غربالگری‌ باکتری‌های مؤثر در حذف زیستی سلنیوم از پساب سد باطله مس سرچشمه

مقدمه

پیشرفت روزافزون صنایع در دهه‌های اخیر، مهم‌ترین عامل آلودگی محیط زیست محسوب می‌شود. زمانی که پساب‌های آلوده به فلزات سنگین حتی در حد مجاز وارد محیط زیست شوند، با تأثیر از عوامل مختلف فیزیکوشیمیایی و میکروبی متراکم می‌شوند و آب‌های سطحی و زیر‌زمینی را آلوده و اثرات جبران‌‌ناپذیری‌ بر محیط ‌زیست وارد می‌کنند. ‌یکی از این فلزات، سلنیوم است که تجمع آن در محیط سبب بیماری‌های پوستی، ریزش مو، تغییر ‌شکل ناخن، پوسیدگی دندان‌ها، اختلالات روانی، نکروز کبد و کلیه و مرگ سلولی در انسان می‌شود. همچنین، این عنصر ‌کاربرد‌های زیادی در زمینه‌های مختلف نظیر الکترونیک، متالورژی[1]، تولید رنگ و شیشه‌سازی دارد. سلنیوم عنصر کمیاب اصلی و مورد نیاز است که برای ‌بیشتر ارگانیسم‌ها اهمیت دارد (1). نقش مکمل سلنیوم به‌عنوان‌ مکمل غذایی[2]‌ یا به‌عنوان مونوتراپی در پیشگیری‌ یا درمان بیماری کروناویروس-‌‌19[3] هدف تحقیقات آزمایش‌های بالینی‌ بوده است. عملکرد ضد کووید-19 سلنیوم از توانایی آن در کاهش استرس اکسیداتیو و کاهش بیان گیرندة آنزیم تبدیل‌کنندة آنژیوتانسین-2[4] ناشی می‌شود (2).

مشکل وجود سلنیوم در پساب سدهای ‌باطله[5]‌ یکی از عوامل آلودگی محیط زیست توسط فلزات سنگین است که باعث تغییر و تخریب اکوسیستم محیط و هرزرفتن منابع مورد نیاز کمیاب می‌شود. علاوه بر این، مقادیر بیش از حد طبیعی این عنصر، باعث ایجاد ضررهای جبران‌ناپذیر زیستی در موجودات مختلف می‌شود. فلزات سنگین به‌دلیل پایداری زیاد محیطی و حضور مقادیر بالا در پساب کارخانه‌ها، از مهم‌ترین آلاینده‌های زیستی به شمار می‌روند (3). فاضلاب‌ها دارای 6 نوع ماده آلاینده اصلی ‌شامل مواد معلق، مواد آلی، مواد معدنی، نمک‌های محلول فلزی، باکتری‌ها و ویروس‌ها هستند که اکثر آنها، مانند مواد آلی، تجزیه‌پذیرند و تنها برخی مانند مواد آلی مصنوعی و فلزات سنگین پایدار هستند و تجزیه آنها بسیار طولانی است. فلزات به سه دسته فلزات سبک، واسطه و شبه‌فلزات تقسیم می‌شوند و سلنیوم جزء شبه‌فلزات قرار می‌گیرد (4). سلنیوم به چهار شکل اکسی‌آنیون سلنات، سلنیت، سلنید و عنصر سلنیوم در طبیعت‌ یافت می‌شود که سلنات و سلنیت به‌علت حلالیت بالا در آب، بیشترین دسترسی زیستی و بنابراین بیشترین سمیت را برای سیستم‌های زیستی دارند (5). به‌طور کلی میکروارگانیسم‌ها به سه روش می‌توانند در تصفیة سنگ معدنی فلزات و استخراج فلزات[6] از فاضلاب‌ها نقش داشته باشند. آنها با ترشح موادی ‌که موجب انحلال فلزات در آب‌های اطراف می‌شوند، با تبدیل فلز به نمک‌های محلول، فلز را قابل استخراج از محیط می‌کنند. همچنین، این موجودات با جذب سطحی[7] ذرات فلزی‌ به دیوارة خود، فلز را می‌توانند جدا کنند. جذب ذرات فلزی ‌به داخل میکروارگانیسم‌ها و انباشت داخل سلولی آنها، راه سوم حذف این مواد از محیط است. در این روش نیز با ته‌نشین‌کردن سلول‌ها، فلز را از محلول حاوی آن جدا می‌کنند (6). نکات مهم در استفاده از میکروارگانیسم‌ها توجه به نیاز آنها است. دمیدن اکسیژن، گاز کربن دی‌اکساید، درجه حرارت مطلوب، افزودن فسفر و نیتروژن به‌صورت آمونیاک و تنظیم اسیدیتة مناسب، معمولاً سبب تسریع رشد آنها می‌شود (4).

روش‌های مختلفی‌ برای حذف فلزات سنگین از فاضلاب‌های آلوده وجود دارد که شامل رسوب شیمیایی، تبخیر، انعقاد / لخته‌سازی، انجماد / تثبیت، استخراج با حلال، استخراج با عوامل شلاتین[8]، تبادل‌ یونی، عملیات غشایی، عملیات الکتروشیمیایی، سیمانی‌‌کردن، شیشه‌ای‌‌شدن و جذب زیستی هستند (7). در جذب زیستی، دیوارة سلولی میکروارگانیسم‌ها حاوی مقادیر زیادی پلی‌ساکارید و پروتئین است و محل‌های فعال برای جذب فلزات دارد. ساختار دیوارة‌ سلولی میکروارگانیسم‌ها متفاوت است و بدین ترتیب، پتانسیل‌های متفاوتی در جذب فلزات سنگین دارند (8). وجود آبراه‌ها و نفوذ آنها به آب‌های زیر‌زمینی و بافت خاک باعث آسیب‌رساندن به اکوسیستم و هدررفت سرمایة ملی می‌شود. ﺳﺪ باطلة مس سرچشمه ﺑﻪ‌ﻣﻨﻈﻮر ذﺧﻴﺮه باطلۀ واﺣﺪ ﺗﻐﻠﻴﻆ و اﺳﺘﻔﺎدة ﻣﺠﺪد از آب آن اﺣﺪاث ﺷﺪه اﺳﺖ. ازﺟﻤﻠﻪ ورودی‌ﻫﺎی اﻳﻦ درﻳﺎچه، رودﺧﺎﻧﻪ ﺷﻮر اﺳﺖ ﻛﻪ ﺳﺮچشمه‌ آن زهاب اﺳﻴﺪی ﻣﻌﺪن است و در ﺑﻴﻦ راه، ﻳﻚ‌ﺳﺮی ﻓﺎﺿﻼب‌ﻫﺎی ﻣﺠﺘﻤﻊ و آب ﺗﻌﺪادی چشمه ﻧﻴﺰ ﺑﻪ آن اﺿﺎﻓﻪ ﻣﻲ‌ﺷﻮد. رﺳﻮﺑﺎت، ﺗﺮﻛﻴﺒﺎت گوﻧﺎگوﻧﻲ از اﻧﻮاع ﻛﺎﻧﻲ‌ها و ذرات آﻟﻲ ﻫﺴﺘﻨﺪ ﻛﻪ ﺳﻬﻢ ﻣﻬﻤﻲ در ﺗﺸﺨﻴﺺ الگوﻫﺎی آﻟﻮدگی ﺳﺎﻣﺎﻧﻪ‌ﻫﺎی آﺑﻲ دارﻧﺪ. اﻳﻦ ﻣﻮاد، ﻫﻢ ﺣﻤﻞ‌‌ﻛﻨﻨﺪه و ﻫﻢ ﻣﺨﺰﻧﻲ ﺑﺮای آﻻﻳﻨﺪه‌ﻫﺎ ﻣﺤﺴﻮب میﺷﻮﻧﺪ. فلزات سنگین تخلیه‌شده به داخل سدهای باطله ناشی از تأثیر فرایندهای طبیعی و کارخانه‌های تغلیظ است. پساب‌های کارخانة فناوری، عناصر سمی زیادی را با خود به داخل سد باطله حمل می‌کنند و در صورتی‌ که سدهای باطله پایداری لازم را در طراحی نداشته باشند، باعث نفوذ عناصر سمی به داخل آب‌های زیرزمینی می‌شوند (9). برای جلوگیری از مشکلات سلنیوم در سد باطله و کمک به افزایش میزان سلنیوم استفاده‌شده در کارخانه‌، از روش‌های‌ کم‌هزینه مانند استفاده از میکروارگانیسم‌های‌ بومی جاذب سلنیوم موجود در پساب و سد باطله می‌توان استفاده کرد. هدف از انجام این مطالعه، جداسازی و غربالگری ‌باکتری‌های مقاوم به سلنیوم از پساب سد باطلة مس سرچشمه و ارزیابی حذف آن از پساب مجتمع مس سرچشمه با سویه‌های مقاوم و شناسایی ژنتیکی سویة‌ برتر در حذف این شبه‌فلز بود.

مواد و روش‌ها:

نمونه‌گیری

نمونه‌گیری طی ماه‌های بهمن و اسفند 1393 و اردیبهشت و خرداد 1394 از 4 منطقة مختلف سد (در موقعیت 17 کیلومتری شمال‌شرق مجتمع مس سرچشمه)، شامل پساب ورودی سد ‌باطله، آب و رسوبات ته‌نشین‌شدة‌ پشت سد، رسوبات خشک و مرطوب قسمت‌های میانی در خلیج‌های عاری از آب و خروجی سد انجام گرفت و در ظروف پلاستیکی تمیز ریخته شدند. نمونه‌ها به اندازه‌ای داخل ظرف ریخته شدند که بخشی از ظرف به‌منظور تسهیل در هم‌زدن نمونه خالی ‌بماند. سپس ظروف نمونه‌ها، نشانه‌گذاری و تاریخ زده شدند و در جعبه‌ حاوی ‌یخ سریعاً به آزمایشگاه منتقل شدند (10).

 

تهیه‌ رقت از نمونه‌ها و خالص‌سازی‌ کشت

ابتدا نمونه‌های مایع، هم زده و به‌منظور ته‌نشینی رسوبات، در جای ساکن قرار داده شدند. پس از ته‌نشینی، 1 میلی‌لیتر از نمونه‌های مایع (1 گرم از نمونه‌های جامد) در لوله آزمایش حاوی 9 میلی‌لیتر سرم فیزیولوژی استریل برای تهیه رقت‌های متوالی افزوده شد و از رقت‌های 01/0 و 001/0، مقدار 1/0 میلی‌لیتر، برداشت و با استفاده از میله‌ ‌شیشه‌ای در محیط کشت لوریا‌ برتانی آگار[9] حاوی 10 میلی‌گرم بر لیتر سدیم‌سلنیت کشت سطحی شد و به مدت 48 ساعت در دمای 34 درجه سانتی‌گراد نگهداری ‌شد. در ادامه، از پرگنه‌های حاصل در محیط مذکور کشت خالص تهیه شد (1).

 

حداقل غلظت ممانعت‌کننده[10] از رشد باکتری ‌برای سلنیوم

سویه‌های خالص در محیط کشت لوریا‌ برتانی آگار حاوی 100 تا 500 میلی‌مولار سدیم‌سلنیت برای تعیین میزان مقاومت سویه‌ها، استفاده و پس از کشت، به مدت 24 ساعت در 30 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند (1).

 

تولید توده‌ زیستی[11]

نمونه‌هایی‌ که بیشترین مقاومت را در آزمون حداقل غلظت ممانعت‌کننده (MIC) از رشد داشتند، برای تولید توده‌ زیستی جداسازی شدند و در 5 میلی‌لیتر محیط کشت لوریا ‌برتانی ‌براث، کشت و 24 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‌گراد نگهداری ‌شدند. پس از این مدت، در صورت مشاهده کدورت، 5 میلی‌لیتر محیط کشت حاوی ‌باکتری‌ به 45 میلی‌لیتر محیط کشت ذکرشده، اضافه و به مدت 5 الی 6 روز در گرمخانه‌ هم‌زن‌دار با دور 120 دور بر دقیقه قرار داده شد. پس از این مدت برای تولید توده‌ زیستی‌ بیشتر، 50 میلی‌لیتر محیط کشت حاوی‌ باکتری‌ به 450 میلی‌لیتر محیط کشت لوریا‌ برتانی ‌براث افزوده شد (11).

 

خشک‌کردن در انجماد

 به‌منظور نگهداری توده‌ زیستی و برای خشک‌کردن آن برای ماندگاری‌ بیشتر، از روش انجماد در خلأ استفاده شد. ابتدا برای جداسازی محیط کشت از توده‌ زیستی، نمونه‌های غنی‌شده به مدت 20 دقیقه با 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس مایع رویی، جدا و رسوب باکتریایی استفاده شد. به‌منظور خلوص رسوب باکتریایی، بخش ته‌نشین‌شده به همراه سرم فیزیولوژی استریل به مدت 5 دقیقه با 5000 دور بر دقیقه، سانتریفیوژ و محلول رویی دور ریخته شد. سپس توده‌ زیستی جداشده برای خشک‌شدن نمونه‌ ‌باکتریایی، به مدت 10 الی 24 ساعت در دستگاه خشک‌کن انجمادی[12] قرار گرفت (11).

 

جذب توسط توده‌ زیستی و اثر عوامل میزان توده‌ تلقیحی، اسیدیته و دما بر آن

برای مشاهده میزان جذب سلنیوم توسط توده‌ زیستی تولیدشده، آزمایشی طراحی شد و میزان جذب آن در محلول 100 میلی‌گرم بر لیتر سلنیوم در شرایط مختلف دمایی، اسیدیته و مقدار توده تلقیحی، در مدت زمان‌های مشخص بررسی ‌شد. برای‌ بررسی اثر میزان توده تلقیحی‌ بر جذب سلنیوم، به لوله‌های محتوی محلول حاوی فلز، با استفاده از ترازوی دیجیتالی مقدار 1، 2 و 4 درصد از توده‌ زیستی، اضافه و به مدت 20، 40 و 60 دقیقه نگهداری ‌شدند. سپس محلول‌ها به مدت 10 دقیقه در 3000 دور بر دقیقه، سانتریفیوژ و محلول رویی‌ برای ‌بررسی میزان سلنیوم باقی‌مانده، به لوله‌های تمیز منتقل شدند. درب لوله‌ها توسط پارافیلم، بسته و سپس در دمای 4 درجه سانتی‌گراد ‌یخچال‌گذاری شد (11). برای ‌بررسی اثر اسیدیته بر میزان جذب توده‌ زیستی، این عامل در 3 میزان 5، 6 و 7 ارزیابی شد. تنظیم اسیدیته‌ محلول بعد از افزودن به نسبت مساوی از توده‌ زیستی، انجام و در مدت زمان‌های 20، 40 و 60 دقیقه نگهداری شد و سپس به مدت 10 دقیقه در 3000 دور بر دقیقه، سانتریفیوژ و فاز مایع برای مرحله بعد همانند آزمون قبلی ‌نگهداری‌ شد (11). برای ‌بررسی اثر دما، لوله‌های حاوی محلول سدیم‌سلنیت درون بن‌ماری 25، 30 و 35 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت و بعد از ‌یکسان‌شدن دمای محلول با دمای ‌بن‌ماری، میزان مساوی از توده زیستی ‌به درون لوله‌ها اضافه شد و در مدت 20، 40 و60 دقیقه باقی ماند. سپس به مدت 10 دقیقه در 3000 دور بر دقیقه، سانتریفیوژ و برای استفاده‌ بعدی درون لوله‌های تمیز و در دمای 4 درجه‌ سانتی‌گراد نگهداری ‌شد (12).

 

بررسی میزان سلنیوم حذف‌شده

برای ‌بررسی میزان سلنیوم حذف‌شده توسط توده‌ زیستی، از دستگاه اسپکتروسکوپی جذب اتمی[13] به روش شعله استفاده شد. این روش میزان سلنیوم کل باقی‌مانده در محلول را اندازه‌گیری می‌کند. برای انجام این عملیات، ابتدا محلول‌ها توسط صافی سر سرنگی 2/0 میکرومتر صاف شدند و سپس از مایع حاصل‌شده جذب اتمی در طول موج 220 نانومتر به دست آمد (12).

 

آزمون‌های‌بیوشیمایی

آزمون‌های‌ بیوشیمیایی (کاتالاز، اوره‌از، اکسیداز، حرکت، اندول‌زایی، تولید هیدروژن سولفوره و تخمیر قندها)، رنگ‌آمیزی گرم (برای مشاهده نوع باکتری و شکل و وجود اسپور)، تحمل بیشترین غلظت نمک و تحمل دمایی ‌برای ‌شناسایی اولیه‌ سویه‌هایی‌ انجام شدند که بیشترین جذب را داشتند (13, 14).

 

آزمون شناسایی ژنتیکی

برای ‌شناسایی دقیق جنس و گونه‌ سویه‌های منتخب، آزمون ژنتیکی واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز با تکثیر ژن 16S rRNA انجام شد. بدین منظور برای استخراج DNA، باکتری‌ها در 30 میلی‌لیتر محیط کشت CG[14]، تلقیح و به مدت 5 تا 7 روز در شیکر انکوباتور (دمای 28 درجه سانتی‌گراد 120 دور بر دقیقه) نگهداری‌ شدند. بعد از رشد باکتری و اطمینان از ﺁلوده‌نبودن ﺁن، پرگنه‌های باکتری در میکروتیوب‌های 2 میلی‌لیتری در 6000 دور بر دقیقه به مدت 2 دقیقه رسوب داده شد. 500 میکرولیتر از بافر تریس اتیلن دی‌آمین تترا‌استیک اسید[15] به علاوه 15 میکرولیتر ﺁنزیم لیزوزیم به رسوب، اضافه و پس از ورتکس شدید به مدت 2 تا 3 دقیقه به مدت یک ساعت در 55 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. 50 میکرولیتر سدیم دودسیل سولفات[16] (10 درصد) و 10 میکرولیتر پروتئیناز K (کراتین) (20 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) به رسوب اضافه شدند و برای 10 دقیقه در 65 درجه سانتی‌گراد نگهداری ‌شد. 200 میکرولیتر سدیم‌کلراید 5 مولار به لوله، افزوده و پس از ورتکس به مدت 30 ثانیه، مقدار 150 میکرولیتر بافر ستیل تری‌متیل آمونیوم بروماید / سدیم‌کلراید[17] اضافه شد و به‌ﺁرامی و با سر و ته کردن تیوب، مخلوط و به مدت 10 دقیقه در 65 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. پس از سردشدن محلول تا دمای 37 درجه سانتی‌گراد برای جداسازی مولکول‌های پروتئینی از عصاره، هم حجم محلول فوق، کلروفرم / ایزوﺁمیل الکل (24 به 1) اضافه شد و 10 تا 15 دقیقه با سر و ته کردن تیوب، مخلوط و سپس به مدت 10 دقیقه در 14000 دور بر دقیقه سانتریفیوژ شد (این مرحله برای فاز رویی حاصل، برای خروج کامل ﺁلودگی‌های پروتئینی تکرار شد). فاز رویی به یک تیوب جدید منتقل شد و 8/0 حجم ﺁن، ایزوپروپانول سرد (20- درجه سانتی‌گراد)، افزوده و با سر و ته کردن تیوب کلاف سفید رنگ DNA تشکیل شد. لوله‌ها به مدت 30 دقیقه در 20- درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. سپس در صورت غلیظ‌بودن نمونه، DNA کلاف تشکیل‌شده توسط لوله‌ دهان‌گشاد استریل به لوله جدید حاوی اتانول 70 درصد، منتقل و پس از شستشو به مدت 101 دقیقه در 14000 دور بر دقیقه و در 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شد و درنهایت، DNA خالص به دست آمد. با محاسبۀ نسبت میزان جذب نمونه در طول موج‌های 260 و 280 نانومتر که حد مطلوب آن 8/1 است، براساس میزان جذب نمونه در طول موج 260 نانومتر، مقدار DNA به‌دست‌آمده نیز تعیین‌ شد (15). پرایمرهای به‌کاررفته در تکثیر ژن 16S rRNA باکتریایی و مشخصات آنها در جدول 1 ارائه شده‌اند. 

 

جدول 1- مشخصات پرایمرهای به‌کاررفته در پژوهش

Table 1- Specifications of the primers utilized in the study

نام پرایمر	توالی پرایمر	اندازه قطعه	منبع
27F	AGAGTTTGATCMTGGCTCAG	1500 جفت باز	(16)
1492R	GGTTACCTTGTTACGACTT	1500جفت باز	(16)

 

 

ژن 16S rRNA باکتری جداشده با استفاده از برنامه دمایی ارائه‌شده در جدول 2 تکثیر ‌شد (15).

 

جدول 2- برنامه دمایی تکثیر

Table 2- Temperature program of reproduction

مرحله	زمان (ثانیه)	دما (درجه سانتی‌گراد)	دوره
تقلیب ابتدایی	180	94	-
تقلیب	60	94	25 چرخه
جفت‌شدن	45	55	-
بسط	90	72	-
بسط نهایی	300	72	-

 

 

این واکنش در میکروتیوب‌های 2/0 میلی‌لیتری و با استفاده از مقادیر مندرج در جدول 3 انجام شد. کنترل منفی ‌نیز مطابق همین دستورالعمل تهیه شد؛ با این تفاوت که به‌جای DNA الگو از آب تزریقی ‌به‌کاررفته در مراحل تهیه DNA الگو استفاده شد (15).

 

جدول 3- مقادیر معرف‌های ‌به‌کاررفته در PCR

Table 3- Values of reagents used in PCR

اجزا	حجم (میکرولیتر)	غلظت نهایی
بافر  PCR (10X)	5	1X
دزوکسی ریبونوکلئوتید تری فسفات (10 میلی‌مول)	1	200 میکرومول
پرایمر فوروارد (10 میکرومول)	5	1 میکرومول
پرایمر ریورس (10 میکرومول)	5	1 میکرومول
آنزیم تک پلیمراز (5 واحد بر میکرولیتر)	5/0	5 واحد بر 100 میکرولیتر
محلول 50 میلی‌مولار منیزیم‌کلراید	5/1	5/1 میلی‌مولار
آب مقطر سترون	22	-
DNA الگو	10	-
کل	50	-

 

 

الکتروفورز و بررسی محصولات

پس از پایان واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، محصول آن توسط ژل آگارز 1 درصد با استفاده از محلول بافری1X TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) در دمای اتاق الکتروفورز شد. برای تهیه‌ ژل و انجام الکتروفورز، 1 گرم پودر آگارز، توزین و با 100 میلی‌لیتر بافر مخلوط شد. مخلوط حاصل به صورتی حرارت داده شد که از جوشیدن آن جلوگیری شود و همه کریستال‌های آگارز کاملاً حل شوند. با رسیدن محلول به دمای حدود 50 درجه سانتی‌گراد، به آن 5/2 میکرولیتر اتیدیوم بروماید[18]، افزوده و به‌آرامی مخلوط شد. محلول فوق در‌حالی‌که هنوز منجمد نشده است، داخل قالب الکتروفورز با شانه مناسب منتقل شد. بعد از انعقاد ژل، شانه به‌آرامی، خارج و سپس روی آن بافر TAE (1X) اضافه شد؛ به‌طوری‌که کمی روی سطح ژل پوشیده شد. سپس محصول PCR به نسبت 6 به 1 با لودینگ بافر[19] مخلوط شد. پس از قراردادن نمونه‌ها و شاهد در داخل چاهک‌ها، مقدار 4 میکرولیتر نشان‌گر به داخل چاهک اول منتقل شد. مارکر استفاده‌شده در این تحقیق نردبانDNA [20] ساخت شرکت سیناکلون با فاصلة 100 جفت‌باز از وزن 100 تا 3000 جفت‌باز بود. سپس ظرف محتوی ژل به صورتی درون تانک الکتروفورز قرار داده ‌شد که چاهک‌ها در طرف قطب منفی تانک قرار گیرند. تانک به جریان الکتریسیته، متصل و ولتاژ روی 100 تا 110 تنظیم ‌شد. پس از 40 دقیقه، ژل، بررسی و از میزان رنگی که در ژل پیشروی کرده است، زمان پایان الکتروفورز تخمین زده شد. پس ‌از پایان الکتروفورز، ژل از بافر خارج شد و در دستگاه مستندسازی ژل[21] قرار گرفت و ضمن مشاهده باندها در مقایسه با لدر، با دوربین مخصوص عکس گرفته و ذخیره‌سازی انجام شد (17).

 

تعیین توالی نوکلئوتیدی[22] و بیوانفورماتیک

بعد از انجام الکتروفورز و مشاهده نوار مربوط به قطعه تکثیرشده، محصول  PCRبرای تخلیص و تعیین توالی به همراه پرایمرهای پیشرو به شرکت بیونیر[23] کره جنوبی ‌با واسطه شرکت تکاپو زیست (تهران، ایران) ارسال‌ شد تا توالی‌های محصولات مشخص و تأیید شوند. معمولاً تعیین توالی به شیوة یک‌طرفه و با استفاده از ‌یکی از پرایمرهای پیشرو ‌یا برگشتی انجام می‌شود. در تحقیق حاضر از نرم‌افزار کروماس[24] نسخۀ 3-2-4 استفاده شد. درنهایت، توالی ‌به‌دست‌آمده در مقابل داده‌های توالی ‌نوکلئوتیدهای موجود در بانک ژن به شیوه بلاست بررسی ‌شد (18).

نتایج:

پس از بررسی ماکروسکوپی ‌کلنی‌ها از لحاظ رنگ، شکل، قوام و اندازه، سویه‌های مدنظر، جدا و برای تعیین مقاومت آنها نسبت به غلظت‌های‌ بالای سلنیوم بررسی ‌شدند. از 14 سویه جدا‌شده از پساب‌ها 2 سویه شماره 4 و 13 مقاومت خوبی نسبت به غلظت بالای سلنیوم اضافه‌شده به محیط کشت (400 میلی‌مولار) نشان دادند. این دو نمونه برای تولید توده‌ زیستی برای استفاده در آزمون جذب زیستی سلنیوم انتخاب و استفاده شدند. نتایج مربوط به حداقل غلظت ممانعت‌کننده از رشد در جدول 4 آورده شده‌اند.

 

 

 

جدول 4- آزمون حداقل غلظت ممانعت‌کنندة رشد باکتری‌ها در رقت‌های 100 تا 500 میلی‌مولار سدیم‌سلنیت

Table 4- Test of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of bacterial growth in sodium selenite dilutions ranging from 100 to 500 mM

شماره‌ سویه	غلظت سلنیوم (میلی‌مولار)
	100	200	300	400	500
1	+	-	-	-	-
2	+	-	-	-	-
3	+	-	-	-	-
4	+	+	+	+	-
5	+	-	-	-	-
6	+	-	-	-	-
7	+	-	-	-	-
8	+	-	-	-	-
9	+	-	-	-	-
10	-	-	-	-	-
11	+	+	+	-	-
12	+	+	+	-	-
13	+	+	+	+	-
14	+	+	+	-	-

 

 

نتایج حاصل از آزمون‌های جذب فلز با آنالیز جذب اتمی، تغییر میزان جذب سلنیوم را (با به‌کارگیری مقادیر مختلف توده‌ زیستی تلقیحی سویه‌های‌ منتخب در محلول حاوی 100 میلی‌گرم بر لیتر سدیم‌سلنیت) نشان داد که در جدول 5 ارائه شده‌اند.

 

جدول 5- تغییرات حاصل از اضافه‌کردن مقادیر 1، 2 و 4 درصد بیوماس باکتری ‌به محلول حاوی 100 میلی‌گرم بر لیتر سدیم‌سلنیت

Table 5- Changes resulting from adding 1, 2 and 4% of bacterial biomass to a solution containing 100 mg/L of sodium selenite

میزان جذب سلنیوم جدایه شماره 13 (میلی‌گرم بر لیتر)	میزان جذب سلنیوم جدایه شماره 4 (میلی‌گرم بر لیتر)	زمان (دقیقه)	میزان توده زیستی تلقیحی (%)
3/75	6/39	20	1
9/72	8/58	40	1
7/65	9/60	60	1
8/76	9/43	20	2
5/61	5/61	40	2
6/75	8/67	60	2
1/95	1/56	20	4
9/51	2/58	40	4
75	4/71	60	4

 

 

همان‌طور‌ که مشاهده می‌شود بالاترین میزان جذب برای سویه‌ ‌شماره 4 در میزان توده‌ زیستی 4 درصد در مدت 60 دقیقه و برای سویه‌ ‌شماره 13 در میزان توده‌ زیستی 4 درصد در مدت 20 دقیقه مشاهده شد. برای‌ بررسی معنی‌داری اثر بیومس و زمان در جدایه‌ 4‌ یک آزمون تحلیل تک متغیره واریانس[25] انجام شد و نشان داد عوامل توده‌ زیستی، زمان و اثر متقابل آنها در P<0.05 اثر معنی‌داری ‌بر جذب سلنیوم از محیط مایع توسط سویه‌‌ شماره 4 دارد (شکل 1).

 

 

شکل 1- میانگین میزان جذب سلنیوم توسط سویه‌ ‌شماره 4 در سه سطح توده زیستی و سه سطح زمان 20، 40 و60 دقیقه

Fig 1- The average amount of selenium absorption by strain number 4 at three biomass levels and three time levels of 20, 40, and 60 minutes

 

 

برای ‌بررسی ‌بهترین حالت اثر عوامل توده‌ زیستی و زمان در جذب سلنیوم توسط سویه‌ ‌شماره 4،‌ یک آزمون دانکن[26] انجام شد و نتایج نشان دادند در میزان توده‌ سلولی 4 درصد و زمان 60 دقیقه بیشترین میزان میانگین جذب در آزمون‌ها وجود داشت. برای‌ بررسی معنی‌داری اثر بیومس و زمان در جدایه‌ 13‌ یک آزمون تحلیل تک متغیره واریانس انجام شد و نشان داد عوامل توده‌ زیستی، زمان و اثر متقابل آنها در P<0.05 اثر معنی‌داری ‌بر جذب سلنیوم از محیط مایع توسط سویه‌ ‌شماره 13 داشت (شکل 2).

 

 

شکل 2- میانگین میزان جذب سلنیوم توسط سویه‌ ‌شماره 13 در سه سطح توده زیستی و سه سطح زمان 20، 40 و60 دقیقه

Fig 2- The average amount of selenium absorption by strain number 13 at three biomass levels and three time levels of 20, 40, and 60 minutes

 

برای ‌بررسی‌ بهترین حالت اثر عوامل توده‌ زیستی و زمان در جذب سلنیوم توسط سویه‌ ‌شماره 13،‌ یک آزمون دانکن انجام شد و نتایج نشان دادند در میزان توده‌ سلولی 4 درصد و زمان 20 دقیقه بیشترین میزان میانگین جذب در آزمون‌ها وجود داشت. تغییر در میزان جذب سلنیوم در مقادیر مختلف اسیدیته برای دو سویه‌ منتخب در محلول حاوی 100 میلی‌گرم بر لیتر سدیم‌سلنیت در جدول 6 ارائه شده است.

 

جدول 6- نتایج حاصل از جذب زیستی‌ بیوماس درpH  برابر با 5، 6 و 7، محلول حاوی 100 میلی‌گرم بر لیتر سدیم‌سلنیت

Table 6- The results of biosorption of biomass at pH levels of 5, 6, and 7 in a solution containing 100 mg/L of sodium selenite

میزان جذب سلنیوم جدایه شماره 13 (میلی‌گرم بر لیتر)	میزان جذب سلنیوم جدایه شماره 4 (میلی‌گرم بر لیتر)	زمان (دقیقه)	اسیدیته
4/5	3/24	20	5
8/7	8/73	40	5
3/6	63	60	5
25	32	20	6
6/34	45	40	6
8/46	8/39	60	6
34	4/28	20	7
4/40	8/38	40	7
4/48	32	60	7

 

همان‌طور که مشاهده می‌شود بالاترین میزان جذب برای سویه‌ ‌شماره 4 در اسیدیته‌ 5 در مدت 40 دقیقه و برای سویه‌ ‌شماره 13 در اسیدیته‌ 7 در مدت 60 دقیقه مشاهده شد. برای ‌بررسی معنی‌داری اثر اسیدیته و زمان در جدایه‌ 4‌ یک آزمون تحلیل تک متغیره واریانس انجام شد و نشان داد عوامل اسیدیته، زمان و اثر متقابل آنها در P<0.05 اثر معنی‌داری ‌بر جذب سلنیوم از محیط مایع توسط سویه‌ ‌شماره 4 داشت (شکل 3).

 

 

شکل 3- میانگین میزان جذب سلنیوم توسط سویه‌ ‌شماره 4 در سه سطح اسیدیته و سه سطح زمان 20، 40 و60 دقیقه

Fig 3- The average amount of selenium absorption by strain number 4 at three levels of acidity and three different time intervals of 20, 40, and 60 minutes

 

 

برای ‌بررسی ‌بهترین حالت اثر عوامل اسیدیته و زمان در جذب سلنیوم توسط سویه‌‌ شماره 4،‌ یک آزمون دانکن انجام شد و نتایج نشان دادند در اسیدیته‌ 5 و زمان 40 دقیقه بیشترین میزان میانگین جذب در آزمون‌ها وجود داشت. برای ‌بررسی معنی‌داری اثر اسیدیته و زمان در جدایه‌ 13‌ یک آزمون تحلیل تک متغیره واریانس انجام شد و نشان داد عوامل اسیدیته، زمان و اثر متقابل آنها در P<0.05 اثر معنی‌داری ‌بر جذب سلنیوم از محیط مایع توسط سویه‌ ‌شماره 13 داشت (شکل 4).

 

 

شکل 4- میانگین میزان جذب سلنیوم توسط سویه‌‌ شماره 13 در سه سطح اسیدیته و سه سطح زمان 20، 40 و60 دقیقه

Fig 4- The average amount of selenium absorption by strain number 13 at three levels of acidity and three different time intervals of 20, 40, and 60 minutes

 

 

برای ‌بررسی ‌بهترین حالت اثر عوامل اسیدیته و زمان در جذب سلنیوم توسط سویه‌ ‌شماره 13،‌ یک آزمون دانکن انجام شد و نتایج نشان دادند در اسیدیته 7 و زمان 60 دقیقه بیشترین میزان میانگین جذب در آزمون‌ها وجود داشت. تغییر در میزان جذب سلنیوم در مقادیر مختلف دما برای دو سویه‌ منتخب در محلول حاوی 100 میلی‌گرم بر لیتر سدیم‌سلنیت در جدول 7 ارائه شده است.

 

جدول 7- نتایج جذب زیستی سلنیوم در دمای 25، 30 و 35 درجه سانتی‌گراد در محلول 100 میلی‌گرم بر لیتر سدیم‌سلنیت از دو جدایه مدنظر

Table 7- Selenium biosorption results at 25, 30, and 35 °C in a 100 mg/L sodium selenite solution from the two isolates under consideration

 

دما (سانتی‌گراد)	زمان (دقیقه)	میزان جذب سلنیوم جدایه شماره 4 (میلی‌گرم بر لیتر)	میزان جذب سلنیوم جدایه شماره 13 (میلی‌گرم بر لیتر)
25	20	1/51	8/85
25	40	66	8/64
25	60	7/62	9/51
30	20	7/56	45
30	40	2/58	9/45
30	60	8/55	6/15
35	20	6/39	1/62
35	40	4/59	7/32
35	60	9/39	1/8

 

 

همان‌طور که مشاهده می‌شود بالاترین میزان جذب برای سویه‌ ‌شماره 4 در دمای 25 درجه سانتی‌گراد در مدت 40 دقیقه و برای سویه‌ ‌شماره 13 نیز در همین دما در مدت 20 دقیقه مشاهده شد. برای ‌بررسی معنی‌داری اثر دما و زمان در جدایه‌ 4‌ یک آزمون تحلیل تک متغیره واریانس انجام شد و نتایج نشان دادند عوامل دما، زمان و اثر متقابل آنها در P<0.05 اثر معنی‌داری ‌بر جذب سلنیوم از محیط مایع توسط سویه‌‌ شماره 4 داشت (شکل 5).

 

 

شکل 5- میانگین میزان جذب سلنیوم توسط سویه‌ ‌شماره 4 در سه سطح دما و سه سطح زمان 20، 40 و60 دقیقه

Fig 5- The average amount of selenium absorption by strain number 4 at three temperature levels and three time levels of 20, 40, and 60 minutes

 

 

برای‌ بررسی ‌بهترین حالت اثر عوامل دما و زمان در جذب سلنیوم توسط سویه‌ ‌شماره 4،‌ یک آزمون دانکن انجام شد و نتایج نشان دادند در دمای 25 و زمان 40 دقیقه بیشترین میزان میانگین جذب در آزمون‌ها وجود داشته است. برای ‌بررسی معنی‌داری اثر دما و زمان در جدایه‌ 13‌ یک آزمون تحلیل تک متغیره واریانس انجام شد و نتایج نشان دادند عوامل دما، زمان و اثر متقابل آنها در P<0.05 اثر معنی‌داری ‌بر جذب سلنیوم از محیط مایع توسط سویه‌ شماره 13 داشت (شکل 6).

 

 

شکل 6- میانگین میزان جذب سلنیوم توسط سویه‌‌ شماره 13 در سه سطح دما و سه سطح زمان 20، 40 و60 دقیقه

Fig 6- The average amount of selenium absorption by strain number 13 at three temperature levels and three time levels of 20, 40, and 60 minutes

 

 

برای‌ بررسی ‌بهترین حالت اثر عوامل دما و زمان در جذب سلنیوم توسط سویه‌ ‌شماره 13،‌ یک آزمون دانکن انجام شد و نتایج نشان دادند در دمای 25 درجه‌ سانتی‌گراد و زمان 20 دقیقه بیشترین میزان میانگین جذب در آزمون‌ها وجود داشت. نتایج آزمون‌های ‌بیوشیمیایی ‌برای تعیین جنس و گونه دو سویه برتر در جدول 8 مشاهده می‌شود.

 

جدول 8- نتایج آزمون‌های ‌بیوشیمیایی ‌برای تعیین جنس و گونه دو سویه برتر

Table 8- Results of biochemical tests to determine the genus and species of the top two strains

صفت	سویه 4	سویه 13
شکل	میله‌ای	میله‌ای رشته‌ای
واکنش گرم	مثبت	منفی
کاتالاز	+	+
اکسیداز	+	+
اوره آز	+	-
اسپورزایی	+	+
اندول	-	-
حرکت	+	+
سولفید هیدروژن	-	-
تحمل نمک	5%	5%
گستره دمایی رشد	25-41 سانتی‌گراد	10-40 درجه سانتی‌گراد
دمای‌ بهینه	30 سانتی‌گراد	28-30 درجه سانتی‌گراد

 

 

نتایج شناسایی میکروارگانیسم به کمک واکنش‌های زنجیره‌ای پلیمراز به روش تعیین ترادف 16S rDNA

در مرحله نخست بخش عمده‌ای از توالی ژن 16S rDNA با استفاده از پرایمرهای27F  و 1492R تکثیر شد. تصویر ژل آگارز حاصل از تکثیر ژن 16S rDNA سویه‌های مدنظر در شکل 7 آورده شده است.

 

 

شکل 7- راست: ژل آگارز حاصل از تکثیر ژن 16S rDNA سویه‌های مدنظر، از سمت راست به‌ترتیب جدایه 1، جدایه 2، مارکر، کنترل مثبت، کنترل منفی، چپ: لدر به‌کاررفته

Fig 7- Right: Agarose gel showing the amplification of the 16S rDNA gene from the strains considered. From right to left: Isolate 1, Isolate 2, Marker, Positive Control, and Negative Control. Left: Ladder used

 

ژن‌های تکثیرشده سپس تعیین توالی شدند و نتایج مقایسه این توالی با توالی‌های موجود در بانک اطلاعاتی مرکز ملی ‌برای اطلاعات بیوتکنولوژی[27] به‌صورت درخت‌های فیلوژنتیک[28] با روش اتصال همسایه[29] (NJ) در شکل‌های 8 و 9 مشاهده می‌شوند.

 

 

شکل 8- درخت فیلوژنتیک مربوط به سویه‌ باسیلوس تورنجینسیس

Fig 8- Phylogenetic tree related to Bacillus thuringiensis

 

 

شکل 9- درخت فیلوژنتیک مربوط به سویه‌ تالازوسپیرا پرمنسیس

Fig 9- Phylogenetic tree related to Thalassospira permensis

 

 

بحث:

قدم اول در شناسایی میکروارگانیسم‌‌هایی ‌که قادر به پاکسازی محیط زیست هستند، توانایی ‌شناسایی انواع مقاوم به فلزات سنگین است که می‌تواند در انتخاب سویه‌های‌ برتر برای حذف این ترکیبات سمی راه‌گشا باشد. توانایی جذب فلزات سنگین و سمی توسط میکروارگانیسم‌ها منجر به توجه خاص محققان به مطالعه انواع قارچ‌ها، مخمرها، جلبک‌ها و باکتری‌های مختلف برای جذب و به‌دنبال آن حذف آنها از محیط زیست و به‌خصوص پساب‌های‌ کارخانه‌های صنعتی، رودخانه‌ها و فاضلاب‌های آلوده به این گونه فلزات شده است (11). مشخص شده است سلنیوم در پساب صنایع و معادن مس تا 2000 میکروگرم بر لیتر و در کانی مس 20 تا 82 میکروگرم بر گرم می‌تواند وجود داشته باشد (19). در این تحقیق سعی‌ بر آن شد تا با جداسازی و شناسایی ‌باکتری‌هایی‌ که دارای توانایی تحمل غلظت‌های ‌بالای سلنیوم هستند، آنها را در جذب زیستی این عنصر به کار گرفت. ماییرز^[xxx] و همکاران (1998) با جداسازی‌ باکتری‌ها از ‌یک محیط غنی از سلنیوم چنین رویه‌ای را در پیش گرفته بودند. آنها از محیط‌های آبی، رسوبات و خاک، نمونه‌ها را جدا کردند که از 44 نمونه‌ جمع‌آوری‌شده، 20 سویه میکروبی توانایی احیای سلنات به سلنیوم را داشتند. در این آزمون مقدار 100 میلی‌گرم بر لیتر سلنات به‌طور کامل در‌ یک هفته گرمخانه‌گذاری تغییر ‌یافت و حدود 75 میلی‌گرم در هر لیتر، سلنات بیشتر از سلنیت به سلنیوم تبدیل شد (20). جداسازی ‌نمونه‌ها از محیط مشابه، فرایند به‌کارگرفته‌شدة این تحقیق بود؛ اما در به‌کارگیری ‌نمک‌های سلنیوم فقط از سلنیت استفاده شد. در این تحقیق صرفاً غربالگری ‌باکتری ‌برای جذب سلنیوم انجام شد. کومار^[xxxi] و همکاران (2010) از چهار نمونه میکروارگانیسم استفاده کردند که شامل باکتری و قارچ بودند. آنها میکروارگانیسم‌ها را برای حذف چند فلز سنگین بررسی ‌کردند؛ اما در آزمایش انجام‌شده جذب سلنیوم درخور توجه بود. پارامترهای مدنظر در این تحقیق برای پیداکردن شرایط بهینه به‌منظور جذب بیشتر سلنیوم شامل غلظت توده زیستی، اسیدیته و دما در بازه زمانی مشخص بودند (21). سالم^[xxxii] و همکاران (2010) از ساکارومایسس سرویزیه^[xxxiii] برای جذب بهینه 3 فلز سنگین استفاده کردند. نتایج آنها نشان دادند بیشترین ظرفیت جذب کادمیوم، روی و مس به‌ترتیب در اسیدیته 5/8، 6 و 6 بود. سایر پارامترها در مقادیر اسیدیته بهینه ارزیابی شدند و نتایج نشان دادند با افزایش زمان تماس، راندمان حذف سه یون فلزی افزایش یافت. همچنین بازدهی حذف، با افزایش دوز مخمر تا 2 درصد، افزایش و با افزایش دوز مخمر تا 4 درصد کاهش یافت (22). کاهش راندمان حذف در پژوهش آنها ممکن است به‌دلیل تجمع مخمر باشد. آل آشه (1995) گزارش کرد جذب بیشتر در دوز زیست‌تودة کمتر می‌تواند به‌دلیل نسبت مناسب یون‌های فلزی و جاذب زیستی باشد که با افزایش دوز توده زیستی کاهش می‌یابد و ممکن است باعث تداخل بین محل‌های اتصال در دوز زیست‌تودة بالاتر شود. این احتمال وجود دارد که پروتون‌ها سپس با یون‌های فلزی ترکیب شوند و درنتیجه برهمکنش آنها با اجزای سلول را کاهش دهند (23). در تحقیق حاضر از توده‌ زیستی خالص باکتری برای جذب سلنیوم استفاده شد و نشان داد افزایش توده زیستی تا 4 درصد، باعث افزایش بازدهی جذب فلز شد که با نتایج سالم مطابقت ندارد.

فیشر^[xxxiv] در مطالعه‌ای برای جذب بیشتر سلنیوم توسط باکتری از ملاسی استفاده کرد ‌که حاوی مواد مغذی ‌برای ‌باکتری‌ها بود که نتایج این مطالعه مغایر با نتایج مطالعه حاضر بود. نتایج آنها نشان دادند باکتری ‌به همراه ملاس میزان سلنیوم کمتری را کاهش داد. باکتری ‌به همراه ملاس تنها 10 درصد غلظت اولیه فلز را کاهش داد؛ اما در شرایط مشابه و بدون حضور ملاس، 80 درصد غلظت اولیه کاهش یافت. نتایج نشان دادند غلظت پایین ملاس، کربن کافی در اختیار باکتری درحال رشد قرار داد که به جذب بیشتر سلنیوم منجر شد (24). مین^[xxxv] و همکاران (2011) ظرفیت جذب سلنیوم توسط توده زیستی جلبک اسپیروژیرا همراه نوستوک کومون^[xxxvi] را بررسی‌ کردند که نتایج آن حداکثر بازده حذف سلنیوم در دمای 60 درجه سانتی‌گراد به مدت 12 ساعت را نشان داد (25). در این تحقیق منبع سلنیوم نمک سدیم‌سلنات بود. روبرت^[xxxvii] و همکاران (2015) از جلبک گراسیلاریا^[xxxviii] به‌عنوان منبع زیستی‌ برای جذب سلنیوم استفاده کردند که نتایج آنها میزان ظرفیت جاذب برای سلنیوم 72/2 تا 6/2 میلی‌گرم سلنات در اسیدیته‌ ‌برابر با 5/2 تا 8 بود (26).

عبدالهی (1382) در فرایند لیچینگ، پارامترهایی مانند غلظت اسید، دما و اسیدیته را بررسی‌ کرد و نتیجه گرفت همه عوامل، بر فرایند لیچینگ مؤثر بودند و شرایط بهینه دمایی ‌برابر با 90 درجه سانتی‌گراد، غلظت اسید 4 مول و زمان 60 دقیقه بود. مشخص شد که در این شرایط 99 درصد فلز، حل و وارد محلول شد (27). میزان سلنیت به‌کار‌برده‌شده در مشخص‌کردن مقاومت جدایه‌ها به سلنیوم در حد بسیار بالا (میلی‌مولار) بود که تنها اجازه رشد به سویه‌های مقاوم نسبت به این عنصر را داد. همچنین ازطریق آزمون‌های‌ بیوشیمیایی و واکنش زنجیره‌ای پلیمراز می‌توان به شناسایی این گونه‌ها پرداخت. ذوالفقاری و همکاران (1392) سویه‌هایی از باکتری را شناسایی کردند که توانایی تحمل گستره بالایی از سلنیت‌ یعنی 500 و 550 میلی‌مولار را داشتند و براساس آزمون بیوشیمایی و PCR دو سویه مدنظر سودوموناس مارینکولا^[xxxix] سویهaf326382  و گونه باسیلوسfrb21125  شناخته شدند؛ درنهایت، برای ‌شناسایی دقیق از واکنش‌های زنجیره‌ای پلیمراز استفاده شد (1).

پیرز (2010) جدایه‌های ‌به‌دست‌آمده را از لحاظ خصوصیات فنوتیپی و تجزیه و تحلیل توالی16S rRNA  و آزمون تحمل با فلزات مختلف با گونه‌های مختلف بررسی‌ کرد. باکتری متالیدورانس^[xl] سویه CH34 در پالایش زیستی^[xli] سلنیوم، طلا و بخار جیوه مؤثر بود (10). در این پژوهش همچنین دو گونه ‌یافت‌شده در جذب زیستی سلنیوم مقایسه شدند و نشان داده شد که تالازوسپیرا پرمنسیس^[xlii] توانایی جذب سلنیوم بیشتری را به‌صورت سلنیت نسبت به باسیلوس تورنجینسیس^[xliii] داشت. اهرابی و همکاران (1392) در نتایج حاصل از تعیین حداقل غلظت ممانعت‌کنندة رشد نشان دادند سویه باسیلوس لیکنیفورمیس^[xliv] جداشده از کارخانه شیشه و بلور مقاومت بالاتری ‌نسبت به سودوموناس آئروجینوزا جداشده از پساب قیطریه داشت. این سویه همچنین دارای توانایی احیای ‌کامل سلنیت به سلنیوم عنصری ‌بود (28).

خسروان و همکاران با مقایسه توانایی جذب روی توسط لجن فعال^[xlv] در دامنه‌های مختلف اسیدیته، بهترین اسیدیته برای جذب روی را در اسیدیته 6 نشان دادند (29). در این تحقیق مشخص شد اسیدیته مناسب برای جذب سلنیوم توسط باسیلوس تورنجینسیس در مدت زمان 40 دقیقه برابر با 5 و برای تالازوسپیرا پرمنسیس در مدت زمان 60 دقیقه برابر با 7 بود. همچنین نتایج نشان دادند در باسیلوس تورنجینسیس با افزایش اسیدیته به 5، میزان جذب افزایش یافت؛ اما در تالازوسپیرا پرمنسیس با کاهش اسیدیته به 7 میزان جذب سلنیوم توسط این سویه افزایش داشت. سالم و همکاران با استفاده از مخمر نان در جذب سه عنصر کادمیوم، روی و مس نشان دادند اسیدیتة بهینه برای جذب این عناصر توسط ساکارومیسس سرویزیه برای‌ کادمیوم 6/8 و برای روی و مس 6 بود. همچنین اثر میزان توده مخمر بر جذب این عناصر نشان داد با افزایش میزان تا 2 گرم بر 100 میلی‌لیتر، میزان جذب افزایش‌ یافت؛ اما ‌با افزایش میزان مخمر از 2/2 تا 4 گرم در 100 میلی‌لیتر، میزان جذب کاهش داشت (22). در نتایج به‌دست‌آمده بیشترین میانگین جذب سلنیوم توسط باسیلوس تورنجینسیس توسط 4 درصد توده زیستی ‌باکتری در زمان 60 دقیقه بود؛ درحالی‌که بهترین شرایط جذب از لحاظ میزان بیومس تلقیحی تالازوسپیرا پرمنسیس 4 درصد میزان توده زیستی در 20 دقیقه بود که نشان داد افزایش میزان توده زیستی ‌باعث افزایش میزان جذب شد.

عبداللهی و همکاران با استفاده از روش تاگوچی و کاهش تعداد آزمایش‌ها به این نتیجه رسیدند که اگر عملیات لیچینگ در محیط اسیدی 4 مول صورت گیرد، در 100 درجه سانتی‌گراد طی 60 دقیقه، بیشترین میزان بازیابی سلنیوم را خواهند داشت (27). در این آزمایش نتایج نشان دادند استفاده از باسیلوس تورنجینسیس در 25 درجه سانتی‌گراد طی 40 دقیقه بیشترین میزان میانگین جذب صورت گرفت. این اثر در زمان 60 دقیقه و دمای 25 درجه سانتی‌گراد توسط تالازوسپیرا پرمنسیس نیز صورت گرفت که نشان داد دو سویه توانایی جذب در دمای آزمایشگاه و محیط را داشتند. همچنین نتایج این مطالعه ‌نشان داد بیشترین تأثیر در جذب سلنیوم را عامل دما داشت. حال آنکه بیشترین تأثیر در میزان جذب را در میان دو سویه تحقیق حاضر، عامل مقدار باکتری تلقیحی داشت که توسط تالازوسپیرا پرمنسیس صورت گرفت.

ملکوتیان و همکاران (1391) از جلبک اولوتریکس زوناتا^[xlvi] در حذف فلزات سنگین مس، روی، سرب و کادمیوم در شرایط مختلف استفاده کردند. طبق نتایج آنها در دمای 25 درجه سانتی‌گراد و اسیدیته 4 فلزات مس و سرب و در اسیدیته 5، روی و کادمیوم در مدت 60 دقیقه با میزان جاذب 5/1 گرم بر لیتر حذف شدند و در این بین میزان حذف مس، روی، سرب و کادمیوم به‌ترتیب 4/98، 2/96، 98 و 7/94 درصد بود (30). در مطالعه حاضر برای حذف فلز سلنیوم از محیط، به‌جای جلبک از باکتری استفاده شد و بهترین مقدار جاذب بیومس 4 درصد، دما 25 درجه سانتی‌گراد و اسیدیته 5، برای‌ باسیلوس تورنجینسیس و اسیدیته 7 برای تالازوسپیرا پرمنسیس بود. همچنین بهترین جذب توسط تالازوسپیرا پرمنسیس در توده زیستی 4 درصد در مدت 20 دقیقه انجام شد که 1/95 میلی‌گرم بر لیتر بود.

 

نتیجه‌گیری

نتایج حاصل از واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز و آزمون‌های ‌بیوشیمایی ‌نشان دادند دو سویه آزمایش‌شدة باسیلوس تورنجینسیس و تالازوسپیرا پرمنسیس هستند و باکتری دوم با جذب 1/95 میلی‌گرم بر لیتر از مقدار 100 میلی‌گرم بر لیتر سدیم‌سلنیت موجود در محیط در مدت زمان 20 دقیقه و با بیومس 4 درصد، از میزان جذب زیستی ‌بالایی ‌برخوردار بود. همچنین نتایج نشان دادند بیشترین میزان جذب زیستی سلنیوم در تالازوسپیرا پرمنسیس با افزایش میزان بیومس، در دمای 25 درجه سانتی‌گراد (دمای محیط) در اسیدیته‌ 7 و در باسیلوس تورنجینسیس با افزایش توده‌ زیستی 4 درصد، در دمایی مشابه و در اسیدیته‌ 5 بود. نتایج به‌دست‌آمده درمجموع تعیین کرد تالازوسپیرا پرمنسیس برای مطالعات میدانی می‌تواند پیشنهاد ‌شود و در حذف سلنیوم از محیط بسیار مؤثر باشد.

 

[1] Metallurgy

[2] Food supplement

[3] COVID-19

[4] Angiotensin-converting enzyme 2(ACE-2)

[5] Waste dams

[6] Metal extraction

[7] Adsorption

[8] Chelatin agents

[9] Luria bertani Agar

[10] Minimum Inhibitory Concentration

[11] Biomass

[12] Freeze drying apparatus

[13] Atomic absorption spectroscopy

[14] Crosse & Goodmann

[15] Tris-EDTA(TE)

[16] Sodium Dodecyl Sulfate(SDS)

[17] Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide/Sodium Chloride(‍CTAB/NaCl)

[18] Ethidium bromide

[19] Loading buffer

[20] DNA ladder

[21] Gel documentation machine

[22] Nucleotide Sequencing

[23] Bioneer company

[24] Chromas software

[25] One Way ANOVA

[26] Duncan Test

[27] National Center for Biotechnology Information(NCBI)

[28] Phylogenetic Trees

[29] Neighbor joining

[xxx] Maiers

[xxxi] Kumar

[xxxii] Salem

[xxxiii] Saccharomyces cerevisiae

[xxxiv] Fischer

[xxxv] Mane

[xxxvi] Nostoc commune

[xxxvii] Robert

[xxxviii] Gracilaria

[xxxix] Pseudomonas marincola

[xl] Metallidurans

[xli] Bioremediation

[xlii] Thalassospira permensis

[xliii] Bacillus thuringiensis

[xliv] Bacillus licheniformis

[xlv] Activated sludge

[xlvi] Ulothrix zonata

تعداد مشاهده مقاله: 1,462

تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 470