پیوندهای مفید
اخبار و اعلانات
آمار
| تعداد نشریات | 43 |
| تعداد شمارهها | 1,640 |
| تعداد مقالات | 13,343 |
| تعداد مشاهده مقاله | 29,968,325 |
| تعداد دریافت فایل اصل مقاله | 11,992,273 |
جداسازی و شناسایی باکتریوفاژ مؤثر بر سویههای Xanthomonas campestris بهمنظور کنترل زیستی آنها | ||
| زیست شناسی میکروبی | ||
| دوره 12، شماره 47، مهر 1402، صفحه 77-95 اصل مقاله (1.06 M) | ||
| نوع مقاله: پژوهشی- فارسی | ||
| شناسه دیجیتال (DOI): 10.22108/bjm.2023.137867.1541 | ||
| نویسندگان | ||
| آمنه الیکائی* ؛ سارینا پشتیبان؛ محمدرضا صعودی | ||
| گروه میکروبیولوژی، دانشکدۀ علوم زیستی، دانشگاه الزهرا، تهران، ایران | ||
| چکیده | ||
| مقدمه: باکتریهای بیماریزا در گیاهان ازجمله Xanthomonas campestris pv. campestris از مهمترین عوامل کاهش بازدهی محصولات کشاورزی و مسئول خسارتهای عمدۀ اقتصادی در صنعت کشاورزی هستند و روشهای رویارویی با بیماری که تاکنون در برابر آنها استفاده شدهاند، مقاومت باکتریایی و آسیبهای محیطی را به همراه دارند؛ بنابراین به روشهای مؤثرتری نیاز است. در مطالعههای اخیر به باکتریوفاژها بهعنوان عوامل جدید بازدارنده، ایمن و مؤثر در برابر باکتریهای بیماریزای گیاهان توجه زیادی شده است. مواد و روشها: در پژوهش حاضر، جداسازی و شناسایی باکتریوفاژ لیتیک مؤثر بر سویههایی از باکتری Xanthomonas campestris با هدف مهار دو فرم پلانکتونیک و بیوفیلم باکتری بررسی شد تا در آینده برای مبارزه با آلودگی محصولات کشاورزی به این باکتری بیماریزا استفاده شود. فاژ لیتیک مؤثر بر سویۀ Xanthomonas campestris pv. campestris DSM1706 از آب رودخانۀ کارون به روش آگار دولایه جدا شد. ریختشناسی، طیف میزبانی فاژ، پایداری در برابر دما و اسیدیته، منحنی تکثیر یکمرحلهای و اثر فاژ بر بیوفیلم باکتری بررسی شد. نتایج: بر مبنای ویژگیهای مورفولوژیک، فاژ جداسازیشده به خانواده تکتیویریده تعلق و علاوه بر سویۀ Xanthomonas campestris pv. campestris DSM1706، بر سه جدایۀ بیماریزای دیگر بهدستآمده از مزارع آلودۀ کلم شامل SAM 4209، SAM 4211 و SAM 4212، اثر لیتیک دارد. این فاژ پایداری زیادی در محدودۀ دمایی منفی 20 تا 50 درجۀ سانتیگراد و فعالیت لیتیک مناسبی در محدودۀ اسیدیتۀ 5 تا 10 دارد. بر اساس منحنی تکثیر یکمرحلهای، چرخۀ تکثیر فاژ حدود 70 دقیقه به طول میانجامد که شامل مرحلۀ نهفتگی 25 تا 30 دقیقهای و مرحلۀ آزادسازی فاژ 40 دقیقهای است. فاژ 86 درصد اثر مهاری و 93 درصد اثر حذفی بر بیوفیلم این باکتری دارد. بحث و نتیجهگیری: بر اساس نتایج پژوهش حاضر، فاژ لیتیک بهدستآمده میتواند از عوامل زیستی با پتانسیل زیاد در مهار بیماریهای گیاهی و جایگزین روشهای مبارزۀ متداول باشد. | ||
| کلیدواژهها | ||
| باکتریوفاژ؛ بیوفیلم؛ کنترل زیستی؛ Xanthomonas campestris | ||
| اصل مقاله | ||
|
مقدمه جنس Xanthomonas متعلق به خانوادۀ Xanthomonadaceae و ردۀ گاماپروتئوباکتریا[1] شامل باکتریهای گرم منفی میلهایشکل کوتاهی است که در بیش از 400 میزبان گیاهی مختلف بیماری ایجاد میکنند و مهمترین عامل بیماریزا در طیف وسیعی از گیاهان هستند که درنتیجه، کاهش بازدهی در صنعت کشاورزی را در پی دارد (1، 2)؛ برای نمونه، سویههای باکتریوفاژها، ویروسهای آلودهکنندۀ باکتریها هستند که بهطور اختصاصی به میزبان مخصوص خود حمله میکنند و برخلاف آنتیبیوتیکهای وسیعالطیف، تنها باکتریهای بیماریزای اختصاصی خود را بدون اثر مخرب بر محیطزیست از بین میبرند (4). باوجود تأثیر اقتصادی بیماری پوسیدگی سیاه بر محصولات تیرۀ کلم، روشهای کنترل عفونت ناشی از سویۀ X. campestris pv. campestris بسیار محدود هستند و روشهای مدیریت فعلی شامل جوانهزدایی، ریشهکنکردن[5]، دفن[6] و سوزاندن[7] بافتهای آلودۀ گیاهی، استریلکردن ابزار باغبانی و درمانهای شیمیایی مانند استفاده از آفتکشهای بر پایۀ مس به دلیل گسترش مقاومتهای باکتریایی، تجمع در خاک و نگرانی در زمینۀ آسیبهای محیطزیست و سلامت انسان محدود شدهاند؛ علاوهبراین، استفاده از آنتیبیوتیکها در تولید محصولات زراعی نامطلوب است و به گسترش مقاومتها، اثر بر میکروبیوتای طبیعی و ایجاد پسماند در زنجیرۀ غذایی منجر میشود (10-5)؛ در نتیجه، اجرای روشهای جایگزین سازگار با محیطزیست و سلامت انسان ازجمله استفاده از عوامل کنترل زیستی شامل باکتریوفاژها مطرح شده است که در آیندۀ نهچندان دور به گزینهای مناسب برای کنترل و مدیریت بیماریها تبدیل میشود. مهمترین مزایای استفاده از فاژها عبارتند از: فاژها بهطور طبیعی دردسترس و با محیطزیست سازگار هستند، اختصاصیت میزبانی دارند، یوکاریوتها را آلوده نمیکنند، در برابر باکتریهای مقاوم به چند دارو[8] مؤثرند، خودتکثیر و خودمحدودشونده هستند، روی بیوفیلم باکتری مؤثرند و دستکاری ژنتیکی آنها آسان است (11). از اوایل قرن نوزدهم به کنترل زیستی بیماریهای گیاهی ناشی از باکتری Xanthomonas توسط باکتریوفاژها توجه خاصی شده است؛ زمانی که محلول فیلترشده از کلمهای درحال تجزیه توانست گسترش بیماری پوسیدگی کلم ناشی از X. campestris را متوقف کند (12) و دههها بعد که مایع حاوی فاژ، لکههای باکتریایی ناشی از X. camepstris را در هلو مهار کرد (13) تا زمان حاضر، موفقیتهای مشابهی از طریق کنترل زیستی گزارش شده است. مطالعههای بسیاری در این زمینه انجام شدهاند که عبارتند از: مطالعۀ لکۀ باکتریایی گوجهفرنگی ایجادشده توسط X. campestris (14)، آتشک (بلایت) باکتریایی ژرانیوم ایجادشده توسط X. campestris pv. pelargonii (15)، آتشک (بلایت) برگ پیاز ناشی از آلودگی توسط X. axonopodis pv. Allii (16)، شانکر مرکبات و لکۀ باکتریایی مرکبات ایجادشده توسط X. axonopodis pv. citri و X. axonopodis pv. Citrumelo (17)، شانکر مرکبات آسیایی ناشی از X. axonopodis pv. citri (18) و X. citri subsp. citri (19) و آتشک (بلایت) باکتریایی برگ برنج ناشی از pv. oryzae X. oryzae (20، 21). اگریفاژ[9] از کمپانی امنیلیتیکس[10] محصولات فاژی را برای کنترل X. campestris pv. Vesicatoria و در پژوهشهای انجامشده دربارۀ فاژهای جداسازیشدۀ مؤثر علیه باکتری Xanthomonas، نتایج امیدوارکنندهای در زمینۀ مدیریت بیماریهای گیاهی در شرایط آزمایشگاهی و مزارع به دست آمده است؛ در این راستا، شناسایی و آگاهی کامل از ویژگیهای زیستی فاژهای مؤثر علیه این باکتری برای توسعۀ محصولات کنترل زیستی مؤثر بسیار حیاتی است (10).
مواد و روشها .جداسازی باکتریوفاژهای اختصاصی علیه سویۀ Xanthomonas campestris: در پژوهش حاضر، سویۀ استاندارد Xanthomonas campestris DSM 1706 بهعنوان باکتری هدف انتخاب شد؛ در گذشته، این سویه از مجموعۀ PTCCI تهیه شده است و در آزمایشگاه میکروبیولوژی صنعتی نگهداری میشود. نمونهبرداری از آب رودخانۀ کارون شهر اهواز، آب جاری زیر پل سفید (مختصات: ۳۱°۱۹′شمالی و ۴۸°۴۱′شرقی) انجام و نمونه بهسرعت به آزمایشگاه منتقل و در دمای 4 درجۀ سانتی گراد نگهداری شد. ارلن حاوی 40 میلیلیتر نمونۀ آب، 5 میلیلیتر محیط (Yeast Malt Broth)YMB10X و 5 میلیلیتر سوسپانسیون باکتری که از پیش تهیه شده بود، بهمدت خالصسازی و غنیسازی باکتریوفاژ: پلیتهای حاوی پلاک فاژی مشخص با تراکم مناسب علیه باکتری X. campestris pv. campestris DSM 1706 انتخاب و دو روش زیر برای خالصسازی و غنیسازی فاژ انجام شد: روش اول: در شرایط استریل و با لوپ استریل، یک پلاک منفرد بهطور کامل از پلیت انتخابی حاوی پلاکهای فاژ برداشته و به 5 میلیلیتر محیط YMB از پیش تهیه و اتوکلاو شده و 10 میکرولیتر سوسپانسیون تازۀ سویۀ باکتریایی X. campestris DSM 1706 روش دوم: روی پلیت انتخابی حاوی پلاکهای فاژی، 5 میلیلیتر بافر [12]SM ریخته و بهمدت 6 ساعت روی شیکر با هوادهی 50 دوردردقیقه قرار داده شد. پس از 6 ساعت و در شرایط استریل، بافر حاوی فاژ با سرنگ استریل از روی پلیت جمعآوری و به 10 میلیلیتر سوسپانسیون تازۀ سویۀ باکتریایی X. campestris DSM 1706 (با کدورت معادل نیم مکفارلند) افزوده شد. محلول بهمدت 24 ساعت در انکوباتور شیکردار با دمای 28 درجۀ سانتیگراد و هوادهی 150 دوردردقیقه قرار داده شد و پس از آن، محلول بهمدت 10 دقیقه با سرعت 6000 دوردردقیقه سانتریفیوژ و محلول رویی با فیلتر سرسرنگی 45/0 میکرون فیلتر شد (25،24). تیتر فاژ در محلول رویی بهدستآمده از هر دو روش غنیسازی مطابق روش زیر تعیین شد.
تیتراسیون باکتریوفاژ: رقتهای متوالی 1-10 تا 12-12 از محلول رویی فیلترشدۀ حاوی فاژ تهیه و روش آگار دولایه انجام شد. پس از بستهشدن کامل، پلیتها بهمدت 48 ساعت در انکوباتور 28 درجۀ سانتیگراد قرار داده شدند و سپس تعداد پلاکهای فاژی تشکیلشده روی پلیتهای مربوط به رقتهای 8-10 تا 12-12 شمارش شد و آخرین رقتی که در آن تعداد 30 تا 300 پلاک مشاهده شد، مبنای محاسبه قرار گرفت. تعداد فاژ موجود (PFU/ml)) از رابطۀ زیر محاسبه شد (26).
D=Dilution factor (رقت) V=Volume of diluted added to the well(ml) بهمنظور نگهداری مایع حاوی فاژ مدنظر و استفادۀ دوباره از آن، 500 میکرولیتر از محلول رویی فیلترشدۀ حاوی فاژ با 500 میکرولیتر گلیسرول 25 درصد استریل در کرایوویال ریخته و بهخوبی مخلوط و سپس در فریزر منفی 20 درجۀ سانتیگراد نگهداری شد. . .بررسی مورفولوژی فاژ با میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM): بهمنظور آمادهسازی نمونه، ابتدا نمونۀ حاوی باکتریوفاژ مدنظر با تیتر فاژی مناسب سانتریفیوژ و با فیلتر سرسرنگی 22/0 میکرون فیلتر شد. از مایع فیلترشده با PBS، رقت 1-10 تهیه شد. نمونه روی گرید مسی فرموار کربن مش 300 ثابت و تحتتأثیر فسفوتنگستیکاسید 2 درصد قرار گرفت و بهطور منفی رنگآمیزی شد؛ سپس اضافۀ رنگ گرفته و نمونه کاملاً خشک شد. نمونه با میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) شرکت پرتورایان رستاک(MODEL: EM208S Transmission Electron Microscope, (Philips بررسی و عکسبرداری شد.
تعیین طیف میزبانی باکتریوفاژ: اثر لیتیک باکتریوفاژ جداسازیشده بر سویههای مختلف باکتری
.بررسی پایداری باکتریوفاژ جداسازیشده در برابر عوامل محیطی. حساسیت به اسیدیته: بهمنظور بررسی اثر اسیدیتههای مختلف بر عملکرد فاژ جداسازیشده، ابتدا محیط YMB با اسیدیتههای مختلف شامل 3، 5، 7، 9 و 11 به کمک HCl یک مولار و NaOH نیممولار تهیه و اتوکلاو شد. مقدار 1/0 میلیلیتر از نمونۀ فاژ مدنظر به 9/0 میلیلیتر محیط YMB با اسیدیتههای مختلف اضافه شد و محلولها بهمدت یک ساعت در انکوباتور با دمای 28 درجۀ سانتیگراد قرار گرفتند. تیتر فاژ مدنظر در محلولهای دارای اسیدیتههای مختلف به روش آگار دولایه ارزیابی (28) و نمودار مربوطه با نرمافزار Microsoft Excel 2016 ترسیم شد. حساسیت به دما: بهمنظور بررسی اثر دماهای مختلف بر عملکرد فاژ، محیط YMB تهیه و اسیدیتۀ آن روی سنجش زمان جذب فاژ به باکتری هدف: کشت باکتری X. campestris pv. campestris DSM 1706 در محیط YMB با میزان جذب OD600= 0.15 تهیه و سپس فاژ (PFU/ml:107) به باکتری تلقیح شد. دو لولۀ آزمایش حاوی فاژ و باکتری تهیه شدند و یکی از آنها بهمدت 5 دقیقه و دیگری بهمدت 10 دقیقه در انکوباتور شیکردار با دمای 28 درجۀ سانتیگراد قرار گرفت و سپس بهمدت 10 دقیقه با سرعت 6000 دوردردقیقه سانتریفیوژ و محلول رویی با فیلتر سرسرنگی 45/0 میکرون فیلتر شد. رقتهای متوالی 1-10 تا 8-10 از مایع فیلترشده تهیه و تعداد فاژ موجود به روش آگار دولایه تعیین شد (29). تعیین منحنی تکثیر یکمرحلهای (one step curve) فاژ مدنظر: سوسپانسیون باکتری با OD600=0.4 تهیه و با فاژ مدنظر )حدود (PFU/ml:108 مخلوط شد. محلول تهیهشده بهمدت 15 دقیقه درانکوباتور با دمای 28 درجۀ سانتیگراد انکوبه و سپس بهمدت 1 دقیقه با سرعت 10000 دوردردقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. محلول رویی بهمنظور حذف فاژهای جذبنشده دور ریخته شد و سپس 5 میلیلیتر محیط YMB تازه به رسوب فاژی باقیمانده اضافه شد. سوسپانسیون حاصل بهمدت 90 دقیقه در انکوباتور شیکردار با دمای 28 درجۀ سانتیگراد و سرعت بررسی اثر باکتریوفاژ جداسازیشده روی بیوفیلم سویۀ DSM1706: نخستین گام، تهیۀ پیشکشت یا سوسپانسیون استاندارد از سویۀ مدنظر و تهیۀ محیطکشت سنتزی Y بود (31). بهمنظور تهیۀ پیشکشت، نمونهبرداری از کلنی باکتری رشدکرده روی محیط YMA انجام و نمونه در 5 میلیلیتر محیط مایع YMB تلقیح شد. نمونه حدود 8 ساعت در انکوباتور شیکردار با دمای 28 درجۀ سانتیگراد و هوادهی 150 دوردردقیقه گرماگذاری و سپس با اضافهکردن محیط YMB، جذب نوری آن در طول موج 600 نانومتر روی تعیین میزان MBIC: مقدار 100 میکرولیتر محیطکشت Y در 10 چاهک از میکروپلیت 96 خانه ریخته و 100 میکرولیتر از محلول فاژی مدنظر به چاهک اول اضافه شد؛ مقدار 100 میکرولیتر از چاهک اول به چاهک دوم اضافه و به همین ترتیب، رقتهای سریالی از فاژ مدنظر در چاهکهای میکروپلیت تهیه شد و به هر چاهک، مقدار 100 میکرولیتر سوسپانسیون باکتری منتقل شد (3 تکرار برای هر رقت در نظر گرفته شد). یک ردیف (ردیف چاهک شمارۀ 11) بهعنوان کنترل مثبت حاوی 100 میکرولیتر محیط کشت Y و 100 میکرولیتر سوسپانسیون باکتری و یک ردیف (ردیف چاهک شمارۀ 12) بهعنوان کنترل منفی حاوی 200 میکرولیتر محیط کشت استریل Y (بدون افزودن باکتری) در نظر گرفته شد. میکروپلیت بهمدت 8 روز در انکوباتور با دمای تعیین میزان MBEC: تلقیح میکروپلیت و چاهکهای کنترل مثبت و منفی بر اساس روش MBIC انجام شد؛ با این تفاوت که چاهکهای 1 تا 10 فاقد رقتهای باکتریوفاژ و تنها حاوی محیطکشت Y و سوسپانسیون باکتریایی بودند. سپس میکروپلیت بهمدت 8 روز در دمای 28 درجۀ سانتیگراد گرماگذاری شد. پس از
نتایج در نتیجۀ جداسازی باکتریوفاژها از نمونۀ آب به روش آگار دولایه، فاژهای لیزکنندۀ سویۀ مدنظر تکثیر و پلاکهای فاژی شفاف روی پلیتها دیده شدند تصویر بهدستآمده (شکل 2) از میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) نشان داد این باکتریوفاژ دارای یک سر چندوجهی با ابعاد 61/80×04/84 نانومتر است و دم ندارد. باتوجهبه ویژگیهای مورفولوژیک و اندازۀ فاژ، این فاژ بیشترین شباهت را با باکتریوفاژهای خانوادۀ Tectiviridae دارد و احتمالاً یک تکتیویروس[13] است. نتیجۀ یادشده بر اساس مقایسۀ تصویر با تصاویر باکتریوفاژهای سایر خانوادهها به دست آمده است. شکل 1- پلاکهای ناشی از لیز باکتری X. campestris توسط فاژ موجود در نمونۀ آب رودخانۀ کارون Fig 1 - Plaques caused by the lysis of X. campestris by the phage present in the water sample of the Karun River طیف میزبانی باکتریوفاژ بهمنظور بررسی اثر لیتیک آن روی سویههای دیگر به روش لکهگذاری بررسی شد و نشان داد (شکل 3) باکتریوفاژ میتواند سه سویۀ دیگر از سویههای بیماریزای X. campestris را لیز کند. شکل 2- تصویر میکروسکوپ الکترونی (TEM) فاژ جداسازیشده در مقیاس بار 300 نانومتر. فاژ دارای سر چندوجهی است و دم ندارد و بر این اساس به خانوادۀ Tectiviridae تعلق دارد. Fig 2 - Transmission electron microscopy (TEM) image of isolated phage at 300 nm scale. Phage has a icosahedral head and no tail, So belongs to the Tectiviridae family. شکل 3- لیز سویههای باکتری X. campestris توسط فاژ جداسازیشده به روش لکهگذاری. پلیتهای شمارۀ 1 به سویه X. campestris DSM 1706 تعلق دارند (1a. پلیت حاوی فاژ، 1b. کنترل مثبت)، پلیتهای شمارۀ 2 به سویۀ X. campestris SAM4211 تعلق دارند (2a. پلیت حاوی فاژ، 2b. کنترل مثبت)، پلیتهای شمارۀ 3 به سویۀ X. campestris SAM4209 تعلق دارند (3a. پلیت حاوی فاژ، 3b. کنترل مثبت)، پلیتهای شمارۀ 4 به سویۀ X. campestris SAM4212 تعلق دارند (4a. پلیت حاوی فاژ، 4b. کنترل مثبت) Fig 3 - Lysis of X. campestris bacterial strains by phage isolated using spotting method. Plates #1 belong to X. campestris DSM 1706 (1a. plate containing phage, 1b. positive control), plates #2 belong to X. campestris SAM4211 (2a. plate containing phage, 2b. positive control), plates #1 No. 3 belong to X. campestris SAM4209 (3a. plate containing phage, 3b. positive control), plates No. 4 belong to X. campestris SAM4212 (4a. plate containing phage, 4b. positive control)
در مطالعۀ حاضر، پایداری فاژ در برابر دما و اسیدیتههای مختلف بهعنوان دو عامل اصلی مطالعه شد. نتایج نشان دادند (شکل 4)، فاژ در اسیدیتههای بین 5 تا 9، فعالیت لیتیک مناسبی دارد، عملکرد آن در اسیدیتههای قلیایی بیشتر از 9 کاهش مییابد و در اسیدیتۀ اسیدی 3 غیرفعال میشود و هیچگونه فعالیت لیتیکی در برابر باکتری هدف از خود نشان نمیدهد. بهترین عملکرد و بیشترین فعالیت لیتیک در اسیدیتۀ حدود 7 مشاهده شد. فاژ جداسازیشده پایداری مناسبی در برابر دماهای مختلف آزمایششده نشان داد (شکل 5) و در دمای منفی 20 درجۀ سانتیگراد، بیشترین فعالیت لیتیک را در برابر باکتری X. campestris داشت. فاژ در محدودۀ دمایی بین 4 تا 50 درجۀ سانتیگراد نیز فعالیت لیتیک مناسبی داشت که نتیجۀ خوبی برای استفاده از فاژ در مناطق مختلف است. فعالیت فاژ با افزایش دما و رسیدن به 60 درجۀ سانتیگراد کاهش یافت؛ بهطوری که در دمای 70 درجۀ سانتیگراد، فعالیت آن به صفر رسید و غیرفعال شد.
شکل 4- نمودار اثر اسیدیته بر فاژ جداسازیشده. فاژ در اسیدیتۀ اسیدی 3 غیرفعال و با زیادشدن اسیدیته و رسیدن اسیدیته به 5، فعالیت لیتیک مناسبی از خود نشان میدهد. فاژ تا اسیدیتۀ 9 عملکرد مناسبی دارد و کاهش فعالیت فاژ در اسیدیتۀ 11 مشاهده میشود. Fig 4- Diagram of the effect of acidity on isolated phage. Phage inactive at 3 acidity and show good lytic activity as the acidity increases and reaches 5. The phage has good performance up to 9 acidity, and a decrease in phage activity has been observed at 11 acidity.
شکل 5- نمودار اثر دما بر فاژ جداسازیشده. فاژ در دمای منفی 20 درجۀ سانتیگراد، فعالیت لیتیک زیادی داشت، سپس تا دمای 50 درجۀ سانتیگراد، فعالیت لیتیک مناسبی داشت و در دمای 70 درجۀ سانتیگراد کاملاً غیرفعال شد. Fig 5 - Diagram of the effect of temperature on isolated phage. The phage had a high lytic activity at minus 20°C, then it had a good lytic activity up to 50°C and was completely inactivated at 70°C.
در پژوهش حاضر، نتایج منحنی تکثیر یکمرحلهای (شکل 6) نشان دادند چرخۀ تکثیر فاژ حدود 70 دقیقه طول میکشد. مرحلۀ نهفتگی که نشاندهندۀ زمان لازم برای تکثیر فاژ در باکتری میزبان است، حدود 25 تا 30 دقیقه است و پس از آن، آزادسازی فاژها از سلول میزبان در محدودۀ زمانی 40 دقیقهای رخ میدهد. این منحنی، اندازۀ انفجاری[14] (میانگین تعداد فاژهای تولیدشده توسط سلولهای میزبان آلوده) را نیز نشان داد. فاژها با دورۀ نهفتگی کوتاه و اندازۀ انفجاری زیاد، نامزدهای مناسبی برای فاژتراپی هستند (21).
شکل 6- نمودار، منحنی تکثیر یکمرحلهای فاژ جداسازیشده، چرخۀ تکثیر و burst size فاژ را نشان میدهد. فاژ دارای چرخۀ تکثیر 70 دقیقهای شامل مرحلۀ نهفتگی 25 تا 30 دقیقهای و آزادسازی فاژ 40 دقیقهای است. Fig 6 -The graph of the one-step multiplication curve of the isolated phage, the multiplication cycle and burst size of the phage. The phage has a 70-minute replication cycle, including a 25-30-minute incubation phase and a 40-minute phage release.
معمولاً باکتریها در ماتریکس بیوفیلم محافظتکنندهای متشکل از مواد پلیمری خارجسلولی[15] (EPS) در کنار هم تجمع مییابند و بیوفیلم را تشکیل میدهند که برای بقا و تکمیل چرخۀ بیماریزایی آنها ضروری است (33). عملکرد فاژها در حذف بیوفیلم باکتری ممکن است به دلیل عملکرد آنزیمهای دپلیمراز فاژی در حذف EPS باشد (34). تداخل در تشکیل بیوفیلم میتواند عفونت باکتری بیماریزا را کاهش دهد و کنترل بیماریهای گیاهی را تقویت کند (35). اثر فاژ جداسازیشده در مهار تشکیل بیوفیلم باکتری بررسی شد. جذب نوری (OD) بیوفیلم Xanthomonas (چاهک کنترل مثبت) در طول موج 570 نانومتر برابر 009/1 و OD کنترل منفی که فقط حاوی محیط بدون افزودن باکتری و فاژ بود، برابر 192/0 بود. اثر رقتهای سریالی که از فاژ مدنظر تهیه شده بود، بهترتیب بررسی شد و با OD کنترل مثبت که تشکیل بیوفیلم باکتری را نشان میدهد، مقایسه شد. در رقت 1-10، فاژ OD را تا 475/0 کاهش داد، در رقتهای بعدی تا 3-10 نیز کاهش OD و مهار تشکیل بیوفیلم مشاهده شد؛ پس از آن، افزایش OD مشاهده شد، اما همچنان از OD بیوفیلم باکتری کمتر بود. فاژ در رقت 6-10، OD را تا 3/0 عملکرد فاژ جداسازیشده در حذف بیوفیلم تشکیلشده توسط باکتری به روش سنجش میکروتیترپلیت استاندارد یادشده بررسی و جذب نوری در طول موج 570 نانومتر با دستگاه الایزاریدر خوانده و نمودار مربوطه رسم شد (شکل 7). جذب نوری (OD) بیوفیلم Xanthomonas (چاهک کنترل مثبت) در طول موج 570 نانومتر برابر 585/0 و OD کنترل منفی که فقط حاوی محیط بدون افزودن باکتری و فاژ بود، برابر با 14/0 بود. اثر رقتهای سریالی که از فاژ مدنظر تهیه شده بود، بهترتیب بررسی و با OD کنترل مثبت مقایسه شد. رقتهای 1-10 تا 9-10 فاژ استفاده شد و همۀ رقتها OD را کاهش دادند. فاژ در رقت 6-10، OD را تا 169/0کاهش داد که برابر با کاهش 93 درصدی بود و بیشترین اثر حذف بیوفیلم به این رقت تعلق داشت. در حقیقت، فاژها در رقتهای خاصی بهترین عملکرد را دارند که دلیل این امر میتواند تمایل اتصالی متفاوت فاژها در رقتهای مختلف برای رسپتور خود باشد. در رقتهای اخر، سرعت رشد باکتری باعث میشود نسبت تعداد باکتری به فاژ در واحد زمان بیشتر شود و فاژها قادر به حذف تمام باکتریها نباشند و در رقتهای اولیۀ فاژی میتوان گفت رقابت فاژها برای اتصال به باکتری، باعث ناکارآمدی فاژها میشود (36، 37).
شکل 7- اثر باکتریوفاژ در مهار تشکیل و حذف بیوفیلم. اعداد 1 تا 9 نشاندهنده رقتهای مختلف باکتریوفاژ به ترتیب از 1-10 تا 9-10 هستند. علامت ستاره روی نمودار، مناسبترین رقت فاژ با بیشترین اثر مهارکنندگی بر تشکیل بیوفیلم فاژ و همچنین حذف بیوفیلم را نشان میدهد. Fig 7 -The effect of bacteriophage in inhibiting the formation and removal of biofilm. Numbers 1 to 9 indicate different dilutions of bacteriophage from 1-10 to 10-9 respectively. The asterisk on the graph shows the most appropriate phage dilution with the greatest inhibitory effect on phage biofilm formation and also biofilm removal بحث و نتیجهگیری از نخستین کشف فاژها تاکنون ثابت شده است فاژها بهعنوان راهبرد کنترل زیستی، جایگزینهای امیدوارکننده با مزایای بسیار برای مواد شیمیایی کشاورزی و آنتیبیوتیکها هستند. آنها میتوانند شدت بیماری را کاهش دهند یا از رشد باکتریها در محیطهای مختلف جلوگیری کنند. دو محصول زیستی مبتنی بر فاژ بهطور تجاری و برای کنترل بیماریهای گیاهی ناشی از باکتری Xanthomonas موجود است و انتقال به محصولات تجاری ادامه دارد؛ باتوجهبه این مسئله که نخستین گام برای توسعۀ فاژتراپی، جداسازی فاژ مؤثر بر عامل بیماری گیاهی مدنظر و شناسایی ویژگیهای فاژ جداسازیشده و اطمینان از ایمنی و پایداری آن است، مطالعه در این زمینه اهمیت زیادی دارد. در پژوهش حاضر، فاژ اختصاصی علیه باکتری Xanthomonas، سویۀ X. campestris pv. campestris DSM 1706 از نمونۀ آب رودخانۀ کارون جداسازی شد و اثر لیزکنندگی روی سویههای X. campestris بیماریزای جداشده از مزارع کلم داشت. پس از بررسی مورفولوژی و ویژگیهای فیزیکوشیمیایی و باتوجهبه اینکه در شرایط آزمایشگاهی، فاژ مدنظر در طیف وسیعی از اسیدیته و دما دارای پایداری بود و توانایی لیز باکتری میزبان در شکل سلولی پلانکتونیک و مهار و حذف بیوفیلم باکتری با درصد زیاد را داشت، در کاهش شدت بیماریزایی باکتری و درنتیجه، کنترل بیماریهای گیاهی بسیار مؤثر خواهد بود. باتوجهبه اینکه یکی از راههای اطمینان از مؤثربودن فاژها در ازبینبردن باکتریهای میزبان، شبیهسازی محل اثر آنها است، پیشنهاد میشود در شرایط گلخانهای شبیهسازیشده به شرایط گیاهی طبیعی با آلودگی باکتری Xanthomonas campestris، اثر فاژ جداسازیشدۀ اختصاصی باکتری Xanthomonas campestris در ازبینبردن فرم پلانکتونیک و بیوفیلمی باکتری بررسی شود. در چندین مطالعه در این زمینه نشان داده شده است استفاده از ترکیبات مختلفی که با محلولهای حاوی فاژ مخلوط شدهاند، ماندگاری فاژ در سطوح برگ را افزایش میدهد؛ برای نمونه، در مطالعهای از شیر بدون چربی استفاده و این ترکیب به بهبود کنترل بیماری لکۀ باکتریایی گوجهفرنگی در مقایسه با درمان استاندارد باکتریکشهای شیمیایی منجر شد (36). بر اساس نتایج پژوهش حاضر و پژوهشهای مکرر دیگر در این زمینه، باکتریوفاژهای لیتیک میتوانند عوامل زیستی بالقوه با پتانسیل ضدباکتریایی بسیار مؤثر در کنترل بیماریهای گیاهی و جایگزین عوامل کنترلی کنونی باشند. در راستای این مطالعه پیشنهاد میشود اثر فاژ روی دیگر سویههای بیماریزای باکتری Xanthomonas و همچنین روی بیوفیلم آنها به روشهای مختلف بررسی شود؛ از جمله میتوان از باکتریوفاژهای لیتیک اختصاصی باکتری Xanthomonas بهشکل منفرد یا بهشکل ترکیب با باکتریوفاژهای جداسازیشدۀ دیگر همراه با آنتیبیوتیکها یا عوامل کنترلی دیگر مانند ترکیبات مس در اقدامات پیشگیریکننده و درمانی با عنوان فاژ درمانی علیه عفونتهای باکتریایی استفاده کرد.
سپاسگزاری از یاریرسانی گروه زیستشناسی دانشگاه شهید چمران اهواز و زحمات کارشناسان محترم آزمایشگاه میکروبیولوژی صنعتی دکتر سپهر دانشگاه الزهرا (س) تهران کمال تشکر و قدردانی را داریم.
[1] Gammaproteobacteria [2] Black rot [3] Crucifers [4] V-shaped necrotic lesions [5] Uprooting [6] Burying [7] Burning [8] Multi Drug Resistance [9] AgriPhage [10] OmniLytics [11] Phosphate-Buffered Saline [12] Sodium chloride Magnesium sulphate and gelatin [13] Tectiviridae [14] Burst Size [15] Extracellular Polymeric Substances
| ||
| مراجع | ||
| ||
|
آمار تعداد مشاهده مقاله: 378 تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 127 |
||