افزایش تولید آلکالوئیدها و ترکیبات فلاونوئیدی کالوس نرگس شهلا (.Narcissus tazetta L) تحت تیمار نانوذرات اکسید آهن (-NPs Fe3O4) و پیش‌ماده‌های ترانس سینامیک‌اسید و L- فنیل آلانین

مقدمه

نرگس متعلق به خانواده‌ی تک‌لپه‌ای آماریلیداسه (Amaryllidaceae)، دارای حداقل 85 جنس است و 1600 گونه‌ی آن به‌طور طبیعی در مناطق استوایی و نیمه‌استوایی سراسر جهان شامل آفریقای جنوبی، مناطق معتدل آسیا و مدیترانه پراکنده شده‌اند (Christenhusz & Byng, 2016). یکی از گونه­های معروف آن گونه‌ی Narcissus tazetta در اسپانیا، شمال آفریقا و در مناطق معتدل آسیا یافت می‌شود (Hanks, 2002). ویژگی منحصر به فرد گیاه نرگس به ویژه در اندام پیاز، تولید آلکالوئیدهای آماریلیداسه (Amaryllidacea Alkaloids, AA) با خواص دارویی بسیار ارزشمند است (Desgagné-Penix, 2020). این آلکالوئیدها دارای طیف گسترده‌ای از فعالیت‌های زیستی مانند خواص ضد آلزایمری گالانتامین (Hotchandani et al., 2019)، فعالیت‌های ضد ویروسی و ضد توموری لیکورین (Bastida et al., 2011) و خواص پاداکسایشی و ضد سرطانی همانتامین (Bastida et al., 2011; Van Goietsenoven et al., 2010) هستند. محتوای این آلکالوئیدها در گونه­های مختلف نرگس بسیار کم است، همچنین سنتز شیمیایی این ترکیبات به علّت ساختار پیچیده‌ی آن‌ها دشوار است. بنابراین استخراج و تولید صنعتی این آلکالوئیدها در مقیاس بزرگ مقرون به صرفه نیست (Hotchandani et al., 2019). در این میان استفاده از روش‌های جایگزین و کم هزینه برای افزایش این ترکیبات دارویی ارزشمند همواره مورد توجه بوده است. از جمله این روش‌ها می‌توان به استفاده از روش‌هایی مانند کشت بافت و همچنین استفاده از محرک‌ها (elicitors) اشاره نمود. یکی از روش‌های کشت بافت جهت افزایش تولید متابولیت‌های ثانوی القاء کالوس و انتخاب نژادهای سلولی با قابلیت تولید بالا است. القاء کالوس یک مرحله اساسی برای ریز ازدیادی است و با توجه به ساختار ساده‌ی کالوس‌ها می­توان از آن‌ها به عنوان یک بافت آزمایشی مناسب جهت مطالعه بهبود تولید آلکالوئیدها در گیاه استفاده کرد (Ramachandra & Ravishankar, 2002). مولکول‌هایی که یکی از ابعاد آن‌ها بین 100-1 نانومتر ‌باشد به عنوان نانوذرات نامیده می‌شوند. بیشتر از یک دهه است که فناوری‌های نانو به لطف ویژگی­های قابل توجهی که دارند توسط صنایع و محققان به صورت جهانی مورد استفاده قرار گرفته است (Vance et al., 2015). نانوذرات به دلیل نسبت سطح به حجم بالا به راحتی جذب گیاهان می‌شوند (Elemike et al., 2019; Kumari et al., 2023). جذب نانوذرات توسط گیاهان از راه‌های مختلفی از جمله از طریق کوتیکول برگ، روزنه‌های برگی و ریشه انجام می‌شود (Wang et al., 2023). در سطح لایه کوتیکول دو نوع کانال مختلف شامل کانال‌های آب‌دوست و کانال­های چربی‌دوست وجود دارد (Avellan et al., 2019). قطر این کانال‌ها از 6/0 تا 8/4 نانومتر متغیر است. کانال‌های آب‌دوست به نانوذرات آب‌دوست با قطر کمتر از 8/4 نانومتر اجازه انتشار می‌دهند.کانال‌های چربی دوست در سطح کوتیکول به نانوذرات چربی‌دوست اجازه عبور می‌دهند تا از طریق انتشار و نفوذ در برگ‌ها جذب شوند (Wang et al., 2023). تماس بین نانوذرات و ریشه گیاه با جذب سطحی ریشه صورت می‌گیرد. از آنجایی که تارهای کشنده می‌توانند مواد شیمیایی مانند موکوس یا اسیدهای آلی را آزاد کنند، سطح ریشه دارای بارهای منفی است، بنابراین نانوذرات با بار مثبت بیشتر در ریشه تجمع می‌یابند و به راحتی در سطح ریشه جذب می‌شوند (Lv et al., 2019). تشکیل ریشه‌های جانبی می‌تواند یک رابط جذب جدید برای نانوذرات ایجاد و امکان ورود آن‌ها را به ریشه اصلی فراهم ‌کنند (Wang et al., 2023). هنگامی که نانوذرات وارد بافت گیاهی می‌شوند، می‌توانند از طریق مسیرهای متعددی مانند کانال­های یونی، اندوسیتوز، اتصال به پروتئین‌های غشای سلولی یا از طریق آسیب فیزیکی وارد سلول‌ها شوند (Lv et al., 2019). از آنجایی که مواد مغذی در مقیاس نانو هستند، غنی‌سازی محیط کشت گیاه با چنین موادی گزینه جالبی به نظر می‌رسد. گیاهان در این محیط­ها نه تنها رشد می‌کنند، بلکه با انباشتگی نانومغذی کمبود مواد غذایی را نیز جبران می­کنند (Elemike et al., 2019). در کشت بافت گیاهی برای افزایش میزان جوانه‌زنی و رشد گیاه و بهبود تولید متابولیت‌های فعال از نانوذرات استفاده می‌شود (Wang et al., 2016). نتایج پژوهش Feng و همکاران (2022) نشان داد غلظت‌های بالای نانوذرات اکسید آهن (200 و 500 میلی‌گرم در لیتر) سبب افزایش رشد گیاهان گندم شد. نانوذرات نقره، جوانه‌زنی گیاهان عدس قرارگرفته تحت تنش خشکی را افزایش دادند. نتایج پژوهش دیگری نشان داد غلظت 10 میکروگرم در میلی‌لیتر نانوذرات نقره بیشترین تأثیر را بر جوانه‌زنی داشتند (Hojjat, 2016). دانه‌های گندم و جو تیمار شده با نانوذرات اکسید آهن (Fe₃O₄) نرخ جوانه‌زنی بالاتری را نسبت به دانه‌های تیمار نشده (شاهد) نشان دادند (Serpoush et al., 2022). همچنین در زیست­فناوری گیاهی استفاده از نانوذرات به‌عنوان محرک‌های غیر زیستی، پتانسیل زیادی برای القای بیوسنتز متابولیت‌های ثانوی از جمله آلکالوئیدها دارد (Rivero-Montejo et al., 2021). بنابراین در این پژوهش از نانوذرات اکسید آهن استفاده شد. نانوذرات Fe₃O₄ یا مگنتیت در حال حاضر یکی از اشکال مهم و قابل قبول اکسید آهن است که یک اکسید آهن سخت، سیاه، فری‌مغناطیس و براق می‌باشد (DeArmitt, 2017) و بیشترین کاربرد را در زیست‌پزشکی در میان سایر اشکال اکسیدهای آهن دارد (Hein et al., 2013). برهمکنش نانوذرات با گیاهان به برخی از ویژگی­های آن‌ها مانند غلظت، اندازه، خواص فیزیکی و نوع گونه‌ی گیاهی بستگی دارد. این نانوذرات سبب تغییرات بیوشیمیایی، فیزیولوژیکی و ریخت شناسی مختلفی در گیاهان می‌شوند (Alkhatib et al., 2019). در پژوهش­های Moharrami و همکاران (2017) غلظت‌های مختلف نانواکسید آهن (0 تا 3600 میلی‌گرم در لیتر) در دوره‌های زمانی 24، 48 و 72 ساعت بر گیاه بذرالبنج تأثیر داده شد. بیشترین مقدار تولید آلکالوئیدهای هیوسیامین و اسکوپولامین تحت تیمار غلظت‌های 900 و 450 میلی‌گرم در لیتر نانوذرات آهن پس از 24 و 48 ساعت (حدود پنج برابر گیاه شاهد) بدست آمد.

یکی دیگر از راه‌های افزایش متابولیت‌های ثانوی در گیاهان، افزودن پیش‌ماده‌های خاص مسیر بیوسنتزی این ترکیبات است (Hussain et al., 2012). اگر افزودن مواد مغذی و هورمون‌ها در محیط کشت سبب افزایش تولید متابولیت‌های ثانوی شود، افزودن پیش‌ماده‌ها نیز مسیرهای بیوسنتزی را فعال می‌کند. از جمله این پیش‌ماده‌های مهم می‌توان به اسیدهای آمینه مانند فنیل‌آلانین و تیروزین اشاره کرد. پژوهش­های  Karyagina و همکاران (2007) روی بیوسنتز آلکالوئیدهای پروتوبربرین در کشت سلول گیاه برگ سدابی (Thalictrum minus L.) نشان داد افزودن فنیل‌آلانین 7 میلی‌مولار به محیط کشت سلول طی 7 یا 8 روز منجر به دو برابر شدن ترشح بربرین شد. همچنین محتوای ترکیبات فنولی در سلول‌ها و محیط کشت افزایش پیدا کرد. کاربرد فنیل‌آلانین خارجی فعالیت فنیل‌آلانین‌آمونیا‌لیاز (PAL) و تیروزین‌آمونیا‌لیاز (TAL) را به ترتیب 35 و 20 درصد افزایش داد. در بررسی Feduraev و همکاران (2020)، اثر کاربرد خارجی فنیل‌آلانین و تیروزین بر متابولیسم ثانویه گندم (Triticum aestivum L.) بررسی شد. نتایج نشان داد همزمان با افزایش غلظت فنیل‌آلانین و تیروزین، محتوای ترکیبات فنولی و فعالیت آنزیم‌های PAL، TAL و پراکسیداز (POD) افزایش معنی‌داری را نسبت به شاهد نشان دادند. پژوهش Teixeira و همکاران (2017) روی تغییر فعالیت آنزیم‌های پاداکسایشی پس از اسپری محلول فنیل‌آلانین روی برگ‌ها و دانه‌های سویا متمرکز شده است. نتایج آن‌ها نشان دادند، فعالیت کاتالاز، پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز کاهش یافت، امّا فعالیت فنیل‌آلانین آمونیالیاز (PAL) و پراکسیداسیون لیپیدها نسبت به شاهد افزایش معنی‌داری داشت. اثر تیمار برونزای ترانس سینامیک‌اسید بر محتوای آلکالوئیدی گیاه داتوره (Brugmansia candida Pres.) توسط Marconi و همکاران (2007) بررسی شد. هرچند سینامیک‌اسید بر رشد گیاه اثر منفی داشت، امّا سبب افزایش آلکالوئیدهای آن به ویژه اسکوپولامین شد. سینامیک‌اسید یکی از فنیل‌پروپانوئیدها‌ی اصلی با فعالیت پاد‌اکسایشی است که توسط گیاهان در پاسخ به تنش تولید می‌شود. کاربرد سینامیک‌اسید برون‌زا در کشت ذرّت در شرایط شوری، آسیب­های اکسیداتیو را از طریق القای فعالیت آنزیم‌های پاداکساینده مانند سوپراکسیددیسموتاز و پراکسیداز کاهش داد. همچنین محتوای مالون‌دی‌آلدئید نیز بطور معنی‌داری کاهش یافت (Singh et al., 2013). در این پژوهش برای افزایش تولید آلکالوئیدهای ارزشمند دارویی آماریلیداسه در گیاه نرگس، کالوس‌های حاصل از پیاز گیاه N. tazetta به عنوان مدلی از بافت­های تولید کننده AA در کشت مایع تحت تیمارهای Fe₃O₄-NPs و پیش‌ماده‌های ترانس سینامیک‌اسید (tCA) و L- فنیل­آلانین (L-Phe) قرار گرفت و در دو بازه زمانی تغییر برخی فاکتورهای بیوشیمیایی کالوس‌ها به ویژه محتوای آلکالوئیدها، ترکیبات فلاونوئیدی و فعالیت آنزیم‌های پاداکسایشی آن به منظور فهم سازوکار مؤثر بررسی شد.

مواد و روش‌ها

کشت بافت ریزنمونه پیاز و تیماردهی

در این پژوهش از پیازهای گیاه نرگس گونه‌یL.  N. tazetta واریته شهلا که از مزارع بهبهان تهیه شده بود، استفاده شد. به منظور ضد عفونی پیازها، ابتدا پیازهای یک اندازه (با قطر متوسط 3 تا 4 سانتی متر) جهت کشت بافت انتخاب و فلس‌های خشک رویی جدا و فلس­های میانی برش داده شدند. ضدعفونی پیازها به روش Alvirdi-Pourganjelo و همکاران (2019) انجام شد. مراحل ضدعفونی شامل غوطه­ورکردن قطعات فلس‌های پیاز نرگس در آب گرم 54 درجه سانتی‌گراد (2 ساعت)، قارچ‌کش بنومیل 5/0 درصد (30 دقیقه)، هیپوکلریت سدیم 20 درصد (15 دقیقه)، اتانول 70 درصد (2 دقیقه) و کلرید جیوه 15/0 درصد (7 دقیقه) بود. سپس ریزنمونه‌ها به محیط کشت‌های MS حاوی غلظت‌های یک میلی­گرم در لیتر از هریک از هورمون‌های 2,4-D و BAP (به ترتیب 5/4 و 4/4 میکرومولار) جهت القای کالوس منتقل و تحت دوره نوری 16 ساعت روشنایی/ 8 ساعت تاریکی در دمای 2± 23 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند (شکل A1). پس از 35 روز، کالوس­های هم­اندازه برای تیمار با نانوذرات و پیش­ماده‌ها در محیط کشت مایع انتخاب شدند (شکل B1). نانوذرات اکسید آهن (Fe₃O₄) با خلوص 98%، قطر ذرات 30-20 نانومتر، چگالی 1/5-8/4 گرم بر سانتی­متر مکعب و کروی شکل از شرکت نانوصدرای مشهد خریداری شد (شکل C1) و جهت تهیه محلول مادر 500 میلی‌گرم در لیتر یکنواخت به مدت 30 دقیقه با امواج فراصوت (قدرت 60 وات) همگن شدند. همچنین دو پیش‌ماده‌ی ترانس سینامیک‌اسید و L-فنیل­آلانین (Sigma-Aldrich, UK) در غلظت‌ 200 میلی‌گرم در لیتر (35/1 میلی‌مولار tCA، 21/1 میلی‌مولار L-Phe) تهیه و سترون شدند. کالوس‌‌های هفت روزه به محیط مایع MS  حاوی نانوذرات و پیش‌ماده‌ها به تنهایی یا به‌صورت توام منتقل و روی شیکر با سرعت 100 دور در دقیقه و دمای 25 درجه نگهداری شدند. تیمار با Fe₃O₄-NPs در غلظت‌های 0 و 500 میلی‌گرم در لیتر و پیش‌ماده‌های tCA و L-Phe در غلظت‌های نهایی 0 و 200 میلی‌گرم در لیتر انجام شد. کالوس‌ها در دو مرحله زمانی 2 و 15 روز بعد از شروع تیمار برداشت و برای انجام سنجش‌های بیوشیمیایی در فریزر 80- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.

شکل 1- تولید کالوس از جداکشت‌های پیاز نرگس شهلا در محیط کشت موراشیگ اسکوگ حاوی یک میلی‌گرم در لیتر 2,4-D و BAP 21 روز (A) و 35 روز پس از کشت (B)، تصویر میکروسکوپ الکترونی روبشی (FeSEM) از نانوذرات اکسید آهن (C).

Figure 1- Callus induction from N. tazatta bulb explant on MS media containing 1 mg/L 2,4-D and BAP after 21 days (A) and 35 days (B), scanning electron microscope (FeSEM) image of iron oxide nanoparticles (C).

سنجش ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی کل

برای سنجش­های بیوشیمیایی، ریزنمونه­ها در روز دوم و پانزدهم واکشت در محیط مایع حاوی پیش ماده­ها و نانوذرات برداشت شدند. برای سنجش ترکیبات فنولی و فلاوونوئیدی، 1/0 گرم کالوس خشک و پودر شد و با 10 میلی‌لیتر اتانول 70 درصد مخلوط و روی شیکر با سرعت 100 دور در دقیقه به مدت 24 ساعت قرار داده شد. سپس به مدت 15 دقیقه در  ×g10000 سانتریفوژ شد و مایع رویی برای سنجش‌های بعدی استفاده شد. محتوای ترکیبات فنولی کل با معرف فولین-سیکالتو ((Folin-Ciocaltue اندازه‌گیری شد (Tunc-Ozdemir et al., 2009). به 2/0 میلی‌لیتر از عصاره، 2/0 میلی لیتر معرف (2/0 مولار) و 8/1 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه شد. پس از 5 دقیقه، 2 میلی‌لیتر محلول کربنات‌سدیم (Na₂CO₃ 7 درصد) اضافه شد و حجم نهایی با آب مقطر به 5 میلی‌لیتر رسانده و به مدت 90 دقیقه انکوبه شد. سپس جذب در طول موج 750 نانومتر اندازه‌گیری و محتوای ترکیبات فنولی کل بر حسب معادل میلی‌گرم گالیک‌اسید در گرم وزن خشک کالوس محاسبه شد. محتوای ترکیبات فلاونوئیدی کل با کلرید آلومینیوم سنجیده شد (Zhishen et al., 1999). به 2/0 میلی‌لیتر از عصاره، 5/4 میلی‌لیتر اتانول 90%، 2/0 میلی‌لیتر کلرید آلومینیوم 2%، 1/0 میلی‌لیتر اسید استیک آبی %33 اضافه و به خوبی مخلوط شد. پس از 30 دقیقه، جذب در 414 نانومتر اندازه‌گیری و محتوای فلاونوئید کل بر حسب معادل میلی‌گرم کوئرستین در گرم وزن خشک کالوس محاسبه شد.

سنجش محتوای آلکالوئید کل

برای اندازه‌گیری محتوای آلکالوئید کل از روش اصلاح شده Renaudin (1984) استفاده شد. یک گرم کالوس‌ با ازت مایع پودر و با 25 میلی‌لیتر متانول مخلوط شد. سپس نمونه­ها به مدت 10 دقیقه در حمام آبی تحت تأثیر امواج فراصوت و مدت 24 ساعت با سرعت 100 دور در دقیقه روی شیکر قرار داده شدند. فرآیند سونیکاسیون به مدت 20 دقیقه تکرار شد و نمونه‌ها در  ×g10000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند، مایع رویی جدا و رسوب با 5 میلی‌لیتر متانول شسته شد. سپس عصاره‌ها تحت خلأ تبخیر شدند. عصاره خشک در 4 میلی‌لیتر اسید سولفوریک 3 درصد حل و با 15 میلی‌لیتر دی‌اتیل‌اتر (در 3 مرحله) در یک قیف جداکننده چربی‌زدایی شد. سپس pH محلول با آمونیاک 25 درصد روی 9-10 تنظیم و ترکیبات آلکالوئیدی با 21 میلی‌لیتر کلروفرم (در 3 مرحله) استخراج شد. برای آب‌زدایی مقدار کمی سولفات سدیم بی آب به عصاره کلروفرمی اضافه و پس از 10 دقیقه مخلوط فوق سانتریفیوژ و مایع رویی تا خشک شدن کامل هوادهی شد. سپس 10 میلی لیتر اتانول مطلق به رسوب خشک‌شده برای سنجش آلکالوئیدها اضافه و جذب نمونه­ها در 259 نانومتر اندازه‌گیری شد. ازگالانتامین بروماید(Sigma-Aldrich, UK) به عنوان استاندارد برای سنجش محتوای آلکالوئید استفاده شد (Klosi et al., 2016).

سنجش محتوای پراکسید هیدروژن (H₂O₂)

برای ارزیابی محتوای پراکسید هیدروژن در کالوس‌ها، 4/0 گرم از نمونه تازه در 4 میلی‌لیتر تری کلرواستیک اسید 1/0 درصد (TCA) همگن و در  ×g13000 به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس 1 میلی‌لیتر از مایع رویی به 1 میلی‌لیتر بافر فسفات پتاسیم (1/0 مولار، 7 pH) و 2 میلی لیتر یدید پتاسیم (1 مولار) اضافه و جذب مخلوط واکنش در طول موج 390 نانومتر قرائت شد. محتوای H₂O₂ بر اساس روش Velikova و همکاران (2000) برآورد شد.

سنجش محتوای مالون‌دی‌آلدئید (MDA)

از روش پراکسیداسیون لیپیدی برای ارزیابی آسیب اکسیداتیو و تعیین بهره‌وری سیستم پاداکسایشی استفاده می‌شود. 5/0گرم از بافت تازه کالوس با 5/2 میلی‌لیتر تری کلرواستیک اسید 1/0 درصد (TCA) استخراج و در  ×g4000 به مدّت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. به یک میلی‌لیتر از مایع رویی، 4 میلی‌لیتر محلول TCA  20 درصد حاوی 5/0 درصد تیوباربیتوریک اسید (TBA) اضافه و 30 دقیقه در حمام آب جوش حرارت داده شد، سپس بلافاصله در یک حمام یخ خنک شد. پس از سانتریفیوژ مخلوط واکنش در  ×g10000 به مدت 10 دقیقه، جذب مایع رویی در 532 و 600 نانومتر خوانده شد. در این روش تولید مالون‌دی‌آلدئید و واکنش آن با تیوباربیتوریک اسید سبب تشکیل کمپلکس رنگی MDA-TBA می‌شود که با روش رنگ­سنجی قابل اندازه‌گیری است. محتوای مالون‌دی‌آلدئید با ضریب خاموشی 155 بر مولار بر سانتی‌متر محاسبه شده جذب غیراختصاصی در 600 نانومتر کم می‌شود (Heath & Packer, 1986).

تعیین فعالیت آنزیم‌های پاداکسایشی

برای استخراج پروتئین محلول کل، 1 گرم نمونه تر کالوس با نیتروژن مایع سائیده و در 5 میلی‌لیتر بافر فسفات پتاسیم (05/0 مولار، 2/7 pH) همگن شد. سپس نمونه­ها در  ×g15000 به مدّت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شدند. مایع رویی جهت تعیین غلظت پروتئین با روش برادفورد (Bradford, 1976) استفاده شد. مخلوط واکنش سنجش فعالیت سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، 100 میلی لیتر بافر فسفات پتاسیم (2/0 مولار، 7 pH) حاوی 194/0 گرم متیونین، 0021/0 گرم نیترو بلو تترازولیوم (NBT) و 0028/0 گرم ریبوفلاوین بود. به 5/1 میلی‌لیتر از مخلوط واکنش، 50 میکرولیتر عصاره پروتئینی اضافه شد و مخلوط به مدت 18 دقیقه در معرض لامپ فلورسنت قرار گرفت و جذب آن در طول موج 560 نانومتر تعیین شد. یک واحد SOD به عنوان مقدار آنزیمی تعریف می‌شود که باعث بازدارندگی پنجاه درصدی احیاء نوری NBT ‌شود (Beauchamp & Fridovich, 1971).

سنجش فعالیت پراکسیداز (POD) بر اساس روش توصیف شده توسط Liu و همکاران (1999) انجام شد. مخلوط واکنش آنزیم حاوی 95/0 میلی‌لیتر بافر سیترات سدیم (1/0 مولار، 6 pH)، 1 میلی‌لیتر گایاکول 15 میلی‌مولار و 50 میکرولیتر عصاره پروتئینی بود. واکنش با افزودن 1 میلی‌لیتر پراکسید هیدروژن 32 میلی‌مولار آغاز و تغییرات جذب در طول موج 470 نانومتر تا 3 دقیقه ثبت شد. فعالیت POD با ضریب خاموشی گایاکول محاسبه و به عنوان واحد در هر میلی­گرم پروتئین بیان شد. برای تعیین فعالیت کاتالاز (CAT) از روش Dazy و همکاران (2008) استفاده شد. به 5/2 میلی‌لیتر بافر فسفات پتاسیم (05/0 مولار، 7 pH)، 2/0 میلی‌لیتر عصاره پروتئینی اضافه شد، سپس واکنش آنزیمی با افزودن 3/0 میلی‌لیترH₂O₂  3 درصد آغاز شد. فعالیت کاتالاز در 240 نانومتر با تجزیه H₂O₂ اندازه‌گیری و فعالیت CAT به عنوان واحد در هر میلی‌گرم پروتئین بیان شد.

سنجش فعالیت آنزیم‌های PAL و TAL

برای تهیه‌ی عصاره آنزیمی، 1/0 گرم بافت تر کالوس در نیتروژن مایع پودر و با 2 میلی‌لیتر بافر Tris-HCl (8/8 pH، حاوی 15 میلی‌مولار β-مرکاپتواتانول) در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سائیده و در  ×g15000 به مدّت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد، مایع رویی برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیم­ها استفاده شد. آنزیم فنیل‌آلانین آمونیالیاز (PAL) واکنش تبدیل فنیل‌آلانین به ترانس سینامیک‌اسید (tCA) را کاتالیز می­کند. در این روش از L-فنیل‌آلانین به عنوان گهرمایه استفاده می‌شود. مخلوط واکنش حاوی 1 میلی‌لیتر بافر استخراج، 5/0 میلی‌لیتر L-فنیل‌آلانین 10 میلی‌مولار، 350 میکرولیتر آب دوبار تقطیر و 150 میکرولیتر عصاره بود. نمونه‌ها به مدّت یک ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند. سپس واکنش با افزودن 5/0 میلی لیتر هیدروکلریک‌اسید (6 مولار) متوقف و محصول با 10 میلی‌لیتر اتیل استات استخراج شد. نمونه‌ها تحت جریان هوا تبخیر شدند و رسوب جامد در 3 میلی‌لیتر NaOH (05/0 مولار) حل و جذب در 290 نانومتر خوانده شد. یک واحد از فعالیت آنزیم PAL معادل 1 میکرومول از سینامیک‌اسید تولید شده در دقیقه به ازای هر میلی‌گرم پروتئین است. غلظت سینامیک اسید با ضریب خاموشی سینامیک اسید معادل 9500 بر مولار بر سانتی‌متر به دست آمد (Kyndt et al., 2002). فعالیت تیروزین آمونیالیاز (TAL) مشابه روش سنجش PAL با کمی تغییر اندازه‌گیری شد. مخلوط سنجش حاوی 1 میلی‌لیتر بافر استخراج، 5/0 میلی‌لیتر محلول تیروزین 5/5 میلی‌مولار،350 میکرو‌لیتر آب دوبار تقطیر و در نهایت 150 میکرولیتر عصاره‌ی آنزیمی بود. ادامه واکنش در شرایطی شبیه روش سنجش فعالیت PAL انجام و فعالیت TAL با اندازه­گیری جذب در 310 نانومتر ارزیابی شد (Kyndt et al., 2002). یک واحد از فعالیت آنزیم TAL معادل 1 میکرومول از کوماریک‌اسید تولید شده در دقیقه به ازای هر میلی‌گرم پروتئین محاسبه شد. غلظت کوماریک اسید با استفاده از ضریب خاموشی کوماریک اسید معادل 1000 بر مولار بر سانتی‌متر به دست آمد (Kyndt et al., 2002).

تجزیه تحلیل آماری

تمام آزمایش‌ها حداقل در سه تکرار مستقل و در قالب طرح کامل تصادفی انجام شد. تیمارهای مربوط به کشت بافت حداقل در 9 تکرار توسط ریزنمونه­های جدا شده از پیازهای مختلف نمونه نرگس تهیه شده اجرا شد، سپس ریزنمونه­ها در زمان معین برداشت شدند. فعالیت آنزیم­های مورد بررسی و محتوای متابولیت­های ثانوی موجود در ریزنمونه­ها به­صورت میانگین سه تکرار ± SE (خطای استاندارد) محاسبه شد، سپس تجزیه و تحلیل واریانس دوطرفه داده­ها با نرم افزار SPSS version 26 انجام و معنی­دار بودن اختلاف میانگین­ها در سطح P<0.05 تعیین شد. میانگین‌ها به کمک آزمون چند دامنه‌ای دانکن مقایسه و گروه‌بندی شدند.

نتایج

در ابتدا برای اطمینان از نفوذ نانوذرات در کالوس‌های تیمار شده با Fe₃O₄-NP، غلظت عنصر آهن در کالوس‌ها با روش ICP-OES (طیف‌سنجی پلاسمای جفت‌شده القایی) بطور کمّی بررسی شد که افزایش معنی‌داری را در بافت تیمار شده نسبت به شاهد نشان داد. در دو نمونه مورد بررسی 15 روز پس از تیمار، غلظت یون آهن در کالوس­های تحت تیمار 500 میلی‌گرم در لیتر Fe₃O₄-NPs، برابر 58/3 پی‌پی‌ام و در نمونه شاهد برابر 01/0 پی‌پی‌ام برآورد شد. پس از آن سنجش‌های بیوشیمیایی انجام شد که نتایج آن به شرح زیر است:

تغییر محتوای ترکیبات فنولی، فلاونوئیدی و آلکالوئیدی کل

محتوای ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی کل در کالوس‌های گیاه نرگس به‌طور قابل توجهی در طول تیمار افزایش یافت. به ویژه در تیمارهای ترکیبی پیش‌ماده‌ها که همراه با نانوذرات اکسید آهن بکار رفته بودند، بیشترین تأثیر در محتوای این ترکیبات بخوبی 2 و 15 روز پس از تیمار مشاهده شد. کمترین محتوای ترکیبات فنولی در کالوس‌های شاهد بدست آمد که از 05/1 میلی‌گرم در گرم وزن خشک در روز دوم پس از تیمار به 15/1 میلی‌گرم در گرم وزن خشک (1/1 برابر افزایش) در روز پانزدهم پس از تیمار تغییر یافت. در حالی که بیشترین محتوای این ترکیبات (96/2 میلی‌گرم بر گرم وزن خشک معادل حدود 57/2 برابر افزایش) پس از تیمار کالوس‌ها با 200 میلی‌گرم در لیتر فنیل­آلانین همراه با 500 میلی‌گرم در لیتر نانو ذرات اکسیدآهن مشاهده شد. میانگین محتوای ترکیبات فنولی کالوس‌ها پس از تیمار با Fe₃O₄-NPs، tCA و L-Phe از مقدار 3/1- 31/2 میلی‌گرم در گرم در روز دوم پس از تیمار به 05/2 - 96/2 میلی‌گرم در گرم وزن خشک کالوس در روز پانزدهم تیمار تغییر کرد (شکل A2). تمامی تیمارهای به‌کار برده شده اعم از پیش­ماده‌ها و نانو ذرات اکسید آهن به­صورت ساده و ترکیبی اثر فزاینده‌ای بر محتوای فلاونوئیدی کالوس گیاه نرگس داشتند. افزایش محتوای این ترکیبات در کالوس‌ها در روز پانزدهم پس از تیمار نسبت به روز دوم بیشتر بود. 15 روز پس از تیمار، محتوای فلاونوئید کل کالوس‌ها نسبت به گیاهان شاهد از حدود 5/1 برابر تحت تیمارهای منفرد به حدود 2 برابر در تیمارهای توام نانوذرات و یکی از پیش‌ماده‌ها افزایش یافت. درواقع، افزودن نانوذرات اکسید آهن به تیمار پیش‌ماده‌ها سبب تشدید اثرات آن‌ها شد و محتوای ترکیبات فلاونوئیدی را از میانگین حدود 47/0 به 65/0 میلی‌گرم در گرم وزن خشک کالوس تغییر داد (شکل B2).

تیمار گیاه نرگس با نانوذرات اکسید آهن و پیش­ماده‌ها (tCA و L-Phe) محتوای ترکیبات آلکالوئیدی کل را در بافت کالوس به طور قابل توجهی افزایش داد. تغییرات در محتوای آلکالوئیدها در تیمارهای ترکیبی شاخص تر از تیمارهای منفرد بود. دو روز پس از تیمار با NPs-tCA+ Fe₃O₄ و NPs-L-Phe+ Fe₃O₄، محتوای آلکالوئیدی در مقایسه با شاهد حدود 42/1 برابر افزایش یافت (5/10 در برابر 45/7 میلی‌گرم در گرم وزن خشک کالوس). با گذشت زمان، 15 روز پس از استخراج، محتوای آلکالوئیدها در کالوس گیاه نرگس تیمار شده نسبت به شاهد به طور معنی‌داری افزایش یافت. برای مثال، محتوای آلکالوئید کل با تیمار NPs- Fe₃O₄ برابر 28/13 میلی‌گرم در گرم وزن خشک کالوس (62/1 برابر نسبت به شاهد) و در تیمارهای ترکیبی 18/15 تا 31/15 میلی‌گرم در گرم وزن خشک کالوس (تقریبا 87/1 برابر شاهد) اندازه­گیری شد. از سوی دیگر، تغییر محتوای آلکالوئید نمونه شاهد در طول زمان معنی­دار نبود، به طوری که از 45/7 به 16/8 میلی‌گرم در گرم وزن خشک کالوس افزایش نشان داد (شکل C2).

شکل 2- مقایسه محتوای ترکیبات فنولی (A)، فلاونوئیدی (B) و آلکالوئیدی کل (C) در کالوس‌های N. tazetta L. تیمار شده با NPs-Fe₃O₄، tCA و L-Phe در روزهای دوم و پانزدهم پس از تیمار. میانگین­ها سه تکرار ± SE (خطای استاندارد) هستند، مقایسه میانگین‌ها با استفاده از آزمون چند دامنه‌ای دانکن انجام شده و حروف یکسان نشان‌دهنده‌ی عدم وجود تفاوت معنی‌دار بین میانگین‌ها است.

Figure 2- Comparison of the contents of total phenolics (A), flavonoids (B) and alkaloids (C) in the calli of N. tazetta L. treated with Fe₃O₄-NPs, tCA, and L-Phe on the second and 15th days after treatments. Values are mean of three replicates ± SE (standard error), comparison of the means has been done using Duncan's multiple range test and same letters indicate no significant difference between means.

تغییر محتوای H₂O₂ و MDA

بررسی تغییرات میانگین‌ محتوای پراکسید هیدروژن تحت تیمارهای مختلف نشان دادند محتوای H₂O₂ کالوس­ها در نتیجه تیمار با 500 میلی‌گرم در لیتر نانواکسید آهن کاهش معنی‌داری پیدا کرد و این امر در پانزدهمین روز تیمار مشخص­تر بود، کاهش 20/5 و 83/20 درصدی به ترتیب در دومین و پانزدهمین روز پس از تیمار مشاهده شد (شکل A3). طی تیمار کالوس­ها با دو پیش‌ماده ذکر شده، ترانس‌ سینامیک‌اسید به‌طور معنی‌داری محتوای H₂O₂ را افزایش داد (2/1 برابر نسبت به شاهد 15 روز پس از تیمار)، از سوی دیگر در تیمار با فنیل‌آلانین محتوای هیدروژن‌پراکسید نسبت به شاهد به­طور معنی‌دار کاهش یافت (29 درصد کاهش نسبت به شاهد، پانزدهمین روز پس از تیمار). همانطور که در شکل A3 نشان داده شده است در تیمارهای توام (NPs- Fe₃O₄ همراه با هر یک از پیش‌ماده­ها‌) محتوای هیدروژن‌پراکسید کاهش یافت، بیشترین کاهش محتوای H₂O₂ کالوس تحت تیمار توام L-Phe+ Fe₃O₄-NPs حدود 52/23 درصد کمتر از میانگین محتوای پراکسید هیدروژن در نمونه به شاهد مشاهده شد.

میانگین محتوای MDA کالوس‌های گیاه نرگس تحت تیمار نانو ذرات اکسید آهن تفاوت معنی‌داری در دومین و پانزدهمین روز پس از تیمار نشان نداد (شکل B3). در حالی‌که محتوای این ترکیبات در کالوس‌های نرگس تحت تیمار پیش‌ماده‌ها، 2 و 15 روز پس از تیمار افزایش معنی‌داری را نشان داد. بالاترین میانگین محتوای MDA تحت تیمار کالوس­ها در محیطی حاوی 200 میلی‌گرم در لیتر هر یک از پیش‌ماده­ها به تنهایی در پانزدهمین روز تیمار بدست آمد. همچنین افزایش 06/2 برابری تحت تیمار ترانس ‌سینامیک‌اسید و 15/2 برابری تحت تیمار فنیل‌آلانین نسبت به شاهد مشاهده شد. گرچه تیمارهای توام نانو ذرات اکسید آهن و هر یک از پیش‌ماده‌ها سبب افزایش محتوای MDA کالوس­ها شده بود، امّا میانگین محتوای این ترکیبات اختلاف معنی‌داری با تأثیر تیمار هریک از پیش­ماده‌ها در غلظت 200 میلی‌گرم در لیتر نشان نداد (شکل B3).

شکل 3- مقایسه محتوای H₂O₂ (A) و MDA (B) در کالوس‌های N. tazetta L. تیمار شده با NPs- Fe₃O₄، tCA و L-Phe در روزهای دوم و پانزدهم پس از تیمار. مقایسه میانگین‌ها با استفاده از آزمون چند دامنه‌ای دانکن انجام شده است. مقادیر، میانگین سه تکرار ± SE (خطای استاندارد) هستند و حروف یکسان نشان‌دهنده‌ی عدم وجود تفاوت معنی‌دار بین میانگین‌ها است.

Figure 3- Comparison of H₂O₂ (A) and MDA (B) contents in calli of N. tazetta L. treated with Fe₃O₄-NPs, tCA, and L-Phe on the second and 15th days after treatment. Comparison of the means has been done using Duncan's multiple range test. Values are mean of three replicates ± SE (standard error), and same letters indicate no significant difference between means.

تغییر فعالیت آنزیم‌های PAL و TAL

نتایج نشان دادند پس از تیمار کالوس‌ها با محرک‌های مختلف، افزایش معنی‌داری در فعالیت آنزیم‌های فنیل‌آلانین آمونیالیاز (PAL) و تیروزین آمونیالیاز (TAL) نسبت به شاهد مشاهده شد (شکل 4)، در نتیجه تیمار کالوس‌ها با نانوذرات اکسید آهن فعالیت آنزیم PAL به میزان اندکی (1/1 برابر شاهد) افزایش نشان داد، درصورتی‌که پس از تیمار با L-Phe + Fe₃O₄-NPs در روزهای دوم و پانزدهم تیمار به بالاترین حد خود یعنی حدود 6/2 برابر شاهد رسید. همچنین، اثر پیش‌ماده‌ی فنیل آلانین در افزایش سطح فعالیت PAL بیشتر از تأثیر ترانس سینامیک‌اسید بود (به ترتیب افزایش 39/2 برابر در مقابل 71/1 برابر فعالیت PAL در نمونه شاهد). مشابه اثر فنیل­آلانین، تیمار توام tCA + Fe₃O₄ -NPs سبب افزایش فعالیت آنزیم PAL در دومین و پانزدهمین روز پس از تیمار شد. همانطور که در شکل A4 دیده می‌شود افزایش فعالیت PAL تحت تیمارهای مختلف الگوی مشابهی را در دو زمان مورد بررسی نشان می‌دهد. فعالیت آنزیم TAL پس از تیمار کالوس­ها با نانوذرات اکسیدآهن افزایشی حدود 27 درصد را نشان داد (شکل B4)، امّا تیمار دو پیش‌ماده‌ی L-Phe و tCA به تنهایی و در ترکیب با Fe₃O₄-NPs فعالیت این آنزیم را به میزان قابل‌توجهی افزایش دادند (شکل B4). بیشترین فعالیت آنزیم TAL در تیمار tCA + Fe₃O₄ -NPs در روزهای دوم و پانزدهم پس از تیمار (به ترتیب 61/2 و 31/2 برابر نمونه شاهد) و در تیمار L-Phe + Fe₃O₄ -NPs (به ترتیب 53/2 و 29/2 برابر نمونه شاهد) ثبت شد. کاربرد پیش‌ماده‌های tCA و L-phe به تنهایی نیز بطور معنی‌داری فعالیت آنزیم TAL در کالوس‌ها را افزایش داد که البته فعالیت نسبت به اثر تیمارهای ترکیبی کمتر بود. همچنین فعالیت آنزیم فوق در طول زمان از روز دوم نسبت به روز پانزدهم پس از تیمار کاهش نشان داد (شکل B4).

شکل 4- مقایسه فعالیت آنزیم‌های PAL (A) و TAL (B) در کالوس‌های N. tazetta L. تیمار شده با نانوذرات Fe₃O₄-NPs ، tCA و L-Phe در روزهای دوم و پانزدهم پس از تیمار. مقادیر میانگین سه تکرار ± SE (خطای استاندارد) هستند. مقایسه میانگین‌ها با استفاده از آزمون چند دامنه‌ای دانکن انجام شده و حروف یکسان نشان‌دهنده‌ی عدم وجود تفاوت معنی‌دار بین میانگین‌ها است.

Figure 4- Comparison of the PAL (A) and TAL (B) activities of the calli of N. tazetta L. treated with Fe₃O₄-NPs, tCA, and L-Phe on the second and 15th days after treatment. Values are mean of 3 replicates ± SE (standard error), comparison of means has been done using Duncan's multiple range test and same letters indicate no significant difference between means.

تغییرات در فعالیت آنزیم‌های پاداکسایشی

مقایسه تغییرات فعالیت آنزیم‌های پاداکسایشی کالوس گیاه نرگس تحت تیمار نانوذرات آهن و پیش‌ماده‌ها به تنهایی یا ترکیبی در شکل 5 نشان داده شده است. میانگین فعالیت آنزیم‌های فوق در کالوس‌های تیمار شده و تیمار نشده تفاوت معنی‌داری را نشان دادند. تمامی تیمارها در روزهای دوم و پانزدهم پس از تیمار به طور قابل توجهی فعالیت SOD، POD و CAT کالوس‌ها را افزایش دادند، به استثنای فعالیت CAT که با تیمار tCA کاهش یافت (11/0 واحد در میلی‌گرم پروتئین در برابر 16/0 واحد بر میلی‌گرم پروتئین در شاهد). اما این اثر کاهشی در تیمار ترکیبی با Fe₃O₄-NPs بهبود یافت، به‌‌طوری‌که فعالیت کاتالاز در تیمار tCA + Fe₃O₄-NPs برابر 23/0 واحد به ازای هر میلی‌گرم پروتئین محاسبه شد (شکل C5). بیشترین میزان فعالیت کاتالاز پس از تیمار با L-Phe + Fe₃O₄-NPs در روزهای دوم و پانزدهم پس از تیمار به ترتیب حدود 43/0 و 47/0 واحد به ازای هر میلی‌گرم پروتئین مشاهده شد. اگرچه تیمارهای tCA و L-Phe به تنهایی محرک‌های مؤثری برای افزایش فعالیت SOD و POD در کالوس‌های نرگس بودند، امّا افزودن نانوذرات اکسید آهن باعث تشدید اثر این دو پیش‌ماده در روزهای دوم و پانزدهم پس از تیمار شد. بر اساس نتایج تیمارهای ترکیبی کالوس­ها و بررسی میانگین فعالیت آنزیم‌های پاداکسایشی آن‌ها در مقایسه با نمونه شاهد، افزایش 97/1-88/1 برابری فعالیت SOD (شکل A5)، افزایش 61/2-22/2 برابری فعالیت POD (شکل B5) و افزایش 68/2-35/2 برابری فعالیت CAT (شکل C5) مشاهده شد. شکل 6 نتایج حاصل از آزمون همبستگی پیرسون بین متغیرهای اندازه­گیری شده را 15 روز پس از تیمار کالوس­ها نشان می‌دهد. بر طبق این آزمون بین افزایش فعالیت آنزیم‌های SOD، POD، TAL، PAL و سطوح MDA با افزایش محتوای ترکیبات فنولی، فلاونوئیدی و آلکالوئیدهای موجود در کالوس­های گیاه نرگس کشت شده در حضورFe₃O₄-NPs ، tCA وL-Phe همبستگی مثبت و قوی (بین 8/0 تا 99/0) وجود داشت، همبستگی بین محتوای این متابولیت‌های ثانوی و فعالیت آنزیم CAT، مثبت با شدت متوسط (بین 39/0 تا 15/0) بود. در حالی‌که تغییرات محتوای پراکسید هیدروژن نسبت به انباشتگی متابولیت­های ثانوی و فعالیت آنزیم‌های پاداکسایشی منفی بود (6/0- تا 13/0-). نتایج بررسی ضرایب همبستگی پیرسون بین پارامترهای ذکر شده در روزهای دوم و پانزدهم پس از تیمار الگوی تقریبا مشابهی را نشان دادند.

شکل 5- مقایسه فعالیت آنزیم‌های SOD (A)، POD (B) و CAT (C) در کالوس‌های N. tazetta L. تیمار شده با Fe₃O₄-NPs ، tCA و L-Phe در روزهای دوم و پانزدهم پس از تیمار. مقادیر، میانگین سه تکرار ± SE (خطای استاندارد) هستند. مقایسه میانگین‌ها با استفاده از آزمون چند دامنه‌ای دانکن انجام شده و حروف یکسان نشان‌دهنده‌ی عدم وجود تفاوت معنی‌دار بین میانگین‌ها است.

Figure 5- Comparison of the SOD (A), POD (B) and CAT (C) activities of the calli of Narcissus tazetta L. treated with Fe₃O₄-NPs, tCA, and L-Phe on the second and 15th days after treatment. Values are the mean of three replicates ± SE (standard error), comparison of means has been done using Duncan's multiple range test and same letters indicate no significant difference between means.

شکل 6- ماتریس ضرایب همبستگی پیرسون، رابطه بین متغیرها را نشان می‌دهد. دایره­های با رنگ آبی و قرمز به ترتیب نشانگر رابطه مثبت و منفی بین متغیرها است. شدت رنگ و قطر هر دایره شدت و بزرگی همبستگی بین متغیرها را نمایان می‌سازد.

Figure 6- The matrix of Pearson correlation coefficients shows the relationship between the variables. Blue and red circles indicate positive and negative relationships between variables, respectively. The color intensity and diameter of each circle show the intensity and magnitude of correlation between variables.

بحث

استفاده از محرک‌ها یکی از مؤثرترین راهکارها برای افزایش تولید متابولیت‌های ثانوی مطلوب در گیاه است (Ramachandra & Srinivasa, 2008). محرک‌ها می‌توانند الگوی فعالیت گروهی از ژن‌ها و آنزیم‌های مسیرهای بیوسنتزی برخی متابولیت‌های ثانوی را تغییر دهند (Howlett, 2006). شروع پاسخ‌های دفاعی در گیاهان باعث ایجاد یک شبکه انتقال علامت می‌شود که با شناسایی محرک توسط گیرنده‌های سطح یا درون سلول آغاز می‌شود (Zhang et al., 2012). در این پژوهش از سه محرک برای بهبود تولید ترکیبات مؤثره در گیاه نرگس استفاده شد. از آنجایی که نانوذرات اکسید آهن همراه با tCA و L-Phe، سبب افزایش محتوای ترکیبات فنولی، فلاونوئیدها، آلکالوئیدها و همچنین فعالیت آنزیم‌های SOD، POD و CAT شدند می‌توان نتیجه گرفت نانوذرات اکسید آهن سبب ایجاد تنش اکسیداتیو و سپس فعال‌شدن پاسخ‌های دفاعی در کالوس‌های نرگس شده است (شکل 7).

شکل 7- سازوکار اثر تیمارهای Fe₃O₄-NPs ، tCA و L-Phe روی افزایش محتوای ترکیبات فنولی، فلاونوئیدها و آلکالوئیدهای کالوس نرگس شهلا

Figure 6. Mechanism of the treatment effects of Fe₃O₄-NPs, tCA and L-Phe on increasing the content of phenolic, flavonoid and alkaloid compounds in N. tazetta callus

نانوذرات اکسید آهن به عنوان ترکیبی که فراهم­کننده یک ماده مغذی حیاتی است، در فرآیندهای متابولیسمی متعددی در گیاهان دخالت دارد (Hu et al., 2017). آهن نقش اساسی در رشد و نمو گیاهان دارد و فرآیندهای سلولی مختلفی را مانند بیوسنتز کلروفیل، توسعه کلروپلاست، فتوسنتز، تنفس و سنتز RNA را تنظیم می‌کند (Feng et al., 2022). متابولیت­های حد واسط تولید شده در واکنش­های فتوسنتز و تنفس به عنوان محرک و پیش‌ساز در مسیرهای بیوسنتزی متابولیت‌های ثانوی وارد می‌شوند. همچنین، آهن یک کوفاکتور ضروری برای فعالیت برخی آنزیم‌های کلیدی در این مسیر است (Kołton et al., 2022). فنیل‌آلانین، به عنوان یک اسیدآمینه معطر، پیش‌ساز بسیاری از متابولیت‌های ثانوی مانند اسیدهای فنولی، فلاونوئیدها، آنتوسیانین‌ها، لیگنین و آلکالوئیدها می‌باشد (Feduraev et al., 2020). این ماده پیش‌ساز مهمی در مسیرهای مختلف بیوسنتزی، به ویژه پروتئین‌ها، ترکیبات فنولی و اسمولیت‌ها است که از طریق فرآیندهای علامت‌دهی، بر عملکرد گیاهان در پاسخ‌ به تنش­ها تأثیر قابل توجهی دارد (Moe, 2013). محرک دیگر یعنی ترانس سینامیک‌اسید نیز به عنوان اولین ماده شیمیایی تولید شده در مسیر فنیل پروپانوئیدها پیش‌ساز بسیاری از مشتقات هیدروکسی سینامیک اسیدها است و در تشکیل سایر ترکیبات فنولی پیچیده نقش کلیدی را ایفا می‌کند (Swanson, 2003). بررسی سازوکار برخی الیسیتورها و محرک­ها حاکی از آن است که پراکسید هیدروژن که به عنوان یک مولکول علامتی در تنش‌های مختلف غیرزیستی عمل می‌کند در اینجا نیز می‌تواند شروع­کننده‌ی آبشارهای علامت­دهی برای هدف­گیری افزایش بیوسنتز متابولیت­های ثانوی باشد. این گونه فعال اکسیژن از طریق واکنش­های انتقال الکترون در میتوکندری‌ها و کلروپلاست‌ها و نیز توسط اکسیدازهای پراکسیزومی، NADPH -اکسیدازها، پراکسیدازهای نوع III و سوپراکسید دیسموتازها تولید می­شود (Smirnoff & Arnaud, 2019). در تنش اکسیداتیو، رادیکال‌های آزاد می‌توانند به عنوان مولکول‌های پیام‌رسان ثانوی عمل کرده و منجر به تجمع برخی از ترکیبات مانند ترکیبات فنولی، فلاونوئیدی و آلکالوئیدی در سلول‌ها و بافت‌های تحت تنش شوند. ترکیبات فنولی نقش استثنایی در سم‌زدایی گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) دارند (Nourozi et al., 2019). براساس نتایج این پژوهش، Fe₃O₄-NPs و L-Phe محتوای H₂O₂ را کاهش دادند، امّا tCA سبب افزایش محتوای پراکسید هیدروژن در کالوس­ها شد. یافته­های Kapoor و همکاران (2021) نشان دادند در گیاه نخود (Pisum sativum) تیمار با سینامیک اسید سبب افزایش سطح H₂O₂ شد. تیمار گیاهان با نانوذرات اکسید آهن می‌تواند تجمع H₂O₂ را کاهش دهد و تمامیّت غشای سلولی را حفظ نماید (Konate et al., 2017). این نتیجه با یافته­هایTawfik  و همکاران (2021) همخوانی دارند و نشان دادند نانوذرات اکسید آهن سبب کاهش محتوای پراکسید هیدروژن در گیاه Moringa oleifera شده بود. ثبات غشاء یک ویژگی حیاتی مورد نیاز برای زنده‌ماندن گیاه تحت تنش‌های غیر زیستی می‌باشد (Shah et al., 2020). اندازه‌گیری محصولات پراکسیداسیون لیپید یکی از معمول‌ترین و قابل قبول‌ترین روش‌های اندازه‌گیری صدمات اکسیداتیو به غشاء محسوب می‌شود. MDA به عنوان یک نشانگر ثبات غشاء و آسیب سلولی شناخته می­شود (Shah et al., 2020). بر اساس یک گزارش سطوح MDA در گیاهان گندم تیمار شده با غلظت‌های مختلف نانوذرات اکسید آهن کاهش یافته بود (Feng et al., 2022). از سوی دیگر، گیاهان نخود تیمار شده با اسید سینامیک، افزایش محتوای MDA را نشان دادند که به علّت بروز تنش اکسیداتیو ناشی از تولید بیش از حد ROS بود (Kapoor et al., 2021). آنزیم‌های پاداکسایشی برای جلوگیری از واکنش­های آبشاری و زنجیره‌ اکسیداسیون‌های کنترل‌نشده در گیاهان عمل می‌کنند. آنزیم سوپراکسید دیسموتاز (SOD) اولین خط دفاعی است که رادیکال سوپراکسید را به پراکسید هیدروژن و اکسیژن تبدیل کرده و با حذف سوپراکسید نقش مهمی در عملکرد سیستم پاداکسایشی دارد. پراکسید هیدروژن می‌تواند توسط آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز در چرخه آسکوربات-گلوتاتیون که در کلروپلاست عمل می‌کند یا توسط پراکسیداز در دیواره‌ی سلولی و سیتوپلاسم و یا توسط کاتالاز در پراکسی‌زوم و میتوکندری به آب و اکسیژن مولکولی تجزیه شود. همچنین آنزیم کاتالاز (CAT) که در تبدیل H₂O₂ به اکسیژن و آب نقش دارد، یک آنتی‌اکسیدان حیاتی است (Koleva et al., 2022). در این پژوهش، تیمار کالوس‌های نرگس توسط نانوذرات Fe₃O₄-NPs به تنهایی و همراه با tCA یا L-Phe سبب افزایش فعالیت آنزیم‌های پاداکسایشی شد. آهن بخش مهمی از سیستم ردوکس در پروتئین‌های دارای گروه هم مانند کاتالاز، پراکسیداز و سیتوکروم و پروتئین‌های Fe-S مانند فردوکسین‌ها و سوپر اکسید دیسموتاز است (Nourozi et al., 2019). نتایج پژوهش­های Wang و همکاران (2011) افزایش فعالیت SOD و CAT گیاهان چچم چندساله (Lolium perenne L.) و Cucurbita mixta را که در معرض Fe₃O₄-NPs قرار گرفته بودند نشان دادند. کاربرد فنیل‌آلانین روی برگ‌ها و بذر سویا سبب افزایش فعالیت آنزیم­های پاداکسایشی SOD، POD و CAT شد (Teixeira et al., 2017). همچنین نتایج ما نشان دادند در کالوس­های تحت تیمار tCA، فعالیت SOD و POD افزایش و فعالیت CAT کاهش نشان داد. همچنین گزارش شده است که سینامیک اسید سبب تنش اکسیداتیو می‌شود (Ye et al., 2006)، بنابراین افزایش فعالیت این آنزیم‌های پاداکسایشی قابل توجیه است. در پژوهش Sardar و همکاران (2023) نشان داده شد نانوذرات اکسید آهن سبب تحریک تولید پاداکساینده‌ها و متابولیت‌ها در کشت کالوس گیاه Bergenia ciliata (haw.) Sternb شدند. افزودن نانوذرات آهن به محیط کشت کالوس‌های فوق سبب افزایش فعالیت آنزیم‌های فنیل‌آلانین آمونیالیاز، سوپراکسید دیسموتاز، پراکسیداز، کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز شد. علاوه بر آن، محتویات ترکیبات فنولی کل و فلاونوئیدها پس از تیمار با نانوذرات افزایش یافتند. ریزنمونه‌های برگ و دمبرگ گیاه سنبل‌الطیب (Valeriana officinalis L.) در شرایط درون‌‌شیشه‌ای، با سویه A4 اگروباکتریوم رایزوژنز (Agrobacterium rhizogenesis) تلقیح شد تا ریشه موئین تولید شود. ریشه‌های موئین تکثیر داده شد و با سطوح مختلف نانو اکسید آهن تیمار شدند. نتایج نشان داد که غلظت 30 میلی‌گرم در لیتر نانواکسید آهن منجر به افزایش فعالیت آنزیم پراکسیداز و محتوای فلاونوئیدی شد (Madani et al., 2021). استفاده از دو محرک فنیل‌آلانین و ترانس‌ سینامیک‌اسید به عنوان پیش‌سازهای اولیه ترکیبات فنولی، فلاونوئیدی و آلکالوئیدی، سبب افزایش فعالیت آنزیم‌های دخیل در مسیر بیوسنتز متابولیت‌های ثانوی و افزایش تولید آن‌ها می‌شود. در پژوهش حاضر محتوای ترکیبات فنولی، فلاونوئیدی و آلکالوئیدی کل در کالوس نرگس شهلا تحت تیمارهای نانوذرات آهن و پیش‌سازهای L-Phe و tCA افزایش یافت. Sanikhani و همکاران (2020) اثر فنیل‌آلانین بر محتوای ترکیبات فنولی و فلاونوئید کل را در گیاه هندوانه ابوجهل (Citrullus colocynthis) بررسی کردند. غلظت یک میلی‌مولار فنیل‌آلانین محتوای ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی را افزایش داد. بیشترین میزان ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی به ترتیب به 94/16 و 31/7 میلی‌گرم در گرم وزن خشک گیاه رسید. Hassan و Jassim (2018) در پژوهشی نشان دادند اسیدهای فنولی شامل سینامیک‌اسید محتوای ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی برگ‌ها و ریشه‌های گیاه برنج را افزایش دادند (Xuan & Khang, 2018). کاربرد خارجی L-فنیل‌آلانین در غلظت‌های مختلف (0، 100، 200 یا 300 میلی‌گرم در لیتر) بر تولید آلکالوئیدهای گیاه شنبلیله (Trigonella foenum-graecum) آزمایش شده است. نتایج نشان دادند فنیل‌آلانین سبب افزایش معنی‌دار برخی از آلکالوئیدهای این گیاه شد (Hassan & Jassim, 2018). در پژوهشی بر روی گیاه بذرالبنج، که به عنوان منبعی غنی از ‌آلکالوئیدهای تروپانی مانند اسکوپولامین و هیوسیامین شناخته شده است، اثر یون‌های معدنی از جمله آهن بر تولید آلکالوئیدها بررسی شد. نتایج نشاندهنده‌ی افزایش محتوای آلکالوئید اسکوپولامین در طی استفاده خارجی آهن در این گیاه بود (Pudersell et al., 2012). همچنین تأثیر افزودن پیش‌ماده‌ی فنیل‌آلانین بر تجمع ترکیبات فنلی در کشت بافت بخش هوایی گیاه سداب (Ruta graveolens L.) بررسی شد. جداکشت‌ها در محیط کشت لینس مایر و اسکوگ (LS) کشت شدند و 4 هفته پس از کشت فنیل‌آلانین با غلظت 25/1 گرم در لیتر اضافه شد. تولید اسیدهای فنلی و کاتچین (5/1 برابر) با افزودن پیش‌ماده به میزان قابل توجهی افزایش یافت. بیشترین میزان اسیدهای فنلی کل در روز دوم پس از تیمار بدست آمد. پارا-کوماریک‌اسید و فرولیک‌اسید ترکیبات فنلی غالب بودند (Szewczyk et al., 2023). نتایج مشابه در کالوس‌های گیاه چای تیمارشده با یک میلی‌مولار سینامیک‌اسید مشاهده شد. در پژوهش حاضر حداکثر تجمع ترکیبات فنلی کل در سه روز پس از تیمار (حدود 50 درصد نسبت به شاهد) بدست آمد (Aksenova et al., 2023).

بررسی فعالیت‌ آنزیم‌های PAL و TAL به علّت ارتباط آن‌ها با مسیر بیوسنتز متابولیت‌های ثانوی انتخاب شد. دو آنزیم PAL و TAL جز اولین و مهم‌ترین آنزیم‌های مسیر بیوسنتز ترکیبات فنیل‌پروپانوئیدی، فنولی و آلکالوئیدی هستند. این آنزیم‌ها از طریق دآمیناسیون فنیل‌آلانین و تیروزین به ترتیب برای تولید ترانس‌سینامیک‌اسید و p-کوماریک‌اسید (هیدروکسی ‌سینامیک‌اسید) با آزادکردن آمونیوم عمل می‌کنند و از این طریق پیش‌سازهای ترکیبات فنولی و آلکالوئیدها تولید خواهد شد. فعالیت‌ این آنزیم‌ها تحت تمامی تیمارهای بکار برده شده در پژوهش حاضر به‌طور معنی‌داری افزایش یافت. L-Phe پیش ساز آنزیم PAL است و سبب تسریع بیوسنتز ترکیبات فنولی و آلکالوئیدی می­شود، tCA اولین محصول و آهن کوفاکتور ضروری برای بسیاری از آنزیم‌های این مسیر است. نتایج مشابهی در پژوهش Feduraev و همکاران (2020) گزارش شد، بطوری که فعالیت آنزیم‌های PAL و TAL در نمونه‌های گندم منتقل‌شده به محیط کشت حاوی µM  500 فنیل‌آلانین و تیروزین پس از 4 ساعت به‌طور معنی‌داری افزایش یافت. در پژوهش دیگری فنیل‌آلانین که به صورت افشانه برگی روی سویا بکار رفته بود، افزایش فعالیت PAL را نشان داد (Teixeira et al., 2017).

نتیجه‌گیری کلی

در پژوهش حاضر اثرات نانوذرات اکسید آهن و پیش‌ماده‌های L-فنیل­آلانین و ترانس سینامیک‌اسید بر تولید آلکالوئیدهای آماریلیداسه در کالوس حاصل از پیاز گیاه نرگس شهلا بررسی شد. تیمار کالوس‌ها در محیط کشت بافت حاوی محرک‌های فوق الذکر سبب افزایش توان آن‌ها در تولید ترکیبات فنولی و آلکالوئیدها شد. به نظر می‌رسد نانوذرات و پیش‌ماده‌ها با ورود به سلول‌ها و سطوح H₂O₂ و MDA را در ساعت های اولیه تیمار افزایش داده و باعث تنش اکسیداتیو ‌می­شوند. سپس در نتیجه انفجار ROS مسیرهای علامت‌دهی پاسخ به تنش‌های غیر زیستی، فعالیت آنزیم‌های پاداکسایشی را تشدید نموده، منجر به القاء فعالیت بیشتر آنزیم­های SOD ، CAT و POD و آنزیم­های کلیدی مسیر بیوسنتز متابولیت‌های ثانوی مانند آنزیم‌های PAL و TAL می‌شوند که افزایش محتوای ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی را به عنوان ترکیبات پاد اکساینده غیر آنزیمی بدنبال دارد و در ادامه تولید متابولیت‌های ثانوی دیگری مانند آلکالوئیدها نیز افزایش نشان داد. در نتیجه فعالیت آنزیم­های پاداکسایشی به سرعت محتوای پراکسید هیدروژن و MDA بافت­ها کاهش می­یابد، به نحوی که در پایان روز دوم و پانزدهم که برداشت ریزنمونه­ها صورت گرفت، مقدار این ترکیبات کاهش یافته بود و همبستگی منفی را با محتوای متابولیت‌های ثانوی نشان داد.