نشان پادزیست‌های آموکسی‌سیلین، سفیکسیم و مترونیدازول بر درصد باکتری‌های پایدار در خاک‌های آلوده به فلزهای سنگین

مقدمه

پادزیست‌ها به فراوانی در پزشکی، کشاورزی و دامداری به کار می‌روند (1). افزایش پیوسته پادزیست‌ها در بومسازه‌های خشک و تر باعث آلودگی شیمیایی، پیدایش و گسترش ژن‌های پایداری پادزیستی و باکتری‌های پایدار به پادزیست می‌شود (2). گسترش پایداری پادزیستی تهدیدی جهانی برای بهداشت آدمیان است (3). باکتری‌ها با سازوکارهای گوناگونی می‌توانند در برابر پادزیست‌ها و همزمان در برابر فلزهای سنگین پایدار بمانند (4). با اینکه پایداری پادزیستی می‌تواند به‌طور طبیعی پدید آید (5)، آلاینده‌های زیستی، مانند فلزها (و فلز مانندها) می‌توانند با پیدایش تنش بر باکتری‌ها، گسترش پایداری پادزیستی را از راه گزینش مشترک ژن‌ها و ویژگی‌هایی افزایش دهند که باکتری را هم از پادزیست‌ها و هم از فلزها نگهداری می‌کند (6). بسیاری از پژوهش‌ها نشان داده‌اند آلودگی فلزی با ژن‌های پایداری پادزیستی در زیستگاه‌های آلوده همبستگی مثبت دارد (7و8). در بیشتر پژوهش‌ها آمده است فلزهای سنگین می‌توانند بر فراوانی ژن‌های پایداری پادزیستی در زیستگاه اثر بگذارند (9). بررسی‌ها نشان داده‌اند هم‌گزینی میان پایداری به فلزهای سنگین و پایداری پادزیستی باعث افزایش پایداری پادزیستی در زیستگاه‌های آلوده به هر دو آلاینده می‌شود (10) و این پدیده بیشتر وابسته به این است که ژن‌های پایدار به فلزهای سنگین و ژن‌های پایداری پادزیستی در یک پلاسمید جای دارند (11). یونسی^[1] و همکاران نشان دادند زیادبودن شمار باکتری‌های دارای ژن‌های بتالاکتاماز در کاربری‌های معدن، چراگاه و کشاورزی می‌تواند به‌دلیل کارکردهای دیگر این ژن مانند دفع ترکیبات سمی مثل فلزهای سنگین در زیستگاه آلوده باشد (12). پایداری درهم^[2] نیز سازوکار مهمی برای انگیزش پایداری پادزیستی چندگانه است که در آن پیدایش پایداری به یک پادزیست ویژه باعث پایداری به پادزیست دیگر به شکل همزمان می‌شود (13).

پایداری در برابر فلزهای سنگین گاهی سازوکارهایی همانند با پایداری در برابر پادزیست‌ها را نشان می‌دهند؛ ازاین‌رو، جدای از سازوکار گزینش همزمان پلاسمیدهای پایدار، باید آشکار شود فلزهای سنگین چگونه بر پایداری باکتریایی پیامد دارند؛ به‌ویژه اینکه چه نخشی در پایداری درهم و جهش‌زایی دارند (4).

ژانگ^[3] و همکاران گزارش کردند کشورهای رو به پیشرفت پادزیست‌های دامپزشکی بیشتری در برابر کشورهای پیشرفته به کار می‌برند (14). در ایران اندازه بیشتری از پادزیست‌ها برای پرورش دام به کار می‌رود (15)؛ اما چگونگی و اندازه پادزیست‌ها در خاک‌های تیمارشده با کود، به‌خوبی شناخته نشده است و پیامد آلودگی پادزیست‌ها در خاک‌های گوناگون هنوز روشن نیست. بر پایه بررسی‌های بورکی^[4] و همکاران پادزیست‌های بتالاکتام از پرکاربردترین پادزیست‌ها در جهان‌اند (16)؛ چنانچه آموکسی‌سیلین و مترونیدازول از پادزیست‌های بسیار پرکاربرد در پزشکی هستند. همچنین بتالاکتام‌ها و مترونیدازول دسته‌ای از پادزیست‌ها هستند که در غلظت‌های زیادی در زیستگاه‌ها یافت می‌شوند. در بررسی‌های آنها آمده است اندازه بیشتر مترونیدازول و آموکسی‌سیلین می‌تواند با فشار گزینشی باعث فراوان‌شدن ژن‌های پایداری به پادزیست‌ها شود که در خاک‌های آلوده به فلزهای سنگین، پاک‌کننده‌ها و شوینده، این پدیده می‌تواند بیشتر رخ دهد. این پژوهش با هدف بررسی دگرگونی درصد باکتری‌های پایدار خاک در رویارویی با غلظت‌های گوناگون پادزیست‌ها در خاک‌های با اندازه گوناگونی از فلزهای سنگین انجام شد. گمان پژوهش بر این بود که پاسخ گونه‌های سازگارشده به زیستگاه آلوده به فلزها در برابر پادزیست‌های افزوده‌شده به خاک یکسان نیست و تنش همزمان آلودگی فلز و پادزیست باعث گزینش گروه‌های ویژه‌ای از باکتری‌ها می‌شود. یافته‌های این پژوهش بنیادی، بینش نوینی درباره رفتار و پاسخ باکتری‌های خاک‌های آلوده به فلزهای سنگین در برابر پادزیست‌های افزوده‌شده به زیستگاهشان فراهم می‌کند.

مواد و روش‌ها

آماده‌سازی خاک، پادزیست‌ و تیمارها: برای انجام این پژوهش به خاک‌هایی با اندازه‌های گوناگون فلزهای سنگین نیاز بود. خاک ناآلوده کشاورزی از کشتزار پژوهشی دانشکده کشاورزی دانشگاه بوعلی سینا همدان برداشت شد و خاک‌های آلوده به فلزهای سنگین از معدن سرب و روی آهنگران و از چراگاه پیرامون معدن در 23 کیلومتری شرق شهرستان ملایر در جنوب شرقی استان همدان به‌صورت مرکب در سه تکرار نمونه‌برداری شدند. غلظت فلزهای سنگین در خاک‌ به روش هضم با اسیدنیتریک با دستگاه جذب اتمی واریان 220اف‌اس اندازه‌گیری شد (17).

سه پادزیست پرکاربرد آموکسی‌سیلین (بتالاکتام)، سفیکسیم (سفالوسپورین) و مترونیدازول (نیتروایمیدازول) از داروخانه همدان خریداری شدند. در آغاز قرص و محتوی درون کپسول (کپسول آموکسی‌سیلین (500 میلی‌گرم)، قرص سفیکسیم (400 میلی‌گرم) و قرص مترونیدازول (500 میلی‌گرم)) برای هر سه پادزیست وزن شدند و وزن هم‌سنگ ماده ناب پادزیست به دست آمد. پس از آن، وزن مورد نیاز برای آماده‌سازی محلول‌های‌ به غلظت 100 و 200 میلی‌گرم پادزیست برای کیلوگرم خاک خشک به کار رفت.

محلول‌های آبی سه پادزیست آموکسی‌سیلین، سفیکسیم و مترونیدازول به‌طور جداگانه به وزن معادل خاک خشک افزوده شد و به‌خوبی به‌هم زده شد. سپس آب مقطر سترون به نمونه‌های خاک افزوده شد تا نم آن نزدیک گنجایش کشاورزی شود. نمونه‌های خاک تیمارشده در تاریکی و در دمای آزمایشگاه (نزدیک 25 درجه سانتی‌گراد) نگهداری شدند. سپس در چهار زمان گرماگذاری صفر (بدون گرماگذاری)، 1، 3 و 7 روز فراوانی باکتری‌ها در کشتگاه‌های نوترینت‌آگار بدون پادزیست و نوترینت‌آگار دارای 5 پادزیست‌ آموکسی‌سیلین، سفیکسیم، جنتاماسین، مترونیدازول و تتراسایکلین به‌صورت زیر شمارش شد. میانگین شمار باکتری‌ها در خاک‌های تیمار شده و نشده به‌طور جداگانه در زمان های صفر، 1، 3 و 7 روز برای گرماگذاری کوتاه‌مدت (7 روزه) برآورد و درصد باکتری‌های پایدار آنالیز آماری شد.

شمارش باکتری‌های خاک: برای آماده‌سازی سوسپانسیون از خاک‌ها، یک گرم از خاک در لوله آزمایش دارای 9 میلی‌لیتر آب مقطر سترون ریخته شد و سری‌های رقت تا رقت‌های مورد نیاز آماده شدند. از هر رقت به مقدار 100 میکرولیتر به کمک سرسمپلر سترون برداشته شد و بر کشتگاه بدون پادزیست و دارای پادزیست ریخته و با کمک پی‌پت پاستور آماده‌شده سترون در کنار شعله پخش شد. غلظت پادزیست‌های افزوده‌شده به کشتگاه‌ها (16 میکروگرم آموکسی‌سیلین، 2 میکروگرم سفیکسیم، 8 میکروگرم جنتامایسین، 16 میکروگرم مترونیدازول و 8 میکروگرم تتراسایکلین در میلی‌لیتر نوترینت‌آگار) بر پایه آزمون پایداری پادزیستی پذیرفته‌شده در مؤسسه استانداردهای بالینی و آزمایشگاهی^[5] گزینش شد (18). از هر خاک شاهد و تیمارشده با پادزیست‌ها سه تکرار در کشتگاه بدون و دارای هریک از پادزیست‌های یادشده مایه‌زنی شد. سپس پتری‌دیش‌ها به‌طور وارونه در گرم‌خانه در دمای 2/28 درجه سانتی‌گراد گذاشته شدند. در این بررسی بهترین رقت‌ها برای شمارش ریزجاندارها در خاک با سه تکرار در هر زمان به دست آمد. فراوانی باکتری‌ها به روش کلنی‌شماری در کشتگاه پایه نوترینت‌آگار شمارش شد که دربردارندة همه نیازهای غذایی رشد برای بیشتر باکتری‌ها است (19و20). درصد باکتری‌های پایدار خاک در هر تیمار از بخش‌کردن شمار کلنی‌ها در کشتگاه‌های دارای پادزیست به شمار کلنی‌ها در کشتگاه‌ بدون پادزیست به دست آمد.

تجزیه و تحلیل آماری: این پژوهش به‌صورت چهار آزمایش جداگانه از خاک تیمارنشده و خاک‌های تیمارشده به سه پادزیست آموکسی‌سیلین، سفیکسیم و مترونیدازول انجام شد. هر آزمایش به فرم فاکتوریل با سه فاکتور: سه گونه خاک (ناآلوده کشاورزی، آلوده معدن و چراگاه نزدیک معدن)، دو غلظت پادزیست به اندازه‌های 100 و 200 میلی‌گرم در کیلوگرم خاک خشک و پنج گونه پادزیست به‌کاررفته در کشتگاه نوترینت‌آگار در گرماگذاری کوتاه‌مدت (7 روزه) با طرح کامل تصادفی در سه تکرار انجام شد. نمونه‌برداری در چهار زمان (صفر، 1، 3 و 7 روز) انجام گرفت و سپس میانگین آنها برای هر خاک پردازش و آنالیز شد. برای پردازش داده‌های هر آزمایش و رسم نمودارها از نرم‌افزار اکسل^[6] 2010 و برای آزمون آماری از نرم‌افزار اس‌پی‌اس‌اس^[7] 20 بهره‌گیری شده است. نرمال‌بودن پراکنش داده‌ها با آزمون شاپیرو - ویلک بررسی شد. پس از انجام استانداردسازی با نمره زد^[8]، پیامد کاربرد هریک از تیمارها و برهمکنش آنها با انجام تجزیه واریانس ارزیابی شد. آزمون میانگین هریک از ویژگی‌های یادشده در تیمارهای به‌کاررفته با روش توکی در پایه پنج درصد انجام شد.

نتایج.

.فراوانی و درصد باکتری‌های پایدار در خاک‌های تیمارنشده: تجزیه واریانس لگاریتم فراوانی باکتری‌های شمارش‌شده در خاک‌ها نشان داد پیامد ساده گونه خاک بر شمار باکتری‌ها چشمگیر بود (P<0.01). آزمون میانگین لگاریتم فراوانی باکتری‌ها در خاک‌ها در شکل 1 آمده است. همان‌گونه که دیده می‌شود، خاک کشاورزی بیشترین لگاریتم فراوانی را دارد که ناهمانندی چشمگیری با خاک چراگاه ندارد؛ اما در هر دو خاک به‌طور چشمگیری بیشتر از خاک معدن بود. یادآوری می‌شود ویژگی‌های این خاک‌ها بسیار نزدیک به هم بود؛ اما غلظت فلزهای سنگین آنها بسیار ناهمانند بود. آهن در خاک کشاورزی، چراگاه و معدن به‌ترتیب 22691، 20708 و 73110 میلی‌گرم در کیلوگرم، سرب در آنها به‌ترتیب 20/33، 79/67 و 66/9749 میلی‌گرم در کیلوگرم، روی به‌ترتیب 33/58، 16/89 و 20/3839 میلی‌گرم در کیلوگرم، کادمیوم به‌ترتیب 75/0، 54/1 و 53/37 میلی‌گرم در کیلوگرم، مس به‌ترتیب 45/16، 70/18 و 58/89 میلی‌گرم در کیلوگرم، منگنز به‌ترتیب 50/387، 50/837 و 66/9816 میلی‌گرم در کیلوگرم و منیزیم به‌ترتیب 08/6052، 67/11166 و 32/4697 میلی‌گرم در کیلوگرم بود؛ بنابراین، به‌جز منیزیم، بیشترین مقدار فلزها در خاک نمونه‌برداری‌شده از معدن (آهنگران) دیده شد. ترتیب آلودگی خاک‌ها به گونة خاک معدن بیشتر یا نزدیک به خاک چراگاه و این بیشتر از خاک کشاورزی بود. مقدار زیاد فلزهای سنگین در خاک چراگاه می‌تواند وابسته به ساختار مواد مادری خاک باشد که در نزدیکی معدن است؛ اما فراوانی باکتری‌ها در آن با خاک کشاورزی ناهمانندی چشمگیری ندارد (شکل 1).

شکل 1- آزمون میانگین لگاریتم فراوانی باکتری‌ها در خاک‌های آلوده و ناآلوده به فلزهای سنگین. میانگین‌های دارای وات‌های یکسان ناهمانندی چشمگیری در پایه آماری پنج درصد ندارند.

Fig. 1- Mean test of log bacterial population in the heavy metal contaminated and uncontaminated soils. Means with the same letter are not significantly different from each other (P>0.05).

تجزیه واریانس داده‌های درصد باکتری‌های پایدار در خاک‌های تیمارنشده نشان داد پیامدهای ساده گونه خاک و گونه پادزیست افزوده‌شده به کشتگاه و نیز پیامد دوگانه آنها بر درصد باکتری‌های پایدار خاک چشمگیر بود (P<0.01). آزمون میانگین درصد باکتری‌های پایدار در خاک‌های تیمارنشده در شکل 2 آورده شده است. همان‌گونه که دیده می‌شود باکتری‌های خاک کشاورزی بیشترین درصد پایداری را در برابر مترونیدازول نشان دادند. در برابر آن در خاک معدن، بیشترین درصد باکتری‌های پایدار در برابر سفیکسیم دیده شد. به هر گونه 100 درصد باکتری‌های خاک چراگاه در برابر چهار پادزیست آموکسی‌سیلین، سفیکسیم، جنتامایسین و مترونیدازول از خود پایداری نشان دادند؛ بنابراین، خاک چراگاه هم زیستگاه خوبی برای باکتری‌ها فراهم کرده و هم فراوانی باکتری‌های پایدار آن زیاد است. در خاک کشاورزی با اینکه فراوانی باکتری‌ها زیاد بود، درصد باکتری‌های پایدار آن در برابر سه پادزیست سفیکسیم، جنتامایسین و تتراسایکلین کمتر از دو خاک آلوده به فلز چراگاه و معدن بود. بیشترین کاهش فراوانی و پاسخ‌دهی را باکتری‌های خاک در برابر پادزیست تتراسایکلین داشتند و در این میان باکتری‌های خاک معدن در برابر این پادزیست پایداری بیشتری نسبت به دو خاک دیگر داشتند. این یافته‌ها نشان‌دهندة پایداری بهتر باکتری‌های خاک‌های آلوده به فلزهای سنگین در برابر پادزیست‌ها است. به هر حال، درصد باکتری‌های پایدار در برابر دو پادزیست مترونیدازول و آموکسی‌سیلین در خاک کشاورزی بیشتر از خاک معدن بود که از دیدگاه آماری چشمگیر نبود.

شکل 2- آزمون میانگین درصد باکتری‌های پایدار در خاک‌ها در برهمکنش دوگانه گونه خاک و گونه پادزیست افزوده شده به کشتگاه. میانگین‌های دارای وات‌های یکسان ناهمانندی چشمگیری در پایه آماری پنج درصد ندارند.

Fig. 2- Mean test of the percentage of resistant bacteria in soils in the interaction of soil and antibiotic added to the culture medium. Means with the same letter are not significantly different from each other (P>0.05).

نشان کاربرد آموکسی‌سیلین در خاک: تجزیه واریانس درصد باکتری‌های پایدار در خاک‌های تیمارشده با آموکسی‌سیلین در کشتگاه‌های دارای پادزیست نشان داد پیامدهای ساده گونه خاک، گونه پادزیست افزوده‌شده به کشتگاه و پیامد دوگانه آنها بر درصد باکتری‌های پایدار خاک چشمگیر بود (P<0.01). آزمون میانگین درصد باکتری‌های پایدار در خاک‌های تیمارشده با آموکسی‌سیلین در شکل 3 آورده شده است. همان‌گونه که دیده می‌شود در هر دو غلظت 100 و 200 آموکسی‌سیلین نزدیک به 100 درصد باکتری‌های دو خاک کشاورزی و چراگاه در برابر آموکسی‌سیلین، سفیکسیم و مترونیدازول از خود پایداری نشان دادند. اگرچه در خاک معدن درصد باکتری‌های پایدار کمتر بود، افزودن آموکسی‌سیلین به‌ویژه در غلظت کمتر (100 میلی‌گرم در کیلوگرم خاک) درصد باکتری‌های پایدار خاک را افزایش داد. به‌طور کلی در خاک‌های تیمارشده با آموکسی‌سیلین درصد باکتری‌های پایدار در برابر جنتامایسین و به‌ویژه تتراسایکلین پایین (20 درصد و حتی کمتر) بود. در خاک معدن پایداری در برابر هر پنج پادزیست کشتگاه با افزایش غلظت آموکسی‌سیلین افزوده‌شده به خاک، کاهش یافت؛ اما در خاک چراگاه و کشاورزی این پایداری به‌جز تتراسایکین افزایش یافت.

شکل 3- آزمون میانگین درصد باکتری‌های پایدار در خاک‌های تیمارشده با آموکسی‌سیلین در برهمکنش دوگانه گونه خاک و گونه پادزیست افزوده‌شده به کشتگاه. میانگین‌های دارای وات‌های یکسان ناهمانندی چشمگیری در پایه آماری پنج درصد ندارند.

Fig. 3- Mean test of the percentage of resistant bacteria in soils treated with amoxicillin in the interaction of soil and antibiotic added to the culture medium. Means with the same letter are not significantly different from each other (P>0.05).

نشان کاربرد سفیکسیم در خاک: تجزیه واریانس درصد باکتری‌های پایدار در خاک‌های تیمارشده با سفیکسیم در کشتگاه‌های دارای پادزیست نشان داد پیامدهای ساده گونه خاک، گونه پادزیست افزوده‌شده به کشتگاه و پیامد دوگانه آنها بر درصد باکتری‌های پایدار خاک چشمگیر بود (P<0.01). آزمون میانگین درصد باکتری‌های پایدار در خاک‌های تیمارشده با سفیکسیم در شکل 4 آورده شده است. همان‌گونه که دیده می‌شود 100 درصد باکتری‌های دو خاک کشاورزی تیمارشده با غلظت 200 سفیکسیم و چراگاه تیمارشده با غلظت 100 سفیکسیم در برابر چهار پادزیست آموکسی‌سیلین، سفیکسیم، جنتامایسین و مترونیدازول افزوده‌شده به کشتگاه پایداری نشان دادند و در خاک چراگاه دارای غلظت 200 سفیکسیم این پایداری 100 درصد در برابر سفیکسیم، جنتامایسین و مترونیدازول کشتگاه دیده شد. افزودن 100 میلی‌گرم سفیکسیم به خاک معدن نیز درصد باکتری‌های پایدار در برابر پادزیست‌ها را افزایش داد؛ اما در افزودن 200 میلی‌گرم سفیکسیم درصد باکتری‌های پایدار خاک معدن به‌طور نمایانی کاهش یافت که این کاهش برای دو پادزیست جنتامایسین و تتراسایکلین از دیدگاه آماری چشمگیر نبود. در خاک‌های تیمارشده با سفیکسیم نیز باکتری‌های خاک معدن در برابر تتراسایکلین پایداری بیشتری نسبت به دو خاک دیگر از خود نشان دادند که این پایداری با افزایش غلظت سفیکسیم افزوده‌شده به خاک کاهش یافت.

شکل 4- آزمون میانگین درصد باکتری‌های پایدار در خاک‌های تیمارشده با سفیکسیم در برهمکنش دوگانه گونه خاک و گونه پادزیست افزوده‌شده به کشتگاه. میانگین‌های دارای وات‌های یکسان ناهمانندی چشمگیری در پایه آماری پنج درصد ندارند.

Fig. 4- Mean test of the percentage of resistant bacteria in soils treated with cefixime in the interaction of soil and antibiotic added to the culture medium. Means with the same letter are not significantly different from each other (P>0.05).

نشان کاربرد مترونیدازول در خاک: تجزیه واریانس درصد باکتری‌های پایدار در خاک‌های تیمارشده با مترونیدازول نشان داد پیامدهای ساده گونه خاک، گونه پادزیست افزوده‌شده به کشتگاه و پیامد دوگانه آنها بر درصد باکتری‌های پایدار خاک چشمگیر بود (P<0.01). آزمون میانگین درصد باکتری‌های پایدار در خاک‌های تیمارشده با مترونیدازول در شکل 5 آورده شده است. همان‌گونه که دیده می‌شود نزدیک به 100 درصد باکتری‌های هر سه خاک کشاورزی، معدن و چراگاه (دارای غلظت 100 میلی‌گرم مترونیدازول در کیلوگرم) در کشتگاه‌های دارای آموکسی‌سیلین، سفیکسیم، جنتامایسین و مترونیدازول پایدار بودند که این پایداری‌ها در خاک چراگاه با غلظت 200 مترونیدازول نیز دیده شد. بار دیگر توان باکتری‌های چراگاه در برابر پادزیست‌ها نمایان است. درصد باکتری‌های خاک معدن در غلظت 200 مترونیدازول در برابر پادزیست‌ها پایداری کمتری از خود نشان دادند؛ اما این پاسخ در خاک کشاورزی نمایان‌تر بود. افزایش غلظت این پادزیست در خاک باعث کاهش نمایانی در باکتری‌های پایدار خاک کشاورزی شد. به هر حال، در خاک‌های تیمارشده با مترونیدازول، بیشترین پاسخ‌دهی باکتری‌های سه خاک معدن، کشاورزی و چراگاه در برابر تتراسایکلین دیده شد؛ بنابراین، در خاک کشاورزی تیمارشده با غلظت 200 مترونیدازول، درصد پایداری باکتری‌های خاک در برابر هر پنج پادزیست کشتگاه کاهش چشمگیری در برابر غلظت 100 مترونیدازول افزوده‌شده به خاک نشان داد. در خاک معدن نیز با افزایش غلظت مترونیدازول افزوده‌شده به خاک از 100 به 200 میلی‌گرم در کیلوگرم خاک، پاسخ‌دهی باکتری‌های خاک به تتراسایکلین کشتگاه افزایش یافت و درصد پایداری پادزیستی کاهش چشمگیری نشان داد.

شکل 5- آزمون میانگین درصد باکتری‌های پایدار در خاک‌های تیمارشده با مترونیدازول در برهمکنش دوگانه گونه خاک و گونه پادزیست افزوده‌شده به کشتگاه. میانگین‌های دارای وات‌های یکسان ناهمانندی چشمگیری در پایه آماری پنج درصد ندارند.

Fig. 5- Mean test of the percentage of resistant bacteria in soils treated with metronidazole in the interaction of soil and antibiotic added to the culture medium. Means with the same letter are not significantly different from each other (P>0.05).

بحث و نتیجه‌گیری.

.فراوانی و درصد پایداری پادزیستی ریزجانداران در خاک‌های گواه: از میان سه خاک آزمایش، خاک معدن کمترین فراوانی ریزجانداران را داشت. سنجانی^[ix] و یونسی بیان کردند این می‌تواند به شدت آلودگی بیشتر خاک معدن یا زیستگاه ناشایست خاک برای رشد باکتری‌ها وابسته باشد (21). در پژوهش سنجانی و یونسی همبستگی مثبت چشمگیری میان غلظت‌ فلزهای سنگین روی، کادمیوم، سرب و مس و درصد باکتری‌های پایدار به چندین پادزیست شناسایی شد. آنها گزارش کردند با توجه به اینکه ژن‌های پایدار به فلزهای سنگین و پادزیست‌ها روی یک عنصر ژنتیکی هستند، آلودگی فلزهای سنگین می‌تواند باعث گزینش ژن‌های پایداری پادزیستی باکتری‌ها در زیستگاه‌های آلوده شود. از سوی دیگر گزارش کردند خاک‌های معدن دارای اندازه بیشتری از آلودگی فلزهای سنگین در برابر خاک‌های کشاورزی و چراگاه بودند؛ اما بیشتر باکتری‌های جداشده از خاک‌های کشاورزی به چند پادزیست (بیش از سه پادزیست) پایدار بودند که این می‌تواند وابسته به فراوانی بیشتر و گوناگونی باکتری‌ها در خاک کشاورزی باشد که شانس جابه‌جایی ژن‌های پایداری پادزیستی را افزایش می‌دهند (21). همچنین گزارش شده است در خاک‌های کشاورزی کودهای دامی تازه، لجن فاضلاب، آب‌های سطحی و گیاهان می‌توانند باعث گسترش ژن‌های پایداری و باکتری‌های پایدار شوند (22). یافته‌های سنجانی و یونسی نشان دادند خاک‌های کشاورزی انباره بزرگی برای زیست باکتری‌های پایدار است که می‌توانند به زیستگاه‌های دیگر برسند (21). در این پژوهش نیز دیده شد درصد باکتری‌های پایدار در خاک‌های آلوده به فلزها به‌ویژه در خاک چراگاه بیشتر از خاک کشاورزی است. درصد باکتری‌های پایدار در برابر آموکسی‌سیلین و مترونیدازول در خاک کشاورزی بیشتر از خاک معدن بود؛ اما هیچ‌گاه به اندازه آنها در خاک چراگاه نرسید.

نشان کاربرد آموکسی‌سیلین در خاک: در خاک معدن درصد باکتری‌های پایدار کمتر بود؛ اما افزودن آموکسی‌سیلین به‌ویژه در غلظت کمتر (100 میلی‌گرم در کیلوگرم خاک) درصد باکتری‌های پایدار خاک را افزایش داد و نزدیک به 100 درصد باکتری‌های دو خاک کشاورزی و چراگاه با افزودن هر دو غلظت 100 و 200 آموکسی‌سیلین در برابر آموکسی‌سیلین، سفیکسیم و مترونیدازول از خود پایداری نشان دادند. کائو^[x] و همکاران گزارش کردند در پی افزودن پادزیست‌ها پایداری باکتری‌های خاک به گوناگونی آنها در خاک وابسته است (23). آمیزه‌های آلی و پادزیست‌ها با فرایندهای فیزیکی، شیمیایی و بیوشیمیایی در خاک، جذب، فروزینه و دگرگون می‌شوند (24)؛ ازاین‌رو، نشان‌ آنها بر ریزجاندارهای خاک می‌تواند با گذشت زمان دگرگون شود که این بستگی به ویژگی‌های پادزیست و خاک یا آزمایش به‌کاررفته دارد. به‌طور کلی در خاک‌های تیمارشده با آموکسی‌سیلین درصد باکتری‌های پایدار در برابر جنتامایسین و به‌ویژه تتراسایکلین پایین (20 درصد و حتی کمتر) بود. گوش و لاپارا^[xi] در پژوهشی با کاربرد 20 میلی‌گرم کلرتتراسایکلین در لیتر کشتگاه و سپس بررسی پایداری پادزیستی دریافتند ناهمانندی آماری چشمگیری میان پایداری باکتریایی به کلرتتراسایکلین در میان جایگاه‌های نمونه‌برداری (پرورشگاه خوک، پرورشگاه گاو‌های شیری و سه جایگاه غیرکشاورزی) بود (25). به هر حال، در روش‌های شناسایی بر پایه کشت تنها بخش کوچکی (نزدیک 1 درصد از باکتری‌های خاک) از همه باکتری‌ها بررسی می‌شود (26) و این رویکرد تنها بخش کوچکی از باکتری‌های پایدار به کلرتتراسایکلین را در خاک‌ها آشکار می‌کند؛ اما ژانگ و همکاران گزارش کردند از میان 49 پادزیست افزوده‌شده به خاک‌های کشاورزی از راه کودهای آلوده، تتراسایکلین‌ها غلظت به‌نسبت بالایی داشتند و ژن‌های پایدار به تتراسایکلین در کلاس سوم فراوانی پس از سولفونامیدها و آمینوگلیکوزیدها بودند (14). در برابر یافته‌های این پژوهش و گزارش­های یادشده، گوش و لاپارا گزارش کردند افزایش پایداری پادزیستی ریزجانداران به کاربرد پادزیست در زیستگاه آنها وابسته نیست و سه فاکتور شمار باکتری‌های پایدار به پادزیست در کود، ژن‌های پایداری این باکتری‌ها و آسانی جابه‌جایی ژن‌های کدکننده پایداری میان سویه‌های گوناگون باکتری در زیستگاه می‌توانند در ارزیابی پایداری پادزیستی مهم‌تر باشند (25).

نشان کاربرد سفیکسیم در خاک: با افزودن سفیکسیم (هر دو غلظت 100 و 200) به خاک کشاورزی نیز کمترین پایداری باکتری‌ها در برابر تتراسایکلین دیده شد. پایداری باکتری‌های خاک کشاورزی در برابر چهار پادزیست دیگر افزوده‌شده به کشتگاه ناهمانندی چشمگیری نداشت. همچنین، با افزایش غلظت سفیکسیم خاک به 200 میلی‌گرم، پایداری در برابر چهار پادزیست آموکسی‌سیلین، سفیکسیم، جنتامایسین و مترونیدازول به نزدیک صد درصد رسید. در خاک معدن تیمارشده با سفیکسیم (غلظت 100 میلی‌گرم در کیلوگرم) پایداری در برابر پنج پادزیست افزوده‌شده به کشتگاه ناهمانندی چشمگیری نداشت؛ اما با افزایش غلظت سفیکسیم خاک به 200 میلی‌گرم در کیلوگرم، پایداری باکتری‌ها کاهش یافت که این کاهش برای سه پادزیست کشتگاه (آموکسی‌سیلین، سفیکسیم و مترونیدازول) چشمگیر بود. به عبارت دیگر، افزایش غلظت سفیکسیم خاک باعث کاهش پایداری باکتری‌های خاک معدن شد. در خاک چراگاه تیمارشده با سفیکسیم، پاسخ باکتری‌های خاک در برابر پادزیست‌های افزوده‌شده به کشتگاه در هر دو غلظت سفیکسیم همانند بود و مانند خاک کشاورزی کمترین پایداری در برابر تتراسایکلین دیده شد. در برابر آنها باکتری‌های خاک معدن، به‌ویژه در غلظت 100 سفیکسیم، پایداری بالایی در برابر تتراسایکلین داشتند.

در بررسی‌های لیو^[xii] و همکاران، تتراسایکلین ورمی‌کمپوست‌ها به چهار گونه محلول در آب > قابل تبادل > پیوندی بود که هرچه اندازه پادزیست محلول در آب ورمی‌کمپوست بیشتر باشد، آسیب آن بیشتر است. براساس این، زیست فراهمی فلزهای سنگین و پادزیست‌ها در ورمی‌کمپوست با فراوانی ژن‌های پایدار به پادزیست و ژن‌های پایدار به فلزهای سنگین، همبستگی مثبت و چشمگیری داشت. همچنین، میان ژن‌های پایدار به پادزیست و ژن‌های پایدار به فلزهای سنگین همبستگی مثبت چشمگیری یافت شد. بهترین همبستگی یافت‌شده میان تتراسایکلین محلول در آب خاک و فراوانی ژن‌های پایدار به تتراسایکلین دیده شد که این بخش از تتراسایکلین فشار گزینشی نیرومندی را بر باکتری‌های بومی ورمی‌کمپوست دارد. همچنین، بیشترین همبستگی میان czcR (گروه ژن‌های پایدار به فلزهای سنگین کادمیوم و روی) و tetS (گروه ژن‌های پایدار به تتراسایکلین) یافت شد (27).

یادآوری می‌شود پایداری پادزیستی باکتری‌ها بیشتر به کمک پمپ‌های برون‌ده پادزیست از یاخته، نگهداری یا دگرش هدف پادزیست و ناکاراشدن آنزیمی پادزیست در یاخته انجام می‌شود؛ به‌ویژه در برابر پادزیست‌های گروه تتراسایکلین، سازوکار‌های برون‌ده و نگهداری ریبوزومی و همچنین فروزینگی آنزیمی پادزیست کارایی دارد (28). در پژوهش لیو و همکاران، شش ژن پایدار به تتراسایکلین از دو گروه tetA و tetC برای پمپ برون‌ده پادزیست و گروه‌های tetM، tetO، tetS و tetW برای نگهداری ریبوزومی شناسایی شدند. گروه‌های tetA و tetC دو پروتئین پمپی برون‌ده را رمزگذاری می‌کنند که تتراسایکلین را از یاخته‌های باکتری به بیرون یا به سیتوپلاسم پیرامونی (پلاسموژل) می‌راند تا غلظت پادزیست را برای یاخته و ریبوزوم‌ها کاهش دهد. گروه‌های tetM، tetO، tetS و tetW پروتئین‌های نگهدارندة ریبوزومی را رمزگذاری می‌کنند که از کار تتراسایکلین در سیتوپلاسم جلوگیری می‌کنند (27). به هر حال، در بررسی‌های لیو و همکاران آمده است پیامد پادزیست‌ها و فلزهای سنگین می‌تواند به گونه هم­افزا و به شیوه‌های پایداری همکردار^[xiii]، پایداری درهم، هم‌تنظیمی^[xiv] و انگیزش ساخت بیوفیلم^[xv] رخ دهد (27و29). بر پایه پژوهش آنها در زیستگاهی که پادزیست‌ها و فلزهای سنگین همزمان باشند، باکتری‌ها هم ژن‌های پایدار به پادزیست و هم ژن‌های پایدار به فلز سنگین را به دست می‌آورند. پژوهش‌های پیشین نشان داده‌اند ژن‌های پایدار به پادزیست و ژن‌های پایدار به فلزهای سنگین روی یک اینتگرون یا پلاسمید یافت می‌شوند که باعث پایداری همزمان به آنها می‌شود.

نشان کاربرد مترونیدازول در خاک: در خاک کشاورزی تیمارشده با مترونیدازول، کمترین پایداری در برابر تتراسایکلین دیده شد و با افزایش غلظت مترونیدازول از 100 به 200 میلی‌گرم در کیلوگرم خاک این پایداری در برابر پادزیست‌های افزوده‌شده به کشتگاه کاهش چشمگیری یافت. باکتری‌های این خاک در برابر چهار پادزیست آموکسی‌سیلین، سفیکسیم، جنتامایسین و مترونیدازول در غلظت 100 مترونیدازول پایداری صد درصدی داشتند. در برابر آن، باکتری‌های خاک معدن تیمارشده با مترونیدازول در غلظت 100 میلی‌گرم در کیلوگرم، در برابر هر پنج پادزیست پایدار بودند؛ اما با افزایش غلظت مترونیدازول به 200 میلی‌گرم در کیلوگرم پاسخ باکتری‌ها به چهار پادزیست آموکسی‌سیلین، سفیکسیم، جنتامایسین و مترونیدازول همچنان پایدار بود؛ اما در برابر تتراسایکلین کاهش چشمگیری داشتند. در خاک چراگاه تیمارشده با مترونیدازول (هر دو غلظت 100 و 200) نیز کمترین پایداری در برابر تتراسایکلین دیده شد.

سونگ^[xvi] و همکاران، افزایشی در پایداری باکتریایی خاک به پادزیست‌های تتراسایکلین در غلظت‌های پایین گزارش نکردند (30)؛ اما در غلظت‌های بالاتر (1000 میلی‌گرم پادزیست در کیلوگرم خاک) پس از یک هفته گرماگذاری افزایش بردباری جامعه باکتریایی گزارش شد (31). در این گزارش آمده است افزایش بردباری به پادزیست‌های تتراسایکلین در غلظت‌های پایین‌تر (100 میلی‌گرم در کیلوگرم) نیز می‌تواند رخ دهد.

سانتاس میگل^[xvii] و همکاران، افزایش پایداری باکتریایی در پاسخ به آلودگی خاک با پادزیست‌های تتراسایکلین را وابسته به سازگاری‌های فیزیولوژیکی یا ژنتیکی گزارش کردند (32). این سازگاری به همان‌گونه است که برای آلودگی فلزهای سنگین پیشنهاد شده است (33). این سازگاری‌ها می‌توانند از راه‌های 1) کشتن گونه‌های ناپایدار با نشان زهری پادزیست، 2) گزینش گونه‌های پایدار با توانایی‌های رقابتی گوناگون برای رشد در کنار پادزیست‌ها، 3) پاسخ‌های فیزیولوژیکی یا رفتاری در جمعیت‌های یاخته‌ای یگانه و فراوان‌شدن آنها و 4) جهش یا پیدایش پایداری پادزیستی از راه جابه‌جایی افقی ژن باشند (34). برای پادزیست‌های تتراسایکلین، سازوکار‌های نخست کنار گذاشته می‌شوند؛ زیرا مولکول‌های گروه تتراسایکلین که پادزیست‌های باکتریواستاتیک هستند (35)، می‌توانند رشد باکتری‌ها را مهار کنند؛ اما آنها را از میان نمی‌برند.

در این پژوهش، درصد باکتری‌های پایدار در خاک کشاورزی در برابر آموکسی‌سیلین و مترونیدازول بیشتر از خاک معدن بود؛ اما هیچ‌گاه به اندازه آنها در خاک چراگاه نرسید و هم‌راستا با پژوهش‌های پیشین، درصد باکتری‌های پایدار در خاک‌های آلوده به فلزها به‌ویژه در خاک چراگاه بیشتر از خاک کشاورزی بود.

افزودن پادزیست‌های آموکسی‌سیلین، سفیکسیم و مترونیدازول به هریک از خاک‌ها به‌ویژه در غلظت 100 میلی‌گرم در کیلوگرم باعث افزایش چشمگیر درصد باکتری‌های پایدار در برابر پنج پادزیست به‌کاررفته در کشتگاه شد. این پایداری به‌ویژه در تیمارهای سفیکسیم و مترونیدازول با افزایش غلظت پادزیست‌ها به 200 میلی‌گرم در کیلوگرم خاک کاهش چشمگیری یافت و باکتری‌های خاک معدن در تیمار سفیکسیم خاک پاسخ ویژه‌تری داشتند. باکتری‌های خاک چراگاه همانند خاک تیمارنشده در هر دو غلظت از سه تیمار آموکسی‌سیلین، سفیکسیم و مترونیدازول خاک، به‌جز تتراسایکلین، پایداری بالایی در برابر پادزیست‌های افزوده‌شده به کشتگاه داشتند.

به‌طور کلی، الگوی پایداری باکتری‌های خاک‌ها در برابر پادزیست‌ها به گونة آموکسی‌سیلین> سفیکسیم> مترونیدازول> جنتامایسین بود و در برابر آنها تتراسایکلین پایداری صد درصدی از باکتری‌ها دیده نشد؛ بنابراین، از میان پنج پادزیست افزوده‌شده به کشتگاه، پادزیست تتراسایکلین کشنده‌ترین بود و پس از آن، جنتامایسین توان باکتری‌کشی خوبی داشت. تنها باکتری‌های خاک معدن تیمارشده با 100 میلی‌گرم در کیلوگرم مترونیدازول پایداری نمایانی در برابر تتراسایکلین داشتند.

بنابراین، پاسخ باکتری‌ها به پادزیست‌های افزوده‌شده به خاک و پایداری آنها در خاک‌های بررسی‌شده یکسان نیست و به ویژگی‌های پادزیست، خاک و باکتری‌های آنها بستگی دارد. پس درصد باکتری‌های پایدار در خاک چراگاه بالا بود؛ اما درصد باکتری‌های پایدار در برابر تتراسایکلین در خاک معدن به‌ویژه در غلظت صفر و 100 پادزیست‌های به‌کاررفته بیشتر از دو خاک دیگر بود.

[1]. Younessi

[2]. Cross-resistance

[3]. Zhang

[4]. Borquaye

[5]. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)

[6]. EXCEL

[7]. SPSS

[8]. Z-Score

[ix]. Sinegani

[x]. Cao

[xi]. Ghosh and LaPara

[xii]. Liu

[xiii]. Synergistic resistance

[xiv]. Co- regulation

[xv]. Biofilm pathway induction

[xvi]. Song

[xvii]. Santás-Miguel