بهینه‌سازی القای جنین‌زایی سوماتیکی در گوجه‌فرنگی (Solanum lycopersicum L.) رقم Money Maker

مقدمه

گوجه فرنگی یکی از مهم ترین گیاهان خانواده‌ی Solanaceae است که در سراسر جهان کشت می‌شود. این گیاه بومی آمریکای جنوبی و مکزیک است و تمام گونه‌های جنس آن، دیپلوئیدهای علفی یک ساله، با 24 کروموزوم (2n=2x=24) هستند (Godishala et al., 2011). در حال حاضرکشت این گیاه در سراسر جهان رایج است و از نظر اقتصادی به یک محصول مهم تبدیل شده است. در سال‌های اخیر، علاقه دانشمندان به گوجه فرنگی به عنوان یک گیاه مدل به طور چشمگیری افزایش یافته است (Salehi et al., 2019). توسعه ابزارهای مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژی گیاهی فرصت‌های بزرگی را برای مهندسی این گیاه فراهم کرده است. پژوهش­های انجام شده بر روی گوجه فرنگی، نمونه‌هایی از کشت بافت موفق و گونه‌های اصلاح ‌شده ژنتیکی را ارائه می‌کند که مقاومت در برابر طیف وسیعی از تنش‌های محیطی همراه با بهبود کیفیت میوه را به همراه داشته است (Gerszberg et al., 2015). جنین‌زایی سوماتیکی (SE) نوعی القای خاصیّت توتی‌پوتنسی در سلول‌های گیاهی است که جنین‌ها از سلول‌های سوماتیکی یا بدنی رشد می‌کنند (Horstman et al., 2017). رشد جنین سوماتیکی مراحل مشابهی با جنین زیگوتی دارد که شامل مراحل کروی، قلبی شکل، اژدری و کوتیلدونی در مورد گونه‌های دو لپه (Winkelmann, 2016) و مراحل کروی، اسکوتلار و کولئوپتیل در مورد گونه‌های تک لپه است (Zhao et al., 2017). گیاهان توسط ‌جنین‌زایی سوماتیکی می توانند ساختارهای دوقطبی را از یک سلول سوماتیک بازسازی کنند. فرایند ‌جنین‌زایی سوماتیکی، مدلی برای باززایی گیاه است، امّا تا به امروز به دلیل سازوکار‌های نامشخصی که در سطح سلولی رخ می‌دهد، اطلاعات دقیقی در مورد آن وجود ندارد (Widmeier et al., 2019). بنابراین استاندارد‌سازی روش باززایی موفق برای انتقال ژن با واسطه Agrobacterium  به جنین‌های سوماتیک در گوجه فرنگی می‌تواند ما را به یک روش انتقال پایدار هدایت کند (Ali et al., 2007). پژوهش‌های مختلف نشان داده اند اولین مرحله‌ی ‌جنین‌زایی سوماتیکی توسط تعدادی از ژن‌های مرتبط با تنش القا می‌شود. تنش اصلی سلول‌ها در هنگام القای ‌جنین‌زایی سوماتیکی، وجود غلظت زیاد اکسین در محیط کشت است (Nic-Can & Loyola-Vargas, 2016). استفاده از اکسین‌ها، متابولیسم درونی را به روش قابل توجهی تغییر می‌دهد. برای مثال، در هویج، استفاده از 2,4-D در محیط کشت سبب ایجاد پاسخ جنینی می شود که با افزایش سطح اسید ایندول-3-استیک (IAA)  درونی همراه است (Abohatem et al., 2017). Raghavan (2005) ارتباط بین مدّت زمان قرار گرفتن در معرض 2,4-D و سرنوشت سلولی را در روش ‌جنین‌زایی سوماتیکی غیر مستقیم مورد بررسی قرار داد. کشت‌های جنین نابالغ تحت تأثیر2,4-D  برای مدّت زمان‌های مختلف قبل از انتقال به محیط عاری از 2,4-D سبب زنجیره ای از تغییرات ریخت شناسی و ژنتیکی در کالوس می شود. قرار گرفتن کوتاه مدت در معرض اکسین، به تشکیل کالوس کمک می‌کند و قرار گرفتن متوسط در معرض اکسین سبب تشکیل جنین سوماتیکی می‌شود. در این جنین‌ها لپه‌ها به برگ­ها تبدیل شده اند و قرار گرفتن طولانی مدّت در معرض اکسین تنها سبب تشکیل جنین سوماتیکی می‌شود. برای مثال، با افزودن غلظت کم 2,4-D، بهره‌وری ‌جنین‌زایی سوماتیکی در خرما به میزان 20 برابر افزایش یافته است (Abohatem et al., 2017). سایر تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی مانند سیتوکنین نیز در رشد گیاهان نقش دارند. سیتوکنین‌ها سبب تشکیل جوانه، تأخیر در پیری برگ‌ها و به همراه با اکسین‌ها سبب تحریک تقسیم سلولی می‌شوند و هر دو تنظیم‌کننده به صورت هم افزا عمل می‌کنند (Singh & Sinha, 2017). از چهار دهه گذشته تا‌کنون، ریزنمونه‌های مختلفی برای ریزازدیادی و یا تراریختی در ارقام مختلف گوجه فرنگی مانند برگ (Behki & Lesley, 1980)، لپه (Costa et al., 2000)، هیپوکوتیل (Park et al., 2003)، مریستم (Mirghis et al., 1995)، گل آذین (Compton et al., 1991)، بساک (Zamir et al., 1980) و سوسپانسیون سلولی (Nover et al., 1982) استفاده شده است. در حال حاضر چندین روش برای القای ‌جنین‌زایی و تولید گیاهچه از ریزنمونه‌های مختلف و غلظت‌های مختلف تنظیم کننده‌های رشد گیاه، گزارش شده است. در این راستا، پیشرفت‌های حاصل از آزمایش می‌تواند استفاده از ‌جنین‌زایی سوماتیکی را برای تکثیر در شرایط آزمایشگاهی واریته‌های متحمّل به تنش و همچنین بهبود ژنتیکی در گوجه‌فرنگی بهبود بخشد. در پژوهش حاضر القای جنین سوماتیکی تحت تیمار‌های هورمونی اکسین و سیتوکینین در گیاه گوجه فرنگی، در شرایط کشت درون شیشه‌ای مورد بررسی شد.

مواد و روش‌ها

انتخاب مواد گیاهی و تهیه ریزنمونه

بذور گیاه گوجه فرنگی رقم Money maker از دانشکده کشاورزی دانشگاه فردوسی مشهد تهیه شد و در تاریکی و در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. بذور به مدت 10 دقیقه با آب جاری شستشو و سپس به مدت یک دقیقه در الکل 70 درصد و به مدّت 15 دقیقه در وایتکس 5/1 درصد همراه با شیک کردن استریل شدند. در نهایت 3 بار با آب مقطر استریل شستشو و به محیط کشت MS بدون هورمون، با شرایط 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و دمای 25 درجه سانتی‌گراد منتقل شدند تا گیاهچه استریل تولید نمایند.

القای ‌جنین‌زایی سوماتیکی

بعد از جوانه زنی بذور، از گیاهچه‌های 14 روزه گوجه فرنگی برای تهیه ریزنمونه برای القای جنین سوماتیکی استفاده شد. از سه نوع ریزنمونه برگ‌های لپه‌ای، محور زیر لپه و ریشه استفاده شد. برگ‌های لپه‌ای به قطعات 1- 5/0 سانتی‌متر، محور زیر لپه به قطعات 7-4 میلی‌متر و ریشه با قطعات 1- 5/0 سانتی‌متر برش داده شد. تولید جنین سوماتیکی در دو مرحله شامل القای جنین رویشی و بلوغ آن انجام شد. ترکیب محیط کشت از جمله مهمترین عوامل مؤثر دیگر بر ‌جنین‌زایی سوماتیکی است. لازم بـه توضیح است در این آزمایش از محیط‌های کشت پایه و ترکیبات هورمونی پیشنهاد شده توسط پژوهشگران مربوطـه جهـت جنین‌زایی رویشی گوجه فرنگی استفاده شد (Mashayekhi, 2007؛ Majd et al., 2011؛ Wajeeha et al., 2019). ریزنمونه‌های برش داده شده در سه نوع محیط کشت MS (Murashige & Skoog, 1962)، B5 (Gamborg B5, 1986) و MS+ Vitamin B5 (MB) با ترکیب‌های هورمونی 2,4-D (2 میلی‌گرم در لیتر)+ BA (5/1 میلی‌گرم در لیتر)، 2,4-D (8 میلی‌گرم در لیتر)+ BA (6 میلی‌گرم در لیتر) و IAA (2 میلی‌گرم در لیتر)+ BA (5 میلی‌گرم در لیتر)، 30 گرم در لیتر ساکارز و 8 گرم در لیتر آگار، با دمای 25 درجه سانتی گراد به مدت 2 هفته تاریکی و یک هفته روشنایی، انتقال داده شدند. برای بلوغ جنین سوماتیکی، بعد از گذشت 3 هفته، ریز نمونه‌ها به محیط کشت‌های MS، B5 و MB بدون هورمون به مدّت یک هفته، منتقل شدند. در ادامه جنین‌های سوماتیکی تولید شده، جهت رشد و جوانه زنی به محیط کشت MS₂/¹ منتقل شدند.

پژوهش­های ریخت شناسی

جهت آنالیز‌های ریخت شناسی توده کالوس‌های جنینی، تصاویر میکروسکوپی از مراحل القاء و نموّ جنین تهیه شد. ابتدا بافت‌های کالوس حاوی جنین‌های سوماتیکی در مراحل مختلف با استوکارمن یک درصد بر روی اسلاید شیشه‌ای رنگ‌آمیزی شدند (Varis et al., 2018). در این مرحله عکس نمونه­ها توسط میکروسکوپ نوری و بزرگ‌نمایی 400X  انجام شد. به علّت اینکه در بافت‌های جنینی، تقسیمات سریع سلولی اتفاق می افتد، رنگ‌پذیری بالایی دارند و از این محلول برای بررسی بافت‌های جنینی استفاده می شود. روش کار به این صورت بود که برش‌های بسیار نازک از کالوس‌های جنینی تهیه و سپس با محلول استوکارمن رنگ‌آمیزی شد. بعد از گذشت حدود 3 دقیقه، شستشو داده شدند و با میکروسکوپ مشاهده شدند. همچنین تصویربرداری از جنین‌های سوماتیکی با بینوکولار انجام شد. ثبت و اندازه‌گیری صفاتی مانند درصد

کالوس­دهی ( )، درصد جنین­زایی ( )

و شمارش تعداد جنین در هر ریزنمونه (در روز‌های مختلف پس از کشت، تعداد جنین‌های کروی، قلبی، اژدری و لپه‌ای هر ریزنمونه)، در پایان آزمایش انجام شد. آزمایش در سه تکرار و تجزیه آماری داده‌ها با نرم افزار JMP و مقایسه میانگین‌ها با آزمون LSD در سطح احتمال 5% انجام شد. همچنین رسم نمودار‌ها‌ با نرم افزار Excel انجام شد.

نتایج و بحث

تولید کالوس در ریزنمونه‌ها از هفته دوم بعد از کشت شروع و تشکیل جنین‌ها بر روی ریزنمونه‌ها اغلب از روز 14ام بعد از کشت مشاهده شد. نتایج تجزیه واریانس داده‌ها نشان داد اثرات اصلی و متقابل نوع محیط کشت و نوع ریزنمونه استفاده شده و نیز ترکیب‌های هورمونی بر فاکتور‌های درصد کالوس‌زایی، درصد ‌جنین‌زایی و تعداد جنین تولید شده در هر ریزنمونه در سطح 5 درصد معنی‌دار بود (جدول1).

جدول 1. نتایج تجزیه واریانس اثرات ساده و متقابل نوع محیط کشت، نوع ریزنمونه و ترکیب‌های هورمونی متفاوت بر فاکتور‌های مورد ارزیابی

Table 1. Results of analysis of variance of simple and reciprocal effects of culture medium type, explant type and different hormone combinations on the evaluated factors

* معنی‌داری در سطح 5 درصد است.

* Significance is at the 5% level

درصد کالوس‌زایی

نتایج (جدول 2) نشان داد بیشترین درصد کالوس‌زایی ریزنمونه کوتیلدون به ترتیب در محیط کشت های MS و MB و B5 مشاهده شد. همچنین درصد کالوس‌زایی این ریزنمونه در ترکیبات هورمونی 2,4-D (2 میلی‌گرم در لیتر)+ BA (5/1 میلی‌گرم در لیتر) و 2,4-D (8 میلی‌گرم در لیتر)+ BA (6 میلی‌گرم در لیتر) (100 درصد) بیشتر از درصد کالوس‌زایی این ریزنمونه در ترکیب هورمونی IAA (2 میلی‌گرم در لیتر) + BA (5 میلی‌گرم در لیتر) در هر سه محیط کشت بود که تفاوت معنی‌داری را نشان داد. از طرفی درصد کالوس‌زایی ریزنمونه هیپوکوتیل در ترکیب هورمونی 2,4-D (2 میلی‌گرم در لیتر)+ BA (5/1 میلی‌گرم در لیتر) در هر سه نوع محیط کشت مورد آزمایش 100 درصد و کمترین درصد کالوس‌زایی این ریزنمونه در محیط کشت B5 با ترکیب هورمونی 2,4-D (8 میلی‌گرم در لیتر)+ BA (6 میلی‌گرم در لیتر) (50 درصد) بود. بیشترین درصد کالوس‌زایی ریزنمونه هیپوکوتیل به ترتیب در محیط کشت های MS، MB وB5  مشاهده شد. بیشترین درصد کالوس‌زایی در ریزنمونه ریشه به ترتیب در محیط کشت های MB، MS وB5  بود. همچنین درصد کالوس‌زایی ریزنمونه ریشه در هر سه نوع محیط کشت در ترکیبات هورمونی 2,4-D (2 میلی‌گرم در لیتر)+ BA (5/1 میلی‌گرم در لیتر) و IAA (2 میلی‌گرم در لیتر) + BA (5 میلی‌گرم در لیتر) (100 درصد) زیادتر از ترکیب هورمونی 2,4-D (8 میلی‌گرم در لیتر)+ BA (6 میلی‌گرم در لیتر) بود که تفاوت معنی داری را نشان داد (جدول 2). به طور کلی اثرات متقابل سه گانه نوع ریزنمونه، نوع ترکیب هورمونی و محیط کشت نشان داد بیشترین درصد کالوس‌زایی در هر سه نوع محیط کشت، در ریزنمونه کوتیلدون و در ترکیب‌های هورمونی 2,4-D (2 میلی‌گرم در لیتر)+ BA (5/1 میلی‌گرم در لیتر) و 2,4-D (8 میلی‌گرم در لیتر)+ BA (6 میلی‌گرم در لیتر) (100 درصد) است و کمترین آن در هر سه نوع محیط کشت، در ریزنمونه ریشه و در ترکیب‌ هورمونی 2,4-D (8 میلی‌گرم در لیتر)+ BA (6 میلی‌گرم در لیتر) است که تفاوت معنی‌داری را نشان داد )جدول 2). (2013) Yousry ‌جنین‌زایی سوماتیکی گونه‌ای از گوجه (Physalis pubescens L.)، را تحت تأثیر هورمون‌های BAP و 2,4-D بر روی ریز نمونه برگ مورد آزمایش کردند. نتایج به دست آمده، رابطه مستقیمی بین سطح BAP و شاخص اندازه کالوس نشان داد. اثر متقابل 2,4-D و BAP در غلظت 25/0 میلی‌گرم در لیتر بیشترین میانگین شاخص اندازه کالوس را به وجود آورد. نتایج آنها نشان داد یک تا دو هفته پس از کشت، ریزنمونه‌های برگ شروع به تشکیل کالوس زرد رنگ کردند. کالوس فشرده از سلول‌های هم اندازه ‌حاوی تعداد زیادی دانه نشاسته و جنین‌زا بود و به جنین‌های کروی تبدیل شد که بیشتر آنها به جنین‌های قلبی شکل تبدیل شدند. به نظر می‌رسد حضور اکسین، سبب یکسری تغییرات بیوشـیمیایی درون سـلولی می‌شود. تغییر در بیان ژن‌هایی که در توده‌های سلولی پـیش جنینـی قـرار دارنـد ( بـه واسـطه افزایش احتمالی متیلاسیونDNA ) و نیز برای تولید جنین کروی لازم هستند، از جمله این موارد به شمار مـی‌رود. امّا نکتـه مهـّم این است که حضور مداوم برخی از ژن‌های موجود در توده‌های جنینی سبب می‌شوند از ظهور و تکوین جنین‌های رویشی ممانعت نموده و در نتیجه با حذف اکسین از محیط کشت مـی‌تـوان سـبب غیرفعال شدن این ژن‌های بازدارنده شده و برنامه جنـین‌زایـی را تـداوم بخـشد (Zimmerman, 1993). تفاوت در کالوس‌زایی و ایجاد بافت‌های جنینی ریزنمونه‌های مختلف، به تفاوت در فعالیت‌های متابولیک و مقدار هورمون‌های درونی مربوط می‌باشد. تیمار با اکسین بیرونی به عنوان شرایط تنش در بافت تلقّی می‌شود و منجر به‌ جنین‌زایی سوماتیکی در تقسیمات سلولی می­شود، همچنین ترکیب اکسین با هورمون بنزیل آمینوپورین اثر القایی مثبتی در تشکیل کالوس جنین‌زا در گیاه گوجه فرنگی داشته است (Majd et al., 2011).

درصد جنین‌زایی

نتایج نشان داد بیشترین درصد جنین‌زایی در ریزنمونه‌های کوتیلدون و هیپوکوتیل در محیط­های کشت MS، MB و کمترین درصد جنین‌زایی در ریزنمونه‌های ریشه و کوتیلدون در محیط کشت B5 بود که تفاوت معنی‌داری را نشان داد. همچنین بیشترین درصد جنین زایی در ریزنمونه کوتیلدون در ترکیبات هورمونی 2,4-D (2 میلی‌گرم در لیتر)+ BA (5/1 میلی‌گرم در لیتر) و 2,4-D (8 میلی‌گرم در لیتر)+ BA (6 میلی‌گرم در لیتر) (90 درصد) و کمترین آن در محیط کشتB5  بود که در هر سه نوع ترکیب هورمونی، جنینی تولید نشد. بیشترین درصد جنین‌زایی ریزنمونه هیپوکوتیل در ترکیب هورمونی IAA (2 میلی‌گرم در لیتر) + BA (5 میلی‌گرم در لیتر) (33/90 درصد) در محیط کشت MS مشاهده شد که تفاوت معنی‌داری را با دو ترکیب هورمونی دیگر مورد آزمایش نشان داد. درصد جنین زایی در ریزنمونه ریشه نسبت به سایر ریزنمونه ها کمتر بود. به طوری که بیشترین درصد جنین‌زایی در ریزنمونه ریشه در ترکیب هورمونی 2,4-D (2 میلی‌گرم در لیتر)+ BA (5/1 میلی‌گرم در لیتر) (66/41 درصد) در محیط کشت MS و کمترین آن در ترکیب هورمونی IAA (2 میلی‌گرم در لیتر) + BA (5 میلی‌گرم در لیتر) (0 درصد) بود که هیچ جنینی مشاهده نشد. در مجموع اثرات سه گانه نوع ریزنمونه، نوع ترکیب هورمونی و محیط کشت نشان دادند بیشترین درصد ‌جنین‌زایی در ریزنمونه هیپوکوتیل در ترکیب هورمونی IAA (2 میلی‌گرم در لیتر) + BA (5 میلی‌گرم در لیتر) در محیط کشت MS (33/90%) و کمترین آن در محیط کشت B5 بود که در این محیط کشت در هیچ یک از ریزنمونه‌های مورد آزمایش در تیمار‌های هورمونی تولید جنین سوماتیکی مشاهده نشد و فقط ریزنمونه هیپوکوتیل در ترکیب هورمونی IAA (2 میلی‌گرم در لیتر) + BA (5 میلی‌گرم در لیتر) تولید جنین سوماتیکی داشت (جدول 2). سـطوح بـالای هورمـون درون‌زا نقش مهمّی در جنین‌زایی سوماتیکی دارند زیرا آنها فرآیندهای تمایزیابی ریزنمونه‌ها در محیط‌های کشت را تنظیم می‌کنند. به این علّت تصور می‌شود تفاوت اصلی بین ژنوتیپ‌ها از نظـر جنین‌زایی، مربوط به سـطوح متفاوت هورمـون‌های درون‌زای آنها است. پژوهشگران گزارش کردند رابطه مثبتی بـین توانـایی پاسخ به تیمار القای توفوردی و سطوح IAA درون‌زا وجود دارد (Arnholdt-Schmitt, 1995). (2011) Majd القای ‌جنین‌زایی سوماتیکی در گیاه گوجه فرنگی را در محیط کشت MS مورد بررسی قرار دادند. آنها گزارش کردند بیشترین درصد کالوس‌زایی و درصد تشکیل جنین‌های سوماتیکی کروی از ریزنمونه ساقه با ترکیب هورمونی 5 میلی‌گرم در لیتر IAA و 2 میلی‌گرم در لیتر BA مشاهده شد که با نتایج این پژوهش مطابقت دارد. گزارش شده است که اکسین‌ها به تنهایی کالوس‌های جنینی بدون مرکز مریستمی را تولید می‌کنند، امّا در ترکیب با سیتوکینین سبب ایجاد بافت کالوس جنینی می شود (Swamy et al., 2005). (2007)  et al, Rzepka-Plevnesطی آزمایشی، جنین‌زایی توسط دو اکسین IAA  و2,4-D ، را در ترکیب با BAP در گیاه L. peruvianum  القا کردند. BAP به عنوان یک هورمون مهّم رشد و لازم در شکل‌گیری جنین‌های سوماتیکی اثبات شده است. نتایج آنها نشان دادند بیشترین تعداد جنین سوماتیکی (9/8 عدد جنین در هر یک گرم کالوس) در محیط کشت حاوی 5 میلی‌گرم بر لیتر از BAP و 4 میلی‌گرم بر لیتر  2,4-D مشاهده شد. Philip et al, (1996) ریزنمونه هیپوکوتیل چهار رقم متفاوت گوجه فرنگی را در محیط کشت MS حاوی 6 میلی‌گرم در لیتر BA، مورد آزمایش قرار دادند و توانستند جنین‌هایی سوماتیک تولید کنند. آنها گزارش کردند هورمون BA در گیاه گوجه فرنگی یک تنظیم‌کننده رشد ضروری و مهّم برای القای جنین‌های سوماتیک است که نتایج این پژوهش نیز بیان‌کننده نقش مثبت هومون BA در القاء و تشکیل کالوس‌های جنین‌زا است.

تعداد جنین سوماتیکی

نتایج این آزمایش نشان داد تعداد جنین‌های تولید شده در ریزنمونه کوتیلدون بالاتر از سایر ریزنمونه‌ها بود. بیشترین تعداد جنین نابالغ تولید شده در ریزنمونه کوتیلدون، در محیط کشت MS با ترکیب هورمونی 2,4-D (2 میلی‌گرم در لیتر)+ BA (5/1 میلی‌گرم در لیتر) و محیط کشت MB با ترکیب هورمونی 2,4-D (6 میلی‌گرم در لیتر)+ BA (8 میلی‌گرم در لیتر) (33/20 عدد) بود و کمترین آن در محیط کشت B5 بود که در هر سه نوع ترکیب هورمونی هیچ جنینی تولید نشد و تفاوت معنی‌داری را نشان می‌دهد. همچنین بیشترین تعداد جنین تولید شده در ریزنمونه هیپوکوتیل، به ترتیب در محیط کشت‌ MS با ترکیبات هورمونی 2,4-D (2 میلی‌گرم در لیتر)+ BA (5/1 میلی‌گرم در لیتر) (33/12 عدد)، محیط کشت MB با ترکیب هورمونی 2,4-D (6 میلی‌گرم در لیتر)+ BA (8 میلی‌گرم در لیتر) (67/11 عدد) و محیط کشت B5  با ترکیب هورمونی IAA (2 میلی‌گرم در لیتر) + BA (5 میلی‌گرم در لیتر) (02/6 عدد) مشاهده شد. تعداد جنین تولید شده در ریزنمونه ریشه نسبت به سایر ریزنمونه‌ها کمتر بود به طوری که بیشترین جنین تولید شده در محیط کشت MS با ترکیب هورمونی 2,4-D (2 میلی‌گرم در لیتر)+ BA (5/1 میلی‌گرم در لیتر) (33/12عدد) و کمترین آن در محیط کشت B5 مشاهده شد و هیچ جنین سوماتیکی تولید نشد (جدول 2). در تیمار‌‌های هورمونی 2,4-D (2 میلی‌گرم در لیتر)+ BA (5/1 میلی‌گرم در لیتر) و 2,4-D (8 میلی‌گرم در لیتر)+ BA (6 میلی‌گرم در لیتر) اگرچه در ابتدا تعداد جنین‌های بیشتری در مقایسه با تیمار هورمونی IAA (2 میلی‌گرم در لیتر) + BA (5 میلی‌گرم در لیتر) تولید شدند، امّا بعد از گذشت 3 هفته، رشد جنین‌ها در مرحله کروی و قلبی شکل متوقف شد، تا این مرحله کالوس‌ها سبز روشن بودند و با گذشت زمان کالوس‌های جنینی قهوه‌ای رنگ شده و بافت جنینی خود را از دست دادند (شکل1).

شکل1- ‌جنین‌زایی در ریزنمونه کوتیلدون در ترکیب هورمونی 2,4-D (2 میلی‌گرم در لیتر)+ BA (5/1 میلی‌گرم در لیتر). a: کالوس سبز روشن دارای بافت جنینی- b-c: جنین در مرحله کروی- d: جنین در مرحله قلبی شکل- e: بافت کالوس بدون جنین – f: کالوس تیره شده بعد از گذشت 3 هفته از کشت در رنگ آمیزی با استوکارمن

Figure 1- Embryogenesis in cotyledon explants of 2,4-D (1 mg/L) + BA (1.5 mg/L) hormonal compounds. a: Light green callus with embryonic tissue-b-c: Embryo in spherical stage-d: Embryo in heart-shaped stage-e: Callus tissue without embryo-f: Darkened callus after 3 weeks of culture- Staining with acetocarmine

ترکیب هورمونی محیط کشت از جمله مهمترین عوامل مؤثر در القای جنین‌زایی سوماتیکی است. در تیمار هورمونی IAA (2 میلی‌گرم در لیتر) + BA (5 میلی‌گرم در لیتر) بعد از گذشت دو هفته از کشت، جنین‌های کروی در سطح ریزنمونه با بینوکولار قابل مشاهده بودند و با انتقال ریزنمونه به روشنایی و سپس محیط کشت بدون هورمون، جنین‌ها مراحل تکاملی را طی کرده و به بلوغ رسیدند. همچنین جهت ریشه‌زایی، جنین‌ها به محیط کشت MS ₂/¹ منتقل شدند. در این تیمار، بیشترین تعداد جنین سوماتیکی تولید شده در ریزنمونه هیپوکوتیل مشاهده شد (شکل2 مراحل تکامل جنین سوماتیکی).

شکل2- مراحل تکامل جنین سوماتیکی در ریزنمونه هیپوکوتیل در تیمار هورمونی IAA (2 میلی‎گرم در لیتر) + BA (5 میلی‌گرم در لیتر). a جنین در مرحله کروی- b مرحله قلب شکل- c مرحله لپه ای- d مرحله گیاهچه- e گیاهچه ریشه دار؛ تصویر برداری با بینوکولار

Figure 2- Stages of somatic embryo development in cotyledon explant under hormonal treatment of IAA (2 mg/L) + BA (5 mg/L). a Embryo in spherical stage- b heart-shaped stage- c cotyledon stage- d seedling stage- e Rooted seedling- Binocular imaging

در پژوهش حاضر، شمارش تعداد جنین‌های سوماتیکی تولید شده در مراحل مختلف رشدی (کروی، قلبی، اژدری و لپه ای) در ریزنمونه هیپوکوتیل و کوتیلدون در تیمار هورمونی IAA (2 میلی‌گرم در لیتر) + BA ( 5 میلی‌گرم در لیتر) انجام شد. تقریباً از روز 14 ام، جنین‌های کروی در سطح ریزنمونه با بینوکولار قابل مشاهده بودند. نتایج نشان دادند در ریزنمونه هیپوکوتیل بیشترین جنین کروی تشکیل شده در روز 17‌ام از شروع اعمال تیمار بوده است (24/7 عدد) و با گذشت زمان، جنین‌های کروی مراحل رشد و بلوغ خود را طی کردند، به طوری که پیک تولید جنین‌های قلبی روز 19‌ام از کشت بود (56/4 عدد). همچنین در روز 21‌ام، جنین‌های لپه‌ای قابل مشاهده بودند (شکل a3). همچنین مراحل رشد جنین‌ها در ریزنمونه کوتیلدون مشابه با ریزنمونه هیپوکوتیل بود، امّا در ریزنمونه کوتیلدون تعداد جنین‌ها کمتر از ریزنمونه هیپوکوتیل بود. به طوری که بیشترین جنین کروی تولید شده در روز 17‌ام برابر با 6/2 عدد بود و در روز‌های بعد جنین‌های کروی تبدیل به قلبی و اژدری شکل شدند که بیشترین جنین‌های قلبی و اژدری شکل به ترتیب در روز‌های 19 و 21‌ام (16/2 و 25/4 عدد) از اعمال تیمار مشاهده شد. در روز 21‌ام از اعمال تیمار نیز جنین‌های لپه‌ای قابل مشاهده بودند (شکل b3).

شکل 3 - روند افزایش تولید جنین سوماتیکی در تیمار هورمونی IAA (2 میلی‌گرم در لیتر) + BA (5 میلی‌گرم در لیتر) در مراحل مختلف پس از کشت.a : در ریزنمونه هیپوکوتیل. b: در ریزنمونه کوتیلدون

Figure 3- The process of increasing somatic embryo production under the hormonal treatment of IAA (2 mg/L) + BA (5 mg/L) at different stages after cultivation. a: in hypocotyl explant. b: in cotyledon explant

جدول 2. اثرات متقابل نوع محیط کشت، ترکیب هورمونی و نوع ریزنمونه بر فاکتور‌های مورد ارزیابی

Table 2. The interaction effect of the type of culture medium, hormonal composition and the type of explant on the evaluated factors

حروف یکسان بیان کننده عدم اختلاف معنی‌دار در سطح  P < 0.05با آزمون LSD هستند.

The same letters indicate no significant difference at the P<0.05 level using the LSD test.

 (2019), Wajeeha et alگزارش کردند ظرفیت باززایی ریزنمونه‌های جوان بهتر از ریزنمونه‌های بالغ است. نتایج آنها نشان دادند کالوس‌های جنین‌زای مشتق‌شده از ریزنمونه‌های کوتیلدون، پتانسیل باززایی بالاتری نسبت به ریزنمونه هیپوکوتیل دارند. پژوهش­های زیادی با هدف بررسی ریخت شناسی ‌جنین‌زایی سوماتیکی انجام شده است که نشان می‌دهد اکسین‌ها در تشکیل سلول‌های اولیه جنینی، نقش اساسی داشته، امّا تداوم حضور آنها مانع از تمایز سلول‌های مریستمی اندام هوایی شده و جنین‌های غیر طبیعی با قدرت جوانه زنی پائین تولید می‌کنند (Horstman et al., 2017). هورمون‌های ایندول استیک اسید و بنزیل آمینو پورین، در غلظت‌های متفاوت برای تمامی ریزنمونه‌ها، بر کالوس‌های جنین‌زا در گیاه گوجه فرنگی اثر مثبتی دارند (Chaudhry et al., 2010). (2019) ,Wajeeha et al غلظت‌های مختلف تنظیم‌کننده‌های رشد را در گیاه گوجه فرنگی برای ارزیابی القای جنین سوماتیکی در شرایط آزمایشگاهی آزمایش کردند. نتایج آنها نشان دادند غلظت بالاتر سیتوکینین‌ به همراه غلظت کم اکسین سبب ایجاد تمایل به سمت تولید کالوس جنین‌زا می‌شود. بیشترین القای کالوس از محیط کشت پایه MS حاوی 2 میلی‌گرم در لیتر  IAA، 2 میلی‌گرم در لیتر NAA، 2 میلی‌گرم در لیتر BA و 4 میلی‌گرم در لیتر Kin در ریزنمونه هیپوکوتیل و کوتیلدون مشاهده شد. Philip et al, (1996) گزارش کردند هورمون BA در گیاه گوجه فرنگی یک تنظیم‌کننده رشد ضروری و مهّم برای القای جنین‌های سوماتیکی است که نتایج این پژوهش نیز بیان کننده نقش مثبت هورمون BA در القا و تشکیل کالوس‌های جنین‌زا است. (2011) Godishala et al, در آزمایشی گزارش کردند ریزنمونه‌های کوتیلدون گیاه گوجه فرنگی، کالوس‌های جنینی را بر روی محیط کشت MS با ترکیب IAA و BAP تولید می‌کنند. تیمار با 5/0 میلی‌گرم در لیتر IAA+ 5/3 میلی‌گرم در لیتر BAP منجر به القای بیشترین فراوانی ‌جنین‌زایی سوماتیکی با بالاترین تعداد جنین سوماتیکی مستقیم از ریزنمونه شد که با نتایج این پژوهش مطابقت داد (Swamy et al., 2005).

نتیجه‌گیری

در پژوهش حاضر، فقط جنین‌های تولید شده در تیمار هورمونی IAA (2 میلی‌گرم در لیتر) + BA (5 میلی‌گرم در لیتر) مراحل تکاملی را طی و منجر به تولید گیاهچه کامل شدند. در این تیمار، بیشترین تعداد جنین سوماتیکی تولید شده در ریزنمونه هیپوکوتیل مشاهده شد. امّا در تیمار‌های هورمونی 2,4-D (2 میلی‌گرم در لیتر)+ BA (5/1 میلی‌گرم در لیتر) و 2,4-D (8 میلی‌گرم در لیتر)+ BA (6 میلی‌گرم در لیتر) در ابتدا تعداد جنین‌های کروی و قلبی شکل بیشتری تولید شد که با گذشت زمان رشد جنین‌ها متوقف شد و رنگ کالوس‌های جنینی به قهوه‌ای تغییر کردند و در نهایت بافت جنینی خود را از دست دادند. نتایج این پژوهش نقش مثبت هورمون BA و IAA در تشکیل کالوس‌های جنین‌زا و ‌جنین‌زایی سوماتیکی را نشان داد که با یافته­های پژوهشگران مذکور مطابقت دارد. با توجه به نتایج موفقیت‌آمیز تولید جنین‌های سوماتیکی در این پژوهش، تولید بذر مصنوعی در گیاه گوجه فرنگی می‌تواند بررسی شود.