تاثیر کاربرد برگی کلسیم و تلقیح با قارچ اندوفیت Serendipita indica بر بهبود رشد، رنگیزه‌های فتوسنتزی و افزایش ظرفیت آنتی‌اکسیدانی انگور بی‌دانه سفید تحت تنش خشکی

مقدمه

تغییر مداوم آب و هوا، افزایش دما،  بارندگی‌ نامنظم و تغییر الگوهای موسمی باعث خشکسالی‌های مکرر در سراسر جهان شده است که تهدیدی جدی برای بهره‌وری کشاورزی است. میزان تولید و کیفیت محصولات کشاورزی تا حد زیادی تحت تأثیر طیف وسیعی از تنش‌های غیرزیستی نظیر خشکی، شوری، گرما و سرما قرار می‌گیرد (Beheshti rooy et al., 2017). خشکی مهمترین عامل محدود‌کننده‌ی تولیدات کشاورزی از جمله محصولات باغبانی به‌شمار می‌رود که گیاه را از رسیدن به حداکثر توان محصول‌دهی بازمی‌دارد و تقریبا تولید 25 درصد زمین‌های کشاورزی و 45 درصد از عملکرد محصولات زراعی جهان را کاهش داده است (Kafi et al., 2008). تنش خشکی اثرات چندگانه‌ای بر خصوصیات مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی گیاه بر‌جای گذاشته که ازآن جمله می‌توان به کاهش عملکرد اقتصادی، کاهش پتانسیل آب، محتوای نسبی‌آب‌برگ، سنتز پروتئین، مقدارکلروفیل، هدایت روزنه‌ای و نرخ فتوسنتز اشاره نمود. تنش خشکی سبب تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن می‌شوند که این رادیکال‌ها به نوبه خود منجر به پراکسیداسیون لیپید، تغییر ساختار غشاء، نشت یون، آسیب به درشت مولکول‌های زیستی و در نهایت بازدارندگی رشد گیاه می‌شوند. گیاهان دارای یک دستگاه دفاعی کارآمد هستند که از آنتی اکسیدان‌های آنزیمی (مانند CAT، POD و APX) و غیر آنزیمی برای حفظ سطح بهینه ROS تشکیل شده است. فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان موجب کاهش ROSها و جلوگیری از اختلال در متابولیسم لیپیدها، پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک‌ شده و اثرات مخرب ناشی از این رادیکا‌لها را کاهش می‌دهد (Parveen et al., 2019). وجود رابطه مستقیم بین فعالیت بالای آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان و مقاومت بالا به تنش خشکی در بسیاری از گیاهان در مقالات زیادی گزارش شده است. همچنین در مقالات زیادی به تاثیر تلقیح با قارچ و تیمار با کلسیم بر افزایش میزان فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان و کاهش ROSها اشاره شده است (Verma et al., 2022; Kaboosi et al., 2023).

انگور (Vitis.vinifera L) از خانواده Vitaceae یکی از مهم‌ترین درختان میوه جهان است که به‌صورت وسیع کشت می‌شود و تقریباً یک‌چهارم سهم تولید میوه جهان را به خود اختصاص می‌دهد. فرآورده‌های انگور از اهمیت اقتصادی زیادی برخوردار بوده و ایران نیز یکی از تولیدکنندگان عمده این میوه به شمار می‌آید (Ahmadi, 2015). گونه Vitis vinifera در گروه گونه‌های تاک اوراسیایی قرار دارد و پراکنش آن بین عرض‌های جغرافیایی 30 تا 50 درجه شمالی می‌باشد. انگور بی‌دانه سفید متعلق به گونه Vitis vinifera، رقمی است که به‌طور وسیع در اکثر نواحی ایران کشت می‌شود و بیش از یک‌سوم انگورکاری ایران به این رقم تعلق دارد (Anonymous, 2010). تاکنون از روش‌های به‌نژادی و به‌باغی مختلفی برای کاهش اثرات تنش خشکی در گیاهان مختلف و درختان میوه استفاده ‌شده است. در بین روش‌های به‌باغی، کاربرد عناصر غذایی به‌صورت مستقیم یا افزایش جذب عناصر غذایی توسط ریشه به‌واسطه کاربردکودهای زیستی ازجمله روش‌هایی هستند که ضمن بهبود رشد و عملکرد درخت، می‌تواند میزان پایداری آن را در شرایط تنش‌های محیطی بهبود بخشد.

کلسیم به‌عنوان یک کاتیون دو ظرفیتی از جمله عناصر ضروری است که بخشی از آن در ساختمان آپوپلاست و بخش دیگر به‌صورت تبادلی در سطح خارجی غشای‌پلاسمایی وجود دارد (White & Broadley, 2003). کلسیم در ارسال علائم تغییرات محیطی و تنظیم واکنش گیاه از لحاظ رشد و نمو و همچنین در پایداری و تکامل دیواره سلولی و غشای پلاسمایی دارای نقش است. علاوه براین به‌طور غیرمستقیم در تنظیم اسمزی نقش دارد. نقش آبسیزیک اسید در بسته شدن روزنه‌ها به غلظت کلسیم اپیدرم برگ بستگی دارد. کلسیم در اتصال پلی‌ساکاریدها و پروتئین‌های تشکیل‌دهنده‌ی دیواره سلولی نقش داشته (Marschner, 2012) و به‌عنوان یک پیام‌رسان ثانویه در مسیرهای مختلف پیام‌رسانی در گیاه به پیام‌های محیطی و هورمون‌ها واکنش نشان می‌دهد (Antunes et al., 2005). مطالعاتی در زمینه کاربرد کلسیم در مقاومت به تنش‌های غیرزیستی انجام شده است که از آن جمله می‌توان به(2022)  Motakefi, et al وHaghighi & Naghavi (2019)  اشاره کرد. مطالعات نشان می‌دهد که در ﺷﺮاﻳﻂ ﺗﻨﺶﻫﺎی ﻣﺤﻴﻄﻲ ﻛﺎرﻛﺮد اﻳﻦ ﻋﻨﺼﺮ در ﻓﻌﺎﻟﻴﺖﻫﺎی ﺣﻴﺎﺗﻲ گیاه نقش ویژه‌ای در میزان تحمل به تنش ایفاء می‌کند.

روش‌های زیستی مبتنی بر استفاده از پتانسیل ارگانیسم‌های مفید خاکزی، نقش مؤثری در افزایش مقاومت به تنش‌های محیطی ازجمله تنش خشکی برعهده‌ دارند. قارچ Serendipita indica (با نام قبلی Piriformospora indica) یک قارچ اندوفیت شبه‌میکوریزی است که در سال 1998 از خاک‌های مناطق بیابانی ایالت راجستان کشور هندوستان شناسایی شد (Varma et al., 1999). این قارچ با تعداد زیادی از گیاهان عالی تک‌لپه و دولپه‌ای رابطه همزیستی برقرار می‌نمایدکه شامل انواع خشکی‌پسند، بوته‌های یک‌ساله و چندساله و درختان چوبی می‌باشند (Singh et al., 2000). قارچ S. indica بر خلاف قارچ‌های میکوریزی که همزیست اجباری گیاهان میزبان هستند، همزیست اختیاری است و به‌آسانی در محیط‌های کشت مصنوعی قادر به رشد می‌باشد (Varma et al., 2001). تشکیل کلنی در ریشه گیاهان میزبان توسط قارچ باعث افزایش رشد و نمو و همچنین مقاومت به تنش‌های زیستی و غیرزیستی می‌گردد. تاثیر قارچ بر افزایش مقاومت به تنش خشکی در برنج (Mani et al., 2023)، جو (Kaboosi et al., 2023b) و گیاهان دارویی مانند سنبل‌الطیب (Ghabooli et al., 2018) گزارش شده است. در مورد کاربرد کلسیم و تلقیح قارچ S. indica با گیاه انگور در شرایط تنش خشکی، تاکنون بررسی جامعی انجام نشده است. با اینحال، نتایج Karimi, et al (2022)  نشان داد اثرات تلقیح قارچ و کاربرد روی در کاهش تنش سرما در گیاهان انگور موثر است. همچنین، در مطالعه‌ای دیگر مشخص شد استفاده همزمان از نانوذرات کلسیم فسفات و تلقیح با قارچ باعث افزایش رشد و بهبود صفات اندازه‌گیری شده در ذرت می‌گردد (Rane et al., 2015).

با توجه به چالش کم‌آبی در کشور و تأثیر معنی‌دار آن بر کاهش محصولات کشاورزی، و نظر به اهمیت انگور به‌عنوان یک محصول اقتصادی مهم، مطالعه و دست‌یابی به راهبردهایی برای کاهش آثار منفی تنش خشکی در انگور از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. در این زمینه، کاربرد روش‌های به‌باغی مانند کاربرد خارجی عناصر(کلسیم، پتاسیم و ...) و همچنین کاربرد روش‌های زیستی نظیر استفاده از قارچ‌های اندوفیت، نقش مؤثری در افزایش تحمل گیاهان به تنش‌های محیطی دارد. با توجه به عدم وجود مطالعات مشابه، این پژوهش با هدف بررسی تاثیر احتمالی کاربرد کلسیم همراه با کلنیزاسیون ریشه توسط قارچ S. indica بر افزایش مقاومت به تنش خشکی در انگور بی‌دانه سفید انجام شد؛ لذا اثرات انفرادی و متقابل کلسیم و قارچ در شرایط نرمال و تنش خشکی مورد ارزیابی قرار گرفت. برای این کار صفاتی مانند محتوای نسبی آب برگ، رنگیزه‌های فتوسنتزی، کربوهیدرات‌ کل، پروتئین، پرولین، فنول، مالون‌دی‌آلدئید و آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان که از معیارهای مقاومت به تنش‌های غیرزیستی محسوب می‌شوند، مورد بررسی قرار گرفتند.

مواد و روش‌ها

کشت قارچ  S. indica

قارچ مطابق با روش) (Ghabooli, et al 2013 بر روی محیط کشت پیچیده (محیط کشت آسپرژیلوس تغییریافته حاوی عناصر پرمصرف، کم مصرف، عصاره مخمر، پپتون و کازئین) کشت شده و به مدت 4 هفته در دمای 2±28 درجه سلسیوس قرار داده شد. برای تهیه میسلیوم، دیسک‌های فعال قارچ از محیط کشت جامد در ارلن‌های 250 میلی‌لیتری حاوی 100 میلی‌لیتر محیط کشت مایع، کشت و سپس در انکوباتور حاوی شیکر با دمای 2±28 درجه سلسیوس و 150 دور در دقیقه به مدت 10-7 روز قرار داده شدند. در مرحله بعد، میسلیوم‌ها با استفاده از فیلتر کاغذی واتمن شماره 1 از محیط کشت جدا و چندین بار با آب مقطر شستشو داده شدند (Bajaj et al., 2015).

کشت گیاه و تلقیح با قارچ S. indica

این پژوهش به صورت آزمایش فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملا تصادفی با 4 تکرار و با هدف ارزیابی محلول‌پاشی کلسیم و تلقیح با قارچ S. indica بر رشد و فاکتورهای مورفوفیزیولوژیکی در انگور بی‌دانه سفید در شرایط تنش خشکی در گلخانه تحقیقاتی دانشگاه ملایر با طول 48 درجه و 51 دقیقه و عرض جغرافیایی 34 درجه و 19 دقیقه طی سال‌های 1400-1399 انجام شد. تیمارهای آزمایش شامل 2 سطح تیمار کلسیم (صفر و یک درصد)، 2 تیمار قارچی (تلقیح و عدم تلقیح با قارچ) و 3 سطح تنش (2/0- به‌عنوان شاهد، 7/0- و 2/1- مگا پاسکال به ترتیب سطح دوم و سوم تنش خشکی) بود. انتخاب غلظت کلسیم (یک درصد) بر اساس نتایج پژوهش‌های قبلی انجام شد که بیانگر تاثیر مثبت این غلظت می‌باشد.

قلمه‌های انگور (Vitis vinifera) رقم بی‌دانه‌سفید در بهمن ماه 1399 از ایستگاه تحقیقات انگور شهرستان ملایر تهیه و در محیط کشت مناسب ریشه‌‌دار شدند. برای تلقیح قلمه‌های انگور، سوسپانسیون 1% (وزنی به حجمی) میسیلیوم‌های قارچ تهیه و قلمه‌ها به مدت یک ساعت در سوسپانسیون قرار گرفته و سپس در گلدان کشت شدند. گروه دیگر از قلمه‌ها (کنترل) به مدت یک ساعت در آب غوطه‌ور شدند. تیمار عدم تلقیح با علامت اختصاری S₀ و تلقیح‌شده با علامت اختصاری S₁ مشخص شد. تیمار محلول‌پاشی با کلسیم در دو سطح صفر (با علامت اختصاریK₀) و یک درصد (با علامت اختصاری K₁) و با منبع کودی نیترات کلسیم انجام شد. پس از گذشت 10 روز از تلقیح قلمه‌ها، نمونه‌برداری از ریشه گیاهان تلقیح‌شده برای بررسی کلنیزاسیون ریشه با قارچ صورت پذیرفت. در طول دوره رشد نهال‌ها، جهت تغذیه پایه از کود 20-20-20 (NPK) با غلظت 5/0 گرم در لیتر به صورت 3 روز یکبار تا رسیدن به مرحله 15 برگی استفاده شد. تیمارهای تنش خشکی در مرحله 15 یا 16 برگی اعمال و با رسیدن پتانسیل آب خاک به مکش موردنظر  (2/0- به‌عنوان شاهد با علامت اختصاری D₀ و 7/0- و 2/1- مگاپاسکال به‌عنوان تیمارهای خشکی، به ترتیب با علامت اختصاری D₁ و D₂) انجام ‌شد. برای اندازه‌گیری پتانسیل‌آب‌خاک گلدان‌ها برای اعمال بهینه‌ی سطوح تنش خشکی از دستگاه تانسیومتر (Model:PMS-714 شرکت Lutron، کشور تایوان) استفاده شد. پس از اعمال تیمارهای تنش خشکی به مدت دو هفته، نمونه‌برداری از برگ‌های میانی شاخه‌های اصلی و فرعی میانی شاخه انجام شد و نمونه‌ها برای بررسی و اندازه‌گیری صفات زیر به عنوان صفات شاخص در مقاومت به تنش‌های زیستی، در یخچال یا فریزر نگهداری شد.

بررسی صفات فیزیولوژیکی

نسبت وزن خشک برگ به سطح برگ (LMA): برای اندازه‌گیری نسبت وزن خشک برگ به سطح برگ، از هر تیمار شش برگ بالغ و سالم انتخاب و سطح برگ‌ها توسط دستگاه اندازه‌گیری سطح برگ (OT) اندازه‌گیری و سپس برگ‌ها در آون با دمای 70 درجه‌سانتی‌گراد خشک شدند. برای به‌دست آوردن این شاخص وزن خشک برگ به سطح برگ تقسیم ‌شد (Galmes et al., 2007).

محتوای نسبی آب (RWC): محتوای نسبی آب برگ با استفاده از رابطه RWC (%) = [(FW - DW)/ (TW - DW)] × 100 اندازه‌گیری شد که در آن FW، TW و DW به ترتیب وزن تر، وزن آماس و وزن خشک می‌باشد (Kirnak, 2001).

رنگیزه‌های فتوسنتزی: جهت اندازه‌گیری رنگیزه‌های فتوسنتزی (کلروفیل و کاروتنوئیدها) از استون‌80% (v/v) استفاده و میزان جذب نور توسط عصاره استخراج‌شده با دستگاه طیف‌سنج نوری و با استفاده از روابط Lichtenthaler (1987) اندازه‌گیری شد. غلظت کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و کاروتنوئیدها به ترتیب در طول موج‌های 663، 645، 652 و 470 نانومتر تعیین و به‌صورت میلی‌گرم‌ بر گرم وزن برگ تازه بیان شد.

کربوهیدرات‌های محلول: غلظت کربوهیدرات‌های محلول کل با استفاده از روش آنترون و بر مبنای روش Yemm & Willis (1954)  تعیین ‌شد؛ و میزان جذب نمونه‌ها با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول‌موج 620 نانومتر قرائت شد. آنگاه غلظت کربوهیدرات‌های محلول براساس منحنی استاندارد گلوکز تعیین و به‌صورت میلی‌گرم کربوهیدرات محلول در گرم وزن تر بیان شد.

پروتئین‌ محلول کل: برای اندازه‌گیری پروتئین محلول کل از روش کالریمتری Bradford (1976) استفاده شد. در این روش که از منحنی استاندارد حاصل از غلظت‌های معین پروتئین استفاده می‌شود، برای اندازه‌گیری پروتئین به 1/0 میلی‌لیتر عصاره پروتئینی هر نمونه، 5 میلی‌لیتر معرف برادفورد اضافه و به مدت 20 دقیقه ورتکس شد. سپس جذب در طول‌موج 595 نانومتر با استفاده از سرم آلبومین به‌عنوان استاندارد اندازه‌گیری شد.

پرولین: جهت سنجش پرولین از روشBates )  et al., 1973)  استفاده شد. 5/0 گرم بافت تر در 10 میلی‌لیتر سولفوسالیسیلیک اسید 10 درصد سائیده و به‌طور کامل همگن شد. دو میلی‌لیتر از عصاره صاف‌‌شده با دو میلی‌لیتر محلول نین‌هیدرین و دو میلی‌لیتر استیک اسید گلاسیال مخلوط شده و به مدت یک ساعت در حمام آب گرم قرار گرفت. سپس لوله‌ها در حمام یخ قرار داده شدند. واکنش مذکور پایان یافت. چهار میلی‌لیتر تولوئن به محتویات هر لوله اضافه گردید و به مدت 15 ثانیه به‌ شدت هم زده شد. در نهایت فاز رویی که شامل تولوئن و پرولین بود از فاز آبی جدا شد و جذب در طول‌موج 520 نانومتر تعیین گردید.

فنول: برای اندازه‌گیری محنوای فنول کل موجود در برگ، 5/0 گرم نمونه تازه برگ با 4 میلی‌لیتر اتانول مخلوط شده و محلول همگنی تهیه و پس از 20 دقیقه سانتریفیوژ 9500 دور بر دقیقه محلول شفاف رویی جدا شد. میزان 300 میکرولیتر کربنات سدیم 7 درصد و نیم میلی‌لیتر فولین 10 درصد مخلوط و به‌مدت 20 دقیقه در محل تاریک قرار داده شد. پس از طی شدن مدت زمان لازم، میزان جذب توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 725 نانومتر اندازه‌گیری شد و سپس با استفاده از نمودار استاندارد گالیک اسید، میزان فنول بر حسب میلی‌گرم گالیک‌اسید بر وزن تر به‌دست آمد (Velioglu et al., 1998).

پایداری غشاء سلولی (MSI): برای اندازه‌گیری این صفت از رابطه MSI=[1-(C₁-C₂)] ×100 استفاده شد که در آن C₁ نشان‌دهنده‌ی EC مخلوط حاوی قطعه‌های برگ و آب مقطر به‌مدت 30 دقیقه در دمای 25 درجه‌سلسیوس و C₂ نشان‌دهنده EC مخلوط حاوی برگ و آب مقطر در حمام آب 100 درجه‌سلسیوس به‌مدت 10 دقیقه گرما داده شده است (Sivritepe et al., 2008).

مالون‌دی‌آلدئید: غلظت مالون‌دی‌آلدئید(MDA)  مطابق با روش وانگ و همکاران (2009) و با استفاده از تیوباربیتیوریک ‌اسید به‌عنوان معرف اندازه‌گیری شد (Wang et al., 2009).

استخراج آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان: برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان ابتدا عصاره آنزیمی تهیه شد. برای تهیه عصاره، 1/0 گرم بافت پودر شده برگ به تیوب منتقل و بافر استخراج به آن‌ها اضافه ‌شد. پس از عبور از صافی، به مدت 15 دقیقه با سرعت 10000 دور در دقیقه و دمای 4 درجه‌سانتی‌گراد سانتریفیوژ و مایع شفاف رویی جدا و از آن برای اندازه‌گیری فعالیت هریک از آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان به شرح زیر استفاده شد:

کاتالاز و پراکسیداز: برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیم کاتالاز، 50 میکرولیتر از عصاره گیاهی با بافر استخراج و اتیلن‌دی ‌آمین ‌تترا‌استیک ‌اسید آمیخته شد. با اضافه نمودن هیدروژن‌پراکسید به مخلوط، واکنش آنزیم کاتالاز آغاز شد. تغییرات جذب نور نمونه‌ها در طول موج 240 نانومتر ثبت شد. میزان فعالیت آنزیم برحسب واحد در میلی‌گرم پروتئین برگ بیان شد (Bergmeyer, 1970). برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیم پراکسیداز میزان جذب در طول‌موج 470 نانومتر قرائت شد (Hemeda & Kelin, 1990).

سوپراکسیددیسموتاز: فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز (SOD) از طریق اندازه‌گیری توانایی آن در جلوگیری از احیای نوری نیتروبلوتترازلیوم‌کلراید (NBT) با تغییرات جزئی در روش( (Dhindsa et al., 1981 سنجش شد. 3 میلی لیتر مخلوط واکنش شامل بافر سدیم-پتاسیم فسفات 50 میلی‌مولار (7/8=pH)، متیونین 13 میلی‌مولار، نیتروبلوتترازولیوم‌کلراید 75 میکرومولار، اتیلن‌دی‌آمین ‌تترا ‌استیک ‌اسید 1/0 میلی‌مولار، ریبوفلاوین 360 میکرومولار و 0، 10، 20، 30، 40، 50 میکرولیتر عصاره خام بود. جذب مخلوط واکنش در 560 نانومتر خوانده شد. فعالیت ویژه آنزیم به صورت تعداد واحدهای آنزیم در میلی‌گرم پروتئین گزارش شد.

گایاکول پراکسیداز: برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز (GPX) 50 میکرولیتر از عصاره گیاهی با بافر استخراج و اتیلن دی‌امین تترا استیک اسید آمیخته شد. با اضافه نمودن هیدروژن‌پراکسید و گایاکول به مخلوط، واکنش آنزیم گایاکول‌پراکسیدازآغاز شد. تغییرات جذب نور نمونه‌ها در طول موج 465 نانومتر ثبت شد. میزان فعالیت آنزیم برحسب واحد در میلی‌گرم پروتئین برگ بیان شد (Herzog & Fahimi, 1973). تجزیه‌ وتحلیل داده‌ها با نرم‌افزار آماری SAS نسخه 4/9 و مقایسه میانگین‌ها با استفاده از آزمون چند دامنه‌ای دانکن صورت گرفت و برای رسم  نمودارها از نرم‌افزار Excel استفاده شد.

نتایج

بررسی کلنیزاسیون ریشه و نسبت وزن خشک به سطح برگ (LMA)

بررسی میکروسکوپی ریشه‌ها نشان داد که مطابق با پژوهش‌های قبلی، قارچ S. indica توانایی بالایی در کلنیزاسیون ریشه انگور دارد (Karimi et al., 2022). نتایج جدول تجزیه واریانس در مورد نسبت وزن خشک به سطح برگ نشان داد که اثرات اصلی قارچ، کلسیم و خشکی در سطح احتمال 1 درصد معنی‌دار بوده اما اثرات متقابل دوگانه و سه‌گانه معنی‌دار نمی‌باشد (جدول 1). بر اساس نتایج مقایسه میانگین، تنش خشکی شدید باعث کاهش 11 درصدی (82/5 گرم در شرایط بدون تنش و 21/5گرم در شرایط تنش شدید) این شاخص شد. همچنین هم در شرایط نرمال و هم در شرایط تنش خشکی اثرات قارچ و کلسیم بر نسبت وزن خشک به سطح برگ مثبت بود.

محتوای نسبی آب برگ (RWC)

نتایج جدول تجزیه واریانس در مورد محتوای نسبی آب برگ نشان داد که اثرات اصلی قارچ، کلسیم و خشکی در این صفت  در سطح احتمال 1 درصد معنی‌دار بوده اما اثرات متقابل دوگانه و سه‌گانه معنی‌دار نمی‌باشد (جدول 1). بر اساس نتایج مقایسه میانگین، تنش خشکی شدید باعث کاهش 4 درصدی (28/86 درصد در شرایط بدون تنش و 27/83 درصد در شرایط تنش شدید) این شاخص شد. همچنین هم در شرایط نرمال و هم در شرایط تنش خشکی تلقیح با قارچ و تیمار با کلسیم سبب افزایش جزیی (بین یک یا دو درصد) در محتوای نسبی آب برگ گیاهان انگور شد.

جدول 1. نتایج تجزیه واریانس محتوای نسبی آب، وزن خشک به سطح برگ و رنگیزه­های فتوسنتزی انگور گیاه تحت تنش خشکی و تیمارهای  قارچ و کلسیم

Table 1. Variance analysis for effect of drought, calcium and S. indica inoculation on relative water content, leaf dry mass per area (LMA) and photosynthetic pigments of grape

ns ، * و ** به ترتیب عدم تفاوت معنی‌داری و معنی‌داری در سطح احتمال 5، 1 درصد است.

ns, *, **: Non significant and significant at 5% and 1% probability levels, respectively

رنگیزه‌های فتوسنتزی

براساس نتایج جدول تجزیه واریانس، اثرات اصلی قارچ، کلسیم و خشکی و همچنین اثرات متقابل دوگانه قارچ × کلسیم در سطح احتمال 1 درصد و اثرات متقابل قارچ × تنش و اثرات متقابل سه‌گانه قارچ × کلسیم × تنش در سطح احتمال 5 درصد معنی‌دار می‌باشد (جدول 1). معنی‌دار شدن اثرات متقابل دو گانه و سه‌گانه نشان می‌دهد که فاکتورها مستقل از هم عمل نکرده‌اند. نتایج آنالیز مقایسه میانگین نشان داد که تیمار تلقیح‌شده با قارچ و کلسیم 1 درصد در شرایط بدون تنش بیشترین میزان کلروفیل کل (67/2 میلی‌گرم/گرم وزن تر) و تیمار شاهد در شرایط تنش خشکی شدید کمترین میزان کلروفیل کل (35/1 میلی‌گرم/گرم وزن تر) را دارد (شکل 1).

براساس نتایج به‌دست‌‌آمده اثرات اصلی قارچ، کلسیم و خشکی و اثرات متقابل قارچ × کلسیم بر محتوای کاروتنوئیدها در سطح احتمال 1 درصد و اثرات متقابل سه‌گانه قارچ × کلسیم × تنش در سطح احتمال 5 معنی‌دار شد، اما سایر اثرات متقابل دوگانه معنی‌دار نشد (جدول 1). نتایج مقایسه میانگین نشان داد که بالاترین میزان کاروتنوئیدها در تیمار تلقیح‌شده و کلسیم 1 درصد در شرایط بدون تنش (86/0 میلی‌گرم/گرم وزن تر) و کمترین میزان آن در گیاهان تلقیح‌نشده و بدون تیمار با کلسیم در شرایط تنش خشکی شدید (51/0 میلی‌گرم/گرم وزن تر) مشاهده گردید (جدول 2).

شکل 1. اثر برهمکنش قارچ، تنش خشکی و کلسیم بر صفات (الف) کلروفیل کل و (ب) کاروتنوئیدها (تیمارها: S₀: تلقیح‌نشده؛ S₁: تلقیح‌شده؛ K₀: بدون کلسیم؛ K₁: تیمار با کلسیم؛ D₀: بدون تنش؛ D₁: تنش متوسط؛ D₂: تنش خشکی شدید)

Fig 1. Interaction effect of S. indica, calcium and drought stress on (a) total chlorophyll, and (b) carotenoids of grape (Treatments: S₀: non-inoculated; S₁: inoculated; K₀: without calcium; K₁: treatment with calcium; D₀: normal; D₁: medium stress; D₂: severe stress)

کربوهیدرات محلول

نتایج جدول تجزیه واریانس نشان داد که اثرات اصلی قارچ، کلسیم و خشکی و همچنین اثرات متقابل دوگانه قارچ × تنش در سطح احتمال 1 درصد و اثرات متقابل سه‌گانه قارچ × کلسیم × تنش در سطح احتمال 5 درصد بر صفت کربوهیدرات محلول معنی‌دار می‌باشد (جدول 2). نتایج مقایسه میانگین نشان داد که تیمار تلقیح‌شده با قارچ و کلسیم 1 درصد در شرایط تنش خشکی شدید بیشترین میزان کربوهیدرات محلول (16/19 میلی‌گرم/گرم وزن تر) و تیمار تلقیح‌نشده و بدون تیمار با کلسیم در شرایط بدون تنش کمترین میزان کربوهیدرات محلول (28/10 میلی‌گرم/گرم وزن تر) را دارد (شکل 2 الف).

جدول 2. نتایج تجزیه واریانس کربوهیدرات محلول، پرولین، پروتئین محلول و فنول انگور گیاه تحت تنش خشکی و تیمارهای  قارچ و کلسیم

Table 2. Variance analysis for effect of drought, calcium and S. indica inoculation on carbohydrate, proline, soluble protein and phenol of grape

ns ، * و ** به ترتیب عدم تفاوت معنی‌داری و معنی‌داری در سطح احتمال 5، 1 درصد است.

ns, *, **: Non significant and significant at 5% and 1% probability levels, respectively

شکل 2. اثر برهمکنش قارچ، تنش خشکی و کلسیم بر صفات (الف) کربوهیدرات کل، (ب) پرولین، (ج) پروتئین و (د) فنول گیاه انگور (تیمارها: S₀: تلقیح‌نشده؛ S₁: تلقیح‌شده؛ K₀: بدون کلسیم؛ K₁: تیمار با کلسیم؛ D₀: بدون تنش؛ D₁: تنش متوسط؛ D₂: تنش خشکی شدید)

Fig 2. Interaction effect of S. indica, calcium and drought stress on (a) total carbohydrate, (b) proline, (c) protein, and (d) phenol of grape (Treatments: S₀: non-inoculated; S₁: inoculated; K₀: without calcium; K₁: treatment with calcium; D₀: normal; D₁: medium stress; D₂: severe stress)

پروتئین‌های محلول

نتایج جدول تجزیه واریانس نشان داد که اثرات اصلی کلسیم و خشکی در سطح احتمال 1 درصد و همچنین اثر اصلی قارچ و اثرات متقابل دوگانه قارچ × تنش و اثرات سه‌گانه بر محتوای پروتئین‌های محلول برگ انگور در سطح احتمال 5 درصد معنی‌دار می‌باشد (جدول 2). مطابق با نتایج بدست‌آمده از مقایسه میانگین تیمارها، بیشترین میزان پروتئین‌های محلول (18/21 میلی‌گرم/گرم وزن تر) در تیمار تلقیح‌شده و کلسیم 1 درصد در شرایط بدون تنش و کمترین میزان آن (40/18 میلی‌گرم/گرم وزن تر) در تیمار تلقیح‌شده بدون کلسیم در شرایط تنش خشکی شدید مشاهده گردید (شکل 2 ب).

پرولین

نتایج جدول تجزیه واریانس نشان داد که اثرات اصلی قارچ، کلسیم و خشکی و همچنین اثرات متقابل دوگانه (بجز اثرات قارچ × کلسیم) و سه‌گانه بر محتوای پرولین برگ انگور در سطح احتمال 1 درصد معنی‌دار می‌باشد (جدول 2). بر اساس نتایج بدست‌آمده از مقایسه میانگین تیمارها، بیشترین میزان پرولین (03/12 میکرومول/گرم وزن تر) در تیمار تلقیح‌شده و کلسیم 1 درصد در شرایط تنش خشکی شدید و کمترین میزان آن (19/7 میکرومول/گرم وزن تر) در تیمار بدون قارچ و کلسیم در شرایط عدم تنش خشکی مشاهده گردید. در مجموع هم تیمار با کلسیم و هم تلقیح انگور با قارچ S. indica باعث افزایش محتوای پرولین گردید (شکل 2 ج).

فنول

نتایج جدول تجزیه واریانس نشان داد که اثرات اصلی قارچ، کلسیم و خشکی و همچنین اثرات متقابل دوگانه  قارچ × تنش و سه‌گانه بر فنول در سطح احتمال 1 درصد معنی‌دار می‌باشد (جدول 2). براساس نتایج مقایسه میانگین تیمارها، تیمار تلقیح‌شده در شرایط تنش (با کاربرد کلسیم و بدون کلسیم) بیشترین (0/28 میلی‌گرم/گرم وزن تر) و تیمار بدون قارچ و کلسیم در شرایط تنش خشکی متوسط کمترین میزان فنول (25/21 میلی‌گرم/گرم وزن تر) را نشان دادند (شکل 2 د).

پایداری غشاء سلولی (MSI)

نتایج جدول تجزیه واریانس نشان داد که اثرات اصلی قارچ، کلسیم و تنش در سطح 1 درصد و اثرات متقابل کلسیم × تنش و اثرات سه‌گانه در سطح 5 درصد معنی‌دار می‌باشد (جدول 3). بر اساس نتایج مقایسه میانگین تیمارها، تیمار تلقیح‌شده و کلسیم 1 درصد در شرایط نرمال و تیمار تلقیح‌نشده بدون کاربرد کلسیم تحت تنش خشکی شدید به ترتیب دارای بیشترین (56/77 درصد) و کمترین (57/73 درصد) میزان پایداری غشاء سلولی بودند (شکل 3).

جدول 3. نتایج تجزیه واریانس پایداری غشاء سلولی، مالون دی آلدئید و آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان انگور گیاه تحت تنش خشکی و تیمارهای  قارچ و کلسیم

Table 3. Variance analysis for effect of drought, calcium and S. indica inoculation on MSI, MDA and antioxidant enzymes of grape

ns ، * و ** به ترتیب عدم تفاوت معنی‌داری و معنی‌داری در سطح احتمال 5، 1 درصد است.

ns, *, **: Non significant and significant at 5% and 1% probability levels, respectively

شکل 3. اثر برهمکنش قارچ، تنش خشکی و کلسیم بر صفت پایداری غشاء گیاه انگور (تیمارها: S₀: تلقیح‌نشده؛ S₁: تلقیح‌شده؛ K₀: بدون کلسیم؛ K₁: تیمار با کلسیم؛ D₀: بدون تنش؛ D₁: تنش متوسط؛ D₂: تنش خشکی شدید)

Fig 3. Interaction effect of S. indica, calcium and drought stress on membrane stability index of grape (Treatments: S₀: non-inoculated; S₁: inoculated; K₀: without calcium; K₁: treatment with calcium; D₀: normal; D₁: medium stress; D₂: severe stress)

مالون دی‌آلدئید

بررسی جدول تجزیه واریانس نشان داد که اثرات اصلی قارچ، کلسیم و خشکی و همچنین اثرات متقابل دوگانه بر محتوای مالون دی آلدئید معنی‌دار می‌باشد اما اثرات سه‌گانه معنی‌دار نشد (جدول 3). معنی‌دار شدن اثرات متقابل دو گانه نشان می‌دهد که فاکتورها مستقل از هم عمل نکرده‌اند. بر اساس نتایج مقایسه میانگین، تلقیح با قارچ و تیمار با کلسیم محتوای مالون دی آلدئید را کاهش داد در حالیکه تنش باعث افزایش محتوای مالون دی آلدئید گردید.  همچنین اثرات متقابل قارچ × کلسیم اثرات کاهشی بر محتوای مالون دی آلدئید داشت بطوریکه کمترین میزان مالون دی آلدئید در گیاهان تلقیح‌شده و تیمار شده با کلسیم و در شرایط بدون تنش مشاهده شد (شکل 4).

شکل 4. اثر برهمکنش قارچ، تنش خشکی و کلسیم بر محتوای مالون دی آلدئید گیاه انگور (تیمارها: S₀: تلقیح‌نشده؛ S₁: تلقیح‌شده؛ K₀: بدون کلسیم؛ K₁: تیمار با کلسیم؛ D₀: بدون تنش؛ D₁: تنش متوسط؛ D₂: تنش خشکی شدید)

Fig 4. Interaction effect of S. indica, calcium and drought stress on MDA of grape (Treatments: S₀: non-inoculated; S₁: inoculated; K₀: without calcium; K₁: treatment with calcium; D₀: normal; D₁: medium stress; D₂: severe stress)

آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان (کاتالاز، پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز و گایاکول پراکسیداز)

نتایج جدول تجزیه واریانس نشان داد که اثرات اصلی و همچنین اثرات متقابل دوگانه و سه‌گانه بر فعالیت آنزیم‌های سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز برگ انگور معنی‌دار می‌باشد؛ اما در گایاکول پراکسیداز اثرات اصلی و اثرات متقابل کلسیم × تنش و در مورد آنزیم پراکسیداز اثرات اصلی و اثرات متقابل دو گانه قارچ × تنش و کلسیم × تنش معنی‌دار بود (جدول 3).

بر اساس نتایج مقایسه میانگین تیمارها، تیمارهای تلقیح‌نشده و کلسیم 1 درصد در شرایط تنش خشکی شدید و تلقیح‌شده و کلسیم 1 درصد در شرایط تنش خشکی شدید به ترتیب بیشترین میزان فعالیت سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز (به ترتیب 01/19 و 23/27 واحد بر میلی‌گرم پروتئین در دقیقه) و تیمار تلقیح‌نشده بدون کلسیم در شرایط نرمال کمترین میزان سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز (به ترتیب 10/8 و 30/9 واحد بر میلی‌گرم پروتئین در دقیقه) را نشان داد (شکل 5). همچنین بر اساس نتایج، تنش خشکی و قارچ میزان آنزیم پراکسیداز را افزایش داد اما کلسیم تاثیری بر میزان آن نداشت. در مورد آنزیم گایاکول پراکسیداز، تنش خشکی و قارچ میزان این آنزیم را کاهش داد اما کلسیم آن را افزایش داد.

شکل 5. اثر برهمکنش قارچ، تنش خشکی و کلسیم بر صفات (الف) آنزیم کاتالاز و (ب) سوپراکسید دیسموتاز گیاه انگور (تیمارها: S₀: تلقیح‌نشده؛ S₁: تلقیح‌شده؛ K₀: بدون کلسیم؛ K₁: تیمار با کلسیم؛ D₀: بدون تنش؛ D₁: تنش متوسط؛ D₂: تنش خشکی شدید)

Fig 5. Interaction effect of S. indica, calcium and drought stress on (a) CAT, and (d) SOD antioxidant enzymes of grape (Treatments: S₀: non-inoculated; S₁: inoculated; K₀: without calcium; K₁: treatment with calcium; D₀: normal; D₁: medium stress; D₂: severe stress)

بحث

صفت نسبت وزن خشک به سطح برگ یکی از صفات مهم تعیین‌کننده تحمل گیاه به تنش‌ است، به‌طوری‌که گیاهان با نسبت وزن خشک به سطح برگ بالاتر، معمولا تحمل بیشتری به تنش خشکی و ظرفیت فتوسنتز بالاتری دارند (Kennedy, 2008). تنش خشکی باعث کاهش سطح و تعداد برگ می‌شود و وزن خشک برگ نیز می‌تواند تحت تأثیر تنش خشکی کاهش پیدا کند. طیف گسترده‌ای از ترکیبات موجود در برگ شامل مواد معدنی، کربوهیدرات‌های ساختاری و غیر‌ساختاری، فنول‌ها، پروتئین‌ها و لیپیدها می‌توانند سبب تغییر وزن خشک برگ شوند (Poorter et al., 2009). بالاتر بودن میزان این صفت در گیاهان تلقیح‌شده با قارچ و تیمارشده با کلسیم نشان دهنده‌ تحمل بهتر آنها به تنش خشکی در مقایسه با گیاهان شاهد است. مکانیسم‌های مختلفی در ارتباط با اثر مثبت قارچ‌های اندوفیت بـر افزایش رشـد و در نتیجه بالاتر بودن زیست‌توده ذکر شده است که از جمله می‌توان به افزایش تولید سیتوکینین و همچنین بهبود انتقال از طریق آوندهای چوب و آبکش اشاره کرد که در نهایت رشد را افزایش می‌دهد (Ghabooli & Kaboosi, 2022; Deyhim et al., 2022). شواهد نشان می‌دهد کلسیم در تنظیم فرایندهای مختلفی مانند تقسیم سلولی، طویل شدن سلولی و تمایز سلولی درگیر می‌باشد (Hong-Bo et al., 2008)، لذا به نظر می‌رسد کاربرد کلسیم باعث افزایش رشد و نسبت وزن خشک به سطح برگ گیاه بخصوص در شرایط تنش خشکی می‌شود. البته در این آزمایش برهم‌کنش تیمارها اثر معنی‌داری بر این صفت نداشت و کلسیم و قارچ بطور مستقل بر روی این صفت تاثیرگذار بودند.

تحت شرایط تنش خشکی محتوای آب نسبی برگ به سرعت کاهش یافته و هدایت روزنه‌ای تحت تاثیر قرار گیرد و در نهایت این امر منجر به کاهش فتوسنتز می‌شود (Bota et al., 2004). در این پژوهش قارچ محتوای آب نسبی برگ را افزایش داد که با نتایج پژوهش‌های پیشین تطابق دارد (Kumar et al., 2009; Kaboosi & Ghabooli, 2022). به نظر می‌رسد میسلیوم‌های قارچ، سطح جذب را افزایش داده و از این طریق به نگهداری آب در اطراف گیاه میزبان کمک می‌کنند. همچنین افزایش تکثیر ریشه‌ها در گیاهان کلنیزه‌شده به آنها اجازه می‌دهد به لایه‌های عمیق خاک نفوذ کرده و آب و مواد مغذی بیشتری بدست آورند (Wu et al., 2019). کلسیم نیز در استحکام دیواره سلول‌ها و حفظ ساختار و کارکرد غشاء نقش کلیدی دارد و قابلیت نگهداری آب سلول‌ها را افزایش می‌دهد. نتایج این پژوهش نشان دادکه کلسیم با افزایش محتوای نسبی آب مقاومت به تنش خشکی را بهبود بخشید. تأثیر مثبت کلسیم بر افزایش محتوای نسبی آب برگ در گل ژربرا نشان داده شده است (Albino-Garduno et al., 2008). کاربرد کلسیم در محلول غذایی گیاه گوجه فرنگی منجر به افزایش محتوای آب گیاه نسبت به شاهد شد (Tanveer et al., 2020). البته در این صفت نیز اثرات متقابل کلیسم و قارچ معنی‌دار نبودند.

در این پژوهش تنش خشکی باعث کاهش محتوای کلروفیل گردید که بر اساس گزارش‌های منتشرشده، احتمالا به دلیل جلوگیری از فعالیت آنزیم کلروفیل سنتاز، فعال شدن آنزیم کلروفیلاز و تولید بیش از حد رادیکال‌های آزاد اکسیژن است که خود باعث پراکسیداسیون لیپیدی غشاء و در نتیجه تجزیه کلروفیل می‌شود (Dief et al., 2021, Gapińska et al., 2008). مشخص شده است که کلروفیل و پرولین از پیش ماده مشترک (گلوتامات) ساخته می‌شوند؛ لذا احتمالا یکی از دلایل کاهش میزان کلروفیل در شرایط تنش، افزایش سنتز پرولین باشد (Khalid & da silva, 2010). نتایج پژوهش‌های انجام‌شده در گوجه‌فرنگی و زرین‌گیاه نشان داده است که تلقیـح با قارچ S. indica باعث افزایش محتوای کلروفیل و کاروتنوئیدها می‌شود (Kaboosi et al., 2023a; Mehri et al., 2023). قارچ با مکانیزم‌های مختلفی شامل افزایش حفظ گرانا در کلروپلاست‌ها و همچنین بهبود سیستم‌های آنتی‌اکسیدان سبب بهبود فرایندهای فتوسنتزی درشرایط تنش می‌شود (Hosseini et al., 2017). یکی از اثرات ثانویه حاصل از تنش خشکی، افزایش تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن است. کاروتنوئیدها از دستگاه فتوسنتزی در برابر رادیکال‌های آزاد محافظت نموده و از پراکسیداسیون لیپید جلوگیری می‌کنند و بنابراین نقش مهمی در پایداری غشاء در شرایط تنش ایفا می‌نمایند (Farooq et al., 2009). به نظر می‌رسد قارچ با افزایش میزان کاروتنوئیدها از آسیب رادیکال‌های آزاد اکسیژن به دستگاه فتوسنتزی جلوگیری و به پایداری غشاء کمک می‌کند. فعالیت موثر این قارچ در زدودن ROS و حفظ هموستازی سلولی در گیاهانی مانند جو (Ghaffari et al., 2019)، گندم (Hosseini et al., 2017) و ذرت (Kumar et al., 2009) نشان داده شده است. اخیرا گزارش شده است که وجود برخی پروتئین‌ها در لایه‌ی بیرونی دیواره سلولی هیف‌های قارچ، مسئول خاموش کردن ROS در مسیر آپوپلاستیک هستند (Chandrasekar et al., 2022). افزایش محتوای کلروفیل در اثر کاربرد کلسیم توسط (Ibrahim et al., 2016) گزارش شده است. کلسیم به عنوان پیام‌رسان ثانوبه با تاثیر بر مسیرهای بیوسنتزی کلروفیل وابسته به سیتوکنین باعث بهبود در سنتز کلروفیل می‌شود (Ahmad et al., 2015). همچنین (Drikvand et al., 2022) افزایش میزان کاروتنوئیدها در‌نتیجه‌ محلول‌پاشی کلسیم و تنش خشکی در گیاه ذرت شیرین را گزارش کردند. اثرات متقابل کلسیم و قارچ در مورد این صفات هم در شرایط نرمال و هم خشکی معنی‌دار بود و به نظر می‌رسد کاربرد همزمان کلسیم و قارچ اثرات بیشتری بر این صفت دارد.

کربوهیدرات‌های محلول در شرایط تنش خشکی تجمع یافته، به‌عنوان عامل یا محافظ اسمزی عمل نموده و موجب حفظ و نگهداری مولکول‌های زیستی و غشاها می‌شوند (Nanda & Agrawal, 2018). در این پژوهش تنش خشکی سبب افزایش میزان کربوهیدرات‌های محلول در گیاه شد. تلقیح قارچ S. indica میزان کربوهیدرات‌های محلول را افزایش داد که با نتایج (Baltruschat et al., 2008) و (Kaboosi et al., 2023b) همخوانی دارد. به نظر می‌رسد قارچ با افزایش میزان کربوهیدرات‌ها در شرایط تنش به تثبیت فتوسنتز و فرایندهای متابولیسمی در این شرایط کمک می‌نماید. پژوهش‌ها نشان می‌دهد قارچ از طریق برخی انتقال‌دهنده‌های هگزوزی، جذب کربوهیدرات‌ها را افزایش می‌دهد (Rani et al., 2016). کلسیم با دخالت در فرایند فتوسنتز باعث افزایش تجمع کربوهیدرات‌ها در گیاه می‌شود. در پژوهش(Naseri et al., 2014)، کاربرد نیترات کلسیم باعث افزایش تجمع کربوهیدرات‌های محلول شد. اثرات متقابل کلسیم و قارچ بر این صفت در شرایط تنش خشکی معنی‌دار بود و به نظر می‌رسد در شرایط تنش، تاثیرات متقابل آنها از اثرات اصلی قارچ و کلسیم بیشتر است. افزایش میزان کربوهیدرات‌ها در گیاهان تیمارشده با قارچ و کلسیم می‌تواند یک مزیت محسوب شود، زیرا قندها به عنوان ترکیبات اسمزی در شرایط تنش عمل می‌کنند و مقاومت به تنش را افزایش می‌دهند.

محتوای پروتئین‌های محلول یکی از شاخص‌های مهم نشان‌دهنده‌ی وضعیت فیزیولوژیکی سلول‌های گیاهی تحت تنش می‌باشد (Karimi et al., 2016) که میزان آن عموما با افزایش شدت تنش، کاهش می‌یابد که دلیل آن فعالیت آنزیم‌های تجزیه‌کننده‌ پروتئین‌ها مانند پروتئازهای مختلف است (Bertamini et al., 2006). به نظر می‌رسد قارچ با تاثیر بر سنتز هورمون‌های گیاهی و همچنین افزایش بیان برخی ژن‌های دخیل در سنتز پروتئین‌ها، میزان آن را در گیاهان میزبان افزایش می‌دهد (Ghabooli et al., 2013). در محیط داخلی سلول، کلسیم به‌عنوان پیام‌رسان ثانویه با تأثیرگذاری بر پایداری و فعالیت پروتئین‌ها سلول را از شرایط تنش خارج می‌نماید. در تحقیقRezayian et al., 2018) ( کاربرد کلسیم باعث افزایش محتوای پروتئین‌های محلول کانولا شد. در پژوهش حاضر، اثرات متقابل کلسیم و قارچ بر میزان پروتئین در شرایط نرمال و تنش خشکی معنی‌دار نبود و کلسیم و قارچ بطور مستقل بر این صفت تاثیر داشتند.

یکی از مکانیسم‌های گیاه برای مقابله با اثرات منفی تنش‌های غیرزیستی تولید اسمولیت‌هایی مانند پرولین به عنوان یکی از پایدارترین اسیدهای آمینه می‌باشد که در ایجاد و حفظ فشار اسمزی درون گیاه نقش به‌سزایی دارد. کاهش تجزیه پرولین و افزایش بیوسنتز پرولین از دلایل احتمالی تجمع پرولین در شرایط تنش باشد (Nanda & Agrawal, 2018). در پژوهش‌های زیادی به افزایش محتوای پرولین در گیاهان تلقیح‌شده با قارچ ( Kaboosi et al., 2023b ; Ghabooli & Hosseini, 2021) اشاره شده است که با نتایج بدست آمده در این پژوهش همخوانی دارد. افزایش بیان برخی از ژن‌های دخیل در سنتز پرولین مانند ژن P5CS از دیگر دلایل افزایش پرولین در گیاهان تلقیح‌شده است (Azizi et al., 2021). به نظر می‌رسد کلسیم با افزایش بیوسنتز پرولین از اثرات نامطلوب تنش خشکی بکاهد. پژوهش‌های قبلی، اثر تیمار محلول‌پاشی کلسیم برافزایش محتوای پرولین در گیاهان متعدد (از جمله ذرت شیرین) را نشان داده است (Drikvand et al., 2022). در این آزمایش، اثرات متقابل قارچ و کلسیم در شرایط تنش خشکی معنی‌دار بود و اثرات بیشتری در افزایش پرولین داشتند.

فنول‌ها از اجزای مهم محافظ سلول‌های گیاهی هستند که فعالیت آنتی‌اکسیدانی موثرتری از آسکوربات و توکوفرول دارند که ناشی از فعالیت بالای هیدروژن یا الکترون‌دهی آن‌ها می‌باشد. براین اساس گیاهانی که ترکیبات فنولی بالاتری داشتند، عموما فعالیت‌های ضد رادیکال آزاد بالاتری نشان دادند (Karimi et al., 2022). در این پژوهش ترکیبات فنولی در همزیستی بین گیاهان و قارچ بیشتر شد. به نظر می رسد قارچ با تغییر فعالیت‌های آنزیمی و سازوکارهای فیزیولوژیکی درگیر، باعث تجمع متابولیت‌های ثانویه مانند کاروتنوئیدها و پلی‌فنل‌ها در گیاهان میزبان می‌شود (Bagheri et al., 2014). این تجمع می‌تواند از یک سو دلیلی بر دخالت این ترکیبات در ایجاد همزیستی و از سوی دیگر نشان دهنده‌ی تحریک تولید آن‌ها توسط قارچ باشد (Sharifi et al., 2011). افزایش ترکیبات فنلی در گیاهان تلقیح‌شده اثرات مستقیم وغیر مستقیم قارچ را در سنتز ترکیبات فنلی نشان می‌دهد که قبلا در انگور گزارش شده (Karimi et al., 2022) و از طریق مطالعات پروتئومیکس اثبات شده است (Ghabooli et al., 2013). اولین مطالعه‌ای که نقش مستقیم کلسیم را در سنتز ترکیبات فنولی نشان داد توسط (Castaneda & Pérez 1996)  انجام شد. نقش کلسیم نیز با تاثیر بر آنزیم‌های موثر در سنتز و اکسیداسیون فنل‌ها مانند فنیل آلانین آمونیالیاز، پراکسیداز، پلی فنل اکسیداز مشخص شده است. از این طریق عنصر کلسیم در چرخه متابولیسم اسیدهای فنولیک نقش موثری دارد ( Castaneda & Pérez, 1996 ; Ruiz et al., 2003) در تحقیقی بر روی برگ تنباکو دریافتند با افزایش غلظت کلسیم میزان فنول کل افزایش پیدا کرد. در پژوهش حاضرف اثرات متقابل کلسیم و قارچ در شرایط خشکی بر میزان فنول معنی‌دار بود.

با وقوع تنش خشکی دیواره سلول پایداری و رشد خود را از دست می‌دهد و علاوه بر غیرفعال شدن پروتئین‌های غشاء و پراکسیداسیون چربی ها، نفوذپذیری غشاء سلولی نیز افزایش می‌یابد که منجر به نشت الکترولیت می‌شود. از اینرو، پایداری غشاء سلولی شاخص فیزیولوژیکی است که به‌طور وسیع برای ارزیابی تحمل به خشکی به‌کار می‌رود (Bota et al., 2004). نتایج پژوهش حاضر نشان داد که تنش خشکی موجب افزایش نشت الکترولیت شد که با نتایج Teimory, et al., (2021) تطابق دارد. به نظر می‌رسد تاثیر قارچ بر جلوگیری یا کاهش تولید ROSهایی نظیر H₂O₂ از جمله دلایلی است که پایداری غشاء در گیاهان تلقیح‌شده در شرایط تنش بالاتر است (Kaboosi et al., 2023b). وجود کلسیم به صورت پکتات کلسیم در تیغه میانی به منظور تقویت دیواره سلولی و بافت گیاهی ضروری است. پکتات‌ها توسط آنزیم پلی‌گالاکتوروناز تخریب می‌شوند، این آنزیم  توسط غلظت بالای کلسیم مهار می‌شود (Wehr et al., 2004). در این پژوهش، بین افزایش پایداری غشاء با افزایش محتوای کاروتنوئیدها در گیاهان تلقیح‌شده رابطه مستقیمی وجود دارد که می‌تواند بیانگر تاثیر قارچ بر حفظ کارایی غشاء و دستگاه فتوسنتزی در شرایط تنش خشکی می‌باشد.

اسیدهای چرب غیراشباع حساس‌ترین بخش غشاء به اکسید شدن و تخریب توسط تنش اکسایشی هستند. تجمع مالون‌دی‌آلدئید، در شرایط تنش سبب افزایش نفوذپذیری غشاء پلاسمایی شده و نشت یونی را افزایش می‌دهد. در مطالعه حاضر میزان مالون دی آلدئید تحت تنش خشکی افزایش یافت که با مطالعه قبلی مطابقت دارد (Ghabooli & Kaboosi, 2022). نتایج این پژوهش نشان داد که همزیستی انگور با قارچ S. indica به گیاه امکان مقاومت بهتر در برابر آسیب‌های وارده به لیپیدهای غشایی ناشی از تنش خشکی را می‌دهد به طوری که میزان مالون‌دی‌آلدئید در گیاهان همزیست با قارچ و تیمارشده با کلسیم کاهش چشمگیری داشت. این نتایج با نتایج Ghabooli & Kaboosi (2022)  مطابقت دارد که در آن قارچ محتوای مالون‌دی‌آلدئید را در برگ‌های گوجه‌فرنگی کاهش داد. به نظر می‌رسد کلسیم با حفظ  و تقویت فعالیت سیستم آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان و افزایش تجمع پرولین می‌تواند آسیب‌های وارده به غشاء از طریق تنش را کاهش داده و میزان تولید مالون‌دی‌آلدئید را پائین بیاورد (Hosseini Tafreshi et al., 2019). اثرات متقابل قارچ و کلسیم بر دو صفت پایداری غشاء و میزان مالون دی آلدئید معنی‌دار نبود و دو تیمار مستقل از هم عمل کرده بودند.

تولید بیش از حد ROSها در شرایط تنش منجر به پراکسیداسیون لیپیدی، مهار فعالیت‌های آنزیمی، کاهش رنگیزه‌های فتوسنتزی و فعال‌سازی مرگ برنامه‌ریزی شده سلولی می‌گردد. گیاهان برای از بین بردن رادیکال‌های آزاد اضافی و کاهش آسیب ناشی از تنش اکسایشی بر سلول‌ها به انواع مکانیسم‌های دفاعی آنتی‌اکسیدان (آنزیمی و غیرآنزیمی) مجهز شده‌اند (Liu et al., 2011).

افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان تحت تنش خشکی، نشان‌دهنده نقش مهم آن‌ها در مکانیسم‌های دفاعی گیاه در شرایط تنش است. خشکی تعادل بین آنتی‌اکسیدان‌ها و مقدار ROS را مختل می‌کند. در این آزمایش با کاهش پتانسیل آب خاک و وقوع تنش، سطح آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان افزایش یافت. همزمان با افزایش سطح آنزیم‌ها، محتوای نسبی آب برگ، پایداری غشاء سلولی و محتوای کلروفیل کاهش و محتوای مالون‌دی‌آلدئید افزایش نشان داد. تنش خشکی افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان(کاتالاز، پراکسیداز و سوپراکسیددیسموتاز) را به دنبال داشت که توسط S. indica افزایش بیشتری پیدا کرد.  Sun et al. (2010)افزایش در فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی گیاهان تلقیح‌شده با قارچ تحت تنش خشکی را مشاهده کرده‌اند که با نتایج این پژوهش و پژوهش‌های قبلی ( Verma et al. 2022 ; Xu et al., 2017) تطابق دارد. تاثیر قارچ بر میزان هورمون‌هایی مانند اکسین و سیتوکنین ممکن است سطح آنزیم های آنتی‌اکسیدان را در گیاهان تلقیح‌شده در شرایط تنش خشکی تغییر دهد. Johnson et al., (2018) نشان دادند سطوح کلسیم سیتوزولی القاء شده توسط قارچS. indica مستقیماً بر تولید ROS در گیاهان تلقیح‌شده تاثیر دارد. Xu et al., (2017)  گزارش کردند S. indica دارای قدرت اسمزی و فعالیت آنزیمی بالا و محتوای MDA پایین در شرایط خشکی است که قادر به زدودن ROS است. این قارچ همچنین با تحریک بیان ژن‌های سوپراکسید‌دیسموتاز وکاتالاز در گیاه آرابیدوپسیس به آن‌ها کمک می‌کند تا نسبت به انجماد متحمل شوند (Jiang et al., 2021). در این آزمایش میزان آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان تحت تاثیر تیمارکلسیم نیز قرارگرفت و با بروز علایم تنش، میزان این آنزیم‌ها افزایش یافت. در پژوهشی، محققان نشان دادند کاربرد کلسیم با تقویت سیستم آنتی‌اکسیدانی آنزیمی به ویژه آنزیم‌های آسکوربات پراکسیداز و سوپراکسیددیسموتاز و همچنین کاهش تجمع گونه‌های فعال اکسیژن، سطح مقاومت به تنش را تا حدی افزایش داده است (Hosseini Tafreshi et al., 2019). این نتایج، با کاهش میزان مالون دی آلدئید در گیاهان تیمارشده با کلسیم همخوانی دارد. اثرات متقابل قارچ و کلسیم بر میزان دو آنزیم آنتی‌اکسیدان CAT و SOD معنی‌دار بود اما بر روی POD و GPX معنی‌دار نبود و در مورد دو آنزیم آخر، قارچ و کلسیم به طور مستقل تاثیرگذار بودند.

نتایج این پژوهش نشان داد تنش خشکی، کلسیم و تلقیح قارچ فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان را در انگور افزایش داده‌اند. به نظر می رسد قارچ S. indica و کلسیم با افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان نقش مهمی در حذف رادیکال‌های آزاد اکسیژن داشتند که با تاثیر آنها بر میزان کاروتنوئیدها، پایداری غشاء و همچنین محتوای مالون دی آلدئید همخوانی دارد و نشان می‌دهد در مجموع این گیاهان در مقایسه با گیاهان شاهد بهتر توانسته‌اند اثرات مضر تنش خشکی را کاهش دهند. در برخی صفات خصوصا در شرایط تنش خشکی اثرات متقابل کلسیم و قارچ بیشتر از اثرات اصلی این تیمارها بود. با توجه به نقش‌های متعدد ساختاری و آنزیمی کلسیم، ممکن است این عنصر با افزایش تقسیم و رشد سلولی باعث توسعه سیستم ریشه شده که به نوبه خود امکان همزیستی بیشتر قارچ با ریشه گیاه را فراهم می‌نماید. این امر مستلزم تحقیقات بیشتر برای بررسی برهمکنش قارچ و کلسیم می‌باشد.

نتیجه‌گیری کلی

با توجه به اهمیت گیاه انگور و همچنین معضل خشکی و بارندگی پایین در نواحی مختلف کشور، این پژوهش با هدف بررسی تاثیر استفاده از قارچ اندوفیت S. indica به عنوان یک همزیست مدل و همچنین کاربرد عنصر غذایی کلسیم و برهمکنش آنها بر رشد و برخی صفات مورفوفیزیولوژیکی انگور رقم بی‌دانه سفید انجام شد. نتایج به دست آمده از این پژوهش نشان دادکه با افزایش سطح تنش، میزان کربوهیدرات‌های محلول، محتوای مالون‌دی‌آلدئید، پرولین، فنول و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان افزایش ‌و پایداری غشاء‌سلولی، محتوای ‌نسبی ‌آب ‌برگ، پروتئین‌های محلول، رنگیزه‌های فتوسنتزی و نسبت وزن‌خشک‌ به ‌سطح برگ کاهش می‌یابد که در مجموع سبب کاهش رشد در گیاهان می‌شود.  همزیستی قارچ S. indica با انگور و تیمار با کلسیم در تحریک رشد و مقاومت گیاه به خشکی موثر بود و در شرایط تنش خشکی، توانست نقش موثری در بهبود شاخص‌های فیزیولوژیکی گیاه داشته باشدکه با توجه به برخی از ویژگی‌های فیزیولوژیکی مورد سنجش در این پژوهش، این تأثیرگذاری همراه با کاهش اثرات تنش خشکی بود. نتایج همچنین نشان داد برهمکنش قارچ و کلسیم در انگور باعث بهبود میزان کربوهیدرات‌ محلول، محتوای مالون‌دی‌آلدئید، پرولین، فنول، فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان، پایداری غشاء‌سلولی، محتوای ‌نسبی ‌آب ‌برگ، پروتئین‌های محلول، محتوای کلروفیل و کاروتنوئیدها و نسبت وزن‌خشک‌ به ‌سطح برگ شد که به نوبه‌ی خود ظرفیت گیاه برای پاسخ بهتر به تنش خشکی را بهبود بخشید. در مجموع، نتایج نشان می‌دهد استفاده از کودهای حاوی کلسیم در کنار کاربرد میکرواگانیسم‌های مفید نظیر قارچ‌های اندوفیت می‌تواند به عنوان یک راهکار مناسب برای افزایش رشد و عملکرد انگور و دستیابی به کشاورزی پایدار در تولید این محصول در نظر گرفته شود.