلی، فلاونوئید­ها و فلاونول­ها را افزایش داده است. با این حال در غلظت‌های بالای تیمار اندکی کاهش در محتوای فنلی کل مشاهده می‌شود که احتمالا ناشی از تولید بیش از حد رادیکال‌های آزاد از جمله ROS (گونه‌های فعال اکسیژن) در غلظت‌های بالای تیمار و آسیب به غشاءهای زیستی و قرارگیری ترکیبات فنلی در معرض آنزیم‌های اکسیدکننده خود، پلی فنل اکسیدازها، باشد (Hashemyan et al., 2020). همچنین ممکن است رادیکال‌های آزاد اضافی وارد واکنش با اجزای درون سلول از جمله پروتئین‌ها، آنزیم‌ها و یا اسیدهای نوکلئیک شده و سبب تغییر در بیان ژن‌ها و آنزیم‌های موثر در مسیر بیوسنتز ترکیبات فنلی شده باشد. مشابه با نتایج به دست آمده در این پژوهش، محتوای فنلی در کالوس گیاه Carum carvi نیز در غلظت‌های 25 و 50 میکرومولار متیل جاسمونات بیشترین مقدار را به خود اختصاص داده است و غلظت بالای تیمار سطوح پائین­تری از ترکیبات فنلی را شامل شده است (Rahmati et al., 2022). همچنین نتایج بررسی اثر تیمار غلظت‌های 25، 50 و 100 میکرومولار متیل جاسمونات بر کالوس Allium jesdianum نشان داد، تمامی غلظت‌های تیمار سبب افزایش در محتوای فنل کل، فلاونوئید کل و فلاونول‌های کالوس این گیاه نسبت به نمونه شاهد شدند و تیمار 50 میکرومولار متیل جاسمونات سبب بیشترین افزایش در محتوای فنلی این گیاه شد (Yazdanian et al., 2021). پژوهش­های دیگر انجام شده بر سوسپانسیون سلولی Thevetia peruviana (Mendoza et al., 2018)، کالوس گیاه Teucrium polium (Hashemyan et al., 2020). و سوسپانسیون سلولی Hypericum perforatum (Wang et al., 2015). همگی تائید کننده نقش متیل جاسمونات بر افزایش محتوای فنلی و فلاونوئیدی گیاهان تحت تیمار است.

تحریک فعالیت آنزیم‌های کلیدی مسیر بیوسنتز ترکیبات فنلی منجر به تولید تجمع ترکیبات فنیل پروپانوئیدی در سلول می شود. در این پژوهش همگام با افزایش فعالیت آنزیم‌های PAL و TAL به عنوان آنزیم‌های کلیدی و تنظیم‌کننده مسیر فنیل پروپانوئید، تجمع ترکیبات فنلی، فلاونوئیدی و فلاونولی در کالوس‌های تحت تیمار با متیل جاسمونات افزایش یافت. این دو آنزیم یکی از مهم‌ترین شاخص‌های حساس به تغییرات محیطی وهمچنین یکی از نشانگرهای بیوشیمیایی دفاعی گیاه در برابر تنش­های محیطی مطرح می­شود (Ferrer et al., 2008). تنش به سرعت بر بیان ژن PAL و TAL اثر گذاشته و تولید ترکیبات فنلی را در گیاه برای مقابله با شرایط تنش افزایش می‌دهد. تیماردهی سلول‌های گیاهی با محرک‌هایی مانند متیل جاسمونات با ایجاد شرایط تنش، سلول گیاهی را به سمت بروز پاسخ‌های دفاعی از جمله سنتز آنتی اکسیدان‌های فنلی که لازمه آن اثر بر بیان ژن‌های کد کننده و یا فعالیت آنزیم‌های کلیدی مسیر بیوسنتز آن است، می برد (Bavi et al., 2021; Ehsanpour &,Maleki, 2018; Zhang & Liu, 2015). از این رو می­توان افزایش محتوای فنلی، فلاونوئیدی و فلاونولی در این پژوهش را می‌توان ناشی از فعالیت آنزیم‌های PAL و TAL دانست. وجود همبستگی مثبت و معنی­دار بین این آنزیم­ها با محتوای ترکیبات فنلی می­تواند تائید کننده این موضوع باشد. همچنین وجود همبستگی مثبت معنی­دار بین ترکیبات فنلی، فعالیت آنزیم­های PAL وTAL با وزن تر نشان دهنده نقش مثبت این ترکیبات و مسیر بیوسنتز آن­ها در حفظ رشد و حفاظت از سلول در برابر غلظت­های متیل جاسمونات است. در پژوهش انجام شده توسط Ben Romdhane و همکاران (2022). هم­راستا با افزایش فعالیت آنزیم PAL و TAL در اثر تیمار با متیل­جاسمونات محتوای فنل و فلاونوئید کل در گیاه Phoenix dactylifera افزایش یافت. در پژوهش دیگری نیز به همبستگی میان افزایش در فعالیت آنزیم PAL و محتوای ترکیبات فنلی اشاره شده­است (Rubio et al., 2021). همچنین تیمار با جاسمونیک­اسید فعالیت آنزیم PAL و TAL و محتوای کل ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی را در برگ­های گیاه ریحان نسبت به شاهد افزایش داد (Złotek et al., 2016). در این پژوهش بیشترین افزایش در فعالیت آنزیم‌های PAL و TAL هم راستا با بیشترین مقدار ترکیبات فنلی در کالوس‌های تیمار شده با غلظت 50 میکرومولار متیل جاسمونات بود.

جمع­بندی

در این پژوهش به بررسی اثر غلظت­های مختلف متیل جاسمونات بر رشد و تولید ترکیبات فنلی در کالوس گیاه D. polychaetum پرداخته شد. بر اساس نتایج، متیل­جاسمونات به عنوان یک تنظیم کننده­ی رشد در غلظت­های کم با اثرات مثبت القایی سبب افزایش رشد شد. همچنین این محرک از طریق ایجاد گونه­های فعال اکسیژن سبب تحریک فعالیت آنزیم‌های PAL و TAL و افزایش تولید ترکیبات فنلی، فلاونوئیدها و فلاونول‌ها در کالوس گیاه D. polychaetum. شد. در این پژوهش غلظت­های 25 و50 میکرومولار متیل جاسمونات سبب بیشترین افزایش در محتوای ترکیبات فنلی همراه با اثر مثبت بر رشد کالوس شد، که این غلظت­های تیمار می­تواند به عنوان یک القا کننده رشد و تولید ترکیبات فنلی در نظر گرفته شد. نتایج حاصل از بررسی ضریب همبستگی بین تولید ترکیبات فنلی، رشد و فعالیت آنزیم­های PAL و TAL با تیمار MJ تائید کننده این موضوع است.

سپاسگزاری

نویسندگان این مقاله مراتب قدرانی خود را از دانشگاه اصفهان به منظور حمایت از انجام این پژوهش ابراز می­کنند.