پیوندهای مفید
اخبار و اعلانات
آمار
| تعداد نشریات | 43 |
| تعداد شمارهها | 1,841 |
| تعداد مقالات | 14,938 |
| تعداد مشاهده مقاله | 41,191,765 |
| تعداد دریافت فایل اصل مقاله | 16,004,066 |
اثرات پالیده عاری از سلول لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس بر بیوفیلم جدایههای مقاوم به کارباپنم کلبسیلا پنومونیه از شیرهای خام | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| زیست شناسی میکروبی | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| دوره 14، شماره 53، فروردین 1404، صفحه 71-84 اصل مقاله (866.28 K) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| نوع مقاله: پژوهشی- فارسی | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| شناسه دیجیتال (DOI): 10.22108/bjm.2023.134951.1491 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| نویسندگان | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ایوب صالحی وند؛ مسلم نیریز نقدهی* | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| دانشکده دامپزشکی، واحد ارومیه، دانشگاه آزاد اسلامی، ارومیه، ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| چکیده | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ظهور و گسترش سویههای مقاوم به کارباپنم کلبسیلا پنومونیه (CRKP) از نگرانیهای جدی در بهداشت عمومی است. باکتریهای اسیدلاکتیک (LAB) و ترکیبات تولیدی آنها بهعنوان عوامل بیوکنترل بالقوه در حذف بیوفیلم مطرح شدهاند. این مطالعه با هدف بررسی اثرات پالیده عاری از سلول (CFS) لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس بر بیوفیلم جدایههای CRKP از شیرهای خام شهرستان پیرانشهر صورت گرفت. 100 نمونه شیرخام بهصورت تصادفی از مناطق مختلف شهرستان پیرانشهر با رعایت شرایط سترون جمعآوری شدند. غنیسازی در آبگوشت BPW، کشت در آگار مککانکی و نیز انجام آزمایشهای متابولیکی مرتبط، روشهای استفادهشده در جداسازی و شناسایی کلبسیلا پنومونیه بودند. شناسایی جدایههای CRKP به روش انتشار دیسک و با استفاده از آنتیبیوتیکهای کارباپنم انجام شد. توانایی تولید بیوفیلم جدایههای CRKP و نیز فعالیت حذف بیوفیلم CFS لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس به روش سنجش میکروپلیت انجام شدند. 12 نمونه شیر (12 درصد)، آلوده به کلبسیلا پنومونیه بودند. از میان جدایهها، 5 جدایه نسبت به دوریپنم (7/41 درصد)، 4 جدایه نسبت به ارتاپنم (3/33 درصد)، 2 جدایه نسبت به ایمیپنم (7/16درصد) و 2 جدایه نسبت به مروپنم (7/16 درصد) مقاوم بودند. 2 جدایه بهعنوان CRKP شناسایی شدند. همچنین، جدایههای CRKP تولیدکنندة متوسط بیوفیلم تشخیص داده شدند. غلظتهای مختلف CFS، بیوفیلم جدایههای CRKP را بهصورت وابسته به غلظت کاهش دادند (0/01˂p). CFS لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس، بیوفیلم جدایههای CRKP را در شرایط آزمایشگاهی کاهش داد؛ بنابراین، ارزیابی اثرات ضدبیوفیلم CFS لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس بر سایر عوامل بیماریزای منتقله از غذا پیشنهاد میشود. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| کلیدواژهها | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| پالیده عاری از سلول؛ لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس؛ بیوفیلم؛ کلبسیلا پنومونیه مقاوم به کارباپنم؛ شیر خام؛ پیرانشهر | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| اصل مقاله | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
مقدمه. زمانی که شیر در پستان حیوان ترشح میشود، بالقوه سترون است؛ اما در هنگام خروج از پستان توسط میکروارگانیسمهایی که از محیط خارج وارد مجرای پستان میشوند، آلوده خواهد شد. موارد ورم پستانی و عفونتها شیر را بهشدت به میکروارگانیسمها آلوده کرده و حتی ممکن است آن را برای مصرف نامناسب کند. در هنگام تهیه و حملونقل شیر در دامداری، ممکن است میکروارگانیسمهای مختلف که بیشتر آنها را باکتریها تشکیل میدهند، شیر را آلوده کنند. میزان آلودگی و نوع جمعیت باکتریایی به نظافت ظروف جمعآوری، ماشینهای شیردوشی، تانکها، همزنها بستگی دارد؛ حتی گفتنی است این سطوح میتوانند شیر را بیشتر آلوده کنند. در یک دامداری که اصول بهداشتی رعایت میشود ممکن است تعداد باکتریهای شیر از چند هزار در هر میلیلیتر تجاوز نکند؛ اما در صورتی که به موازین بهداشتی و سردکردن کافی شیر توجه نشود، تعداد باکتریها از چند میلیون در هر میلیلیتر تجاوز خواهد کرد؛ بنابراین، نظافت مرتب و روزانه، ضدعفونی وسایل شیردوشی و سردکردن سریع شیر خام از عوامل مهم و مؤثر در کیفیت میکروبی شیر است (1). کلیفرمها، از ارگانیسمهای شاخص[1] در میکروبشناسی مواد غذایی هستند. باکتریهایی هستند که به خانواده انتروباکتریاسه تعلق دارند و بیشتر آنها در روده حیوانات خونگرم یافت میشوند. همچنین، بسیاری از عوامل بیماریزای منتقله از غذا[2] از اعضای خانواده انتروباکتریاسه هستند و ازطریق دستگاه رودهای دفع میشوند؛ بنابراین، حضور تعداد بالای کلیفرمها در مواد غذایی میتواند برای پیشگویی وجود عوامل بیماریزای رودهای استفاده شوند. همچنین میزان بالای کلیفرمها در مواد غذایی، میتواند عدم رعایت موازین بهداشتی[3] در مراحل تولید را نشان دهد. حداقل چهار جنس باکتریایی در گروه کلیفرم قرار میگیرند که عبارتاند از اشریشیا[4]، کلبسیلا[5]، سیتروباکتر[6] و انتروباکتر[7]. کلیفرمها ازنظر تعریف عبارتاند از باکتریهای میلهای شکل گرم منفی، غیرهاگزا، هوازی یا بیهوازی اختیاری که لاکتوز را در 35 درجه سانتیگراد در 48 ساعت تخمیر و اسید و گاز تولید میکنند. این گروه از باکتریها در حرارت پاستوریزاسیون از بـین مـیرونـد و در محصولات پاستوریزه بهعنوان شاخص بهداشتی و وجود آلودگی ثـانوی بررسی میشوند (2). گونههای کلبسیلا باکتریهایی میلهای شکل، گرم منفی، غیرمتحرک، بیهوازی اختیاری و محصور در کپسولاند که به خانواده انتروباکتریاسه تعلق دارند. این باکتریها در طبیعت فراگیرند و هم در محیط و هم در دستگاه گوارش حیوانات و انسانها بهصورت فلور طبیعی حضور دارند؛ با وجود این، عوامل بیماریزای فرصتطلب هستند و میتوانند باعث عفونتهای بیمارستانی جدی مانند پنومونی[8]، سپتیسمی[9]، مننژیت[10]، عفونتهای دستگاه ادراری[11] و بافت نرم، در کنار ورم پستان گاوی و متریت مادیان، آبسههای کبدی چرکزا[12] در پستانداران شوند. گونههای کلبسیلا فاکتورهای حدت زیادی هستند که در بیماریزایی و عفونتزایی آنها دخالت دارند و عبارتاند از کپسول، لیپوپلیساکارید، چسبندههای فیمبریال[13] و غیرفیمبریال، سیدروفورها[14] و توانایی تولید بیوفیلم (3). همچنین کلبسیلا پنومونیه[15] به توانایی در تشکیل بیوفیلم شناخته شده است. بیوفیلم اجتماعی از باکتریهای سازماندهیشده در یک ماتریکس خارج سلولی هستند. این ماتریکس از پروتئینها، اگزوپلیساکاریدها، DNA و لیپوپپتیدها تشکیل شده است. نخستینبار LeChevallier و همکاران در سال 1988 کلبسیلا پنومونیه و پدیده تشکیل بیوفیلم را توصیف کردند. این باکتری دارای برخی عوامل بیماریزا مانند پلیساکارید کپسولی، لیپوپلیساکارید، فیمبریای نوع 1 و نوع 3، پروتئینهای غشای خارجی و عوامل تعیینکننده برای جذب آهن و استفاده از منبع نیتروژن است. کلبسیلا پنومونیه از این فاکتورهای حدت برای بقا و فرار از سیستم ایمنی در طول عفونت و همچنین تشکیل بیوفیلم استفاده میکند. کلبسیلا پنومونیه میتواند یک لایه ضخیم از بیوفیلم خارج سلولی تولید کند که از اتصال باکتری به سطوح زنده یا غیرزنده، پشتیبانی و از نفوذ آنتیبیوتیکها محافظت میکند و اثرات آنها را کاهش میدهد (4). تکامل، گسترش و ظهور مقاومت آنتیبیوتیکی باکتریایی یکی از مهمترین مشکلات مراقبتهای بهداشتی در سراسر جهان است. از دهه 1950، عفونتهای ناشی از انتروباکتریاسه با آنتیبیوتیکهای بتالاکتام درمان میشوند. به دنبال معرفی آنتیبیوتیکهای بتالاکتام با طیف وسیع، بتالاکتامازهای با طیف گسترده[16] جدید ظهور کردند. در سال 1996 اولین کارباپنماز[17]، کدگذاریشده توسط ژن blaKPC، در کلبسیلا پنومونیه شناسایی شد. سپس سایر ژنهای کارباپنماز مانند blaNDM، blaOXA-48، blaVIM و blaIMP-1 ظهور کردند. بیشتر گزارشها نشان میدهند حیوانات، محصولات غذایی و محیط نیز ممکن است مخازنی برای باکتریهای تولیدکنندة کارباپنماز باشند (5). کارباپنمها دستهای از آنتیبیوتیکهای بتالاکتام با طیف وسیعی از فعالیت ضدباکتریایی هستند و عموماً در برابر اکثر آنزیمهای بتالاکتاماز تولیدشده توسط باکتریها پایدار هستند؛ بنابراین، کارباپنمها بهعنوان آخرین خط درمانی در برابر عفونتهای باکتریایی ناشی از ارگانیسمهای مقاوم به چند دارو در نظر گرفته میشوند (6). مطالعات مراقبت جهانی نشان میدهند کسر قابل توجهی از جدایههای کلبسیلا پنومونیه از عفونتهای بیمارستانی[18] فعالیتهای بتالاکتامازی با طیف گسترده و کارباپنمازی نشان میدهند. پراکندگی بومی کلبسیلا پنومونیه مقاوم به کارباپنم (CRKP)[19] در سرتاسر جهان گزارش شده است. یونان، ایتالیا و رومانی بالاترین میزان شیوع CRKP را در مقایسه با سایر کشورهای اروپایی دارند (7). باکتریهای اسیدلاکتیک (LAB)[20] و ترکیبات تولیدی آنها بهعنوان عوامل بیوکنترل بالقوه در حذف بیوفیلم مطرح شدهاند. LAB، گروه متنوعی از باکتریها هستند که تاریخچه طولانی استفاده در مواد غذایی و پزشکی دارند. لاکتوباسیلوسها از جنسهای متنوع باکتریهای LAB هستند. لاکتوباسیلوسها بهخصوص گونه اسیدوفیلوس از رایجترین پروبیوتیکها هستند که بهعنوان یک عامل درمانی بیولوژیکی ایمن (GRAS)[21] شناخته میشود؛ همچنین برای تقویت پاسخهای ایمنی میزبان نیز استفاده میشود. مکانیسمهای مختلفی وجود دارد که لاکتوباسیلوسها میتوانند فعالیت ضدمیکروبی خود را اعمال کنند؛ از جمله تولید ترکیبات بازدارنده، تحریک سیستم ایمنی، رقابت با باکتریهای بیماریزا برای اتصال به گیرنده و رقابت روی مواد مغذی. ترکیبات بازدارنده تولیدشده توسط لاکتوباسیلوسها شامل اسیدهای آلی مانند اسیدلاکتیک[22]، اسیداستیک[23] و اسیدفرمیک[24]، باکتریوسینها و پراکسید هیدروژن میشود. بهطور کلی، این ترکیبات ضدمیکروب در طول تکثیر باکتری در محیط کشت مایع ترشح میشوند و با عنوان سوپرناتانت یا پالیده[25] شناخته میشوند. لاکتوباسیلوسها ازطریق این مکانیسمهای ضدمیکروبی، فعالیتهای آنتاگونیستی خود را در برابر باکتریهای بیماریزای مختلف از جمله انتروباکتریاسههای مقاوم به کارباپنم[26] (CRE)، هلیکوباکتر پیلوری[27]، سالمونلا[28]، شیگلا[29]، سودوموناس آیروجینوزا[30] و استافیلوکوکوس اورئوس[31] نشان دادهاند (8). همچنین، در مطالعاتی اثر حذف بیوفیلم پالیده باکتریهای اسیدلاکتیک در برابر عوامل بیماریزای منتقله از غذا گزارش شده است (9-12). در این راستا، تحقیق حاضر با هدف ارزیابی تأثیر پالیده عاری از سلول لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس بر بیوفیلم جدایههای مقاوم به کارباپنم کلبسیلا پنومونیه از شیرهای خام شهرستان پیرانشهر انجام شد. مواد و روشها. جداسازی و شناسایی کلبسیلا پنومونیه: در این بررسی، تعداد 100 نمونه شیرخام بهصورت تصادفی از مناطق مختلف شهرستان پیرانشهر در ظروف سترون، جمعآوری و با رعایت شرایط سرد به آزمایشگاه کنترل کیفی و بهداشتی مواد غذایی دانشکده دامپزشکی منتقل شدند. ابتدا نمونهها در آبگوشت آب پپتونه بافری (BPW)[32] (کیولب، کانادا) در دمای 35 درجه سانتیگراد به مدت 24-18 ساعت غنیسازی شدند. سپس در آگار مککانکی[33] (کیولب، کانادا) کشت خطی داده و در دمای 35 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت گرمخانهگذاری شدند. پرگنههای صورتی رنگ و موکوئیدی ظاهرشده، در آگار مغذی خالصسازی و آزمایشهای متابولیکی تولید اندول (-)، متیل رد (-)، وژئز پروسکائر (+)، مصرف سیترات (+)، سولفید هیدروژن (-)، اورهآز (+)، لیزین دکربوکسیلاز (+)، اورنیتین دکربوکسیلاز (-)، فنیل آلانین دآمیناز (-)، رشد در آبگوشت KCN (+)، حرکت (-)، تولید اسید وگاز از قندهای گلوکز (+)، ساکارز (+)، لاکتوز (+) و دولسیتول (-) برای شناسایی کلبسیلا پنومونیه انجام شدند (13-15). شناسایی جدایههای مقاوم به کاراباپنم کلبسیلا پنومونیه: برای شناسایی جدایههای مقاوم به کارباپنم کلبسیلا پنومونیه از آنتیبیوتیکهای ایمیپنم[34] (10 میکروگرم)، مروپنم[35] (10 میکروگرم)، دوریپنم[36] (10 میکروگرم) و ارتاپنم[37] (10 میکروگرم) (شرکت پادتن طب، ایران) به روش انتشار دیسک[38] استفاده شد. ابتدا جدایهها در آگار مغذی (کیولب، کانادا) کشت و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 24-18 ساعت گرمخانهگذاری شدند. سپس پرگنهها در سالین سترون پراکنده شدند و کدورت سوسپانسیون با کدورت محلول استاندارد نیم مک فارلند بهصورت چشمی تنظیم شد. در مرحله بعد، سوسپانسیون آمادهشده روی آگار مولر هینتون[39] (کیولب، کانادا) با استفاده از سوآب معمولی سترون بهصورت سطحی کشت داده شد و در ادامه، دیسکهای آنتیبیوتیکی روی آن قرار داده شدند. پلیتها در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 24-18 ساعت گرمخانهگذاری شدند و قطر منطقه مهاری[40] با استفاده از کولیس (برحسب میلیمتر) اندازهگیری شد. سپس براساس دستورالعمل مؤسسه استانداردهای آزمایشگاهی و بالینی[41] (CLSI) نتایج بهصورت حساس[42] (S)، نیمهحساس[43] (I) و مقاوم[44] (R) برای هر آنتیبیوتیک ثبت شد (16، 17). سنجش توانایی تولید بیوفیلم جدایههای CRPK: ارزیابی تشکیل بیوفیلم جدایههای CRKP به روش سنجش میکروپلیت انجام شد (18، 19). برای این منظور، از میکروپلیتهای سترون 24 چاهکی کف صاف و دربدار از جنس پلیاستیرن استفاده شد. برای تهیه تلقیح باکتریایی، ابتدا جدایهها در آبگوشت مغذی در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 24-18 ساعت گرمخانهگذاری شدند. سپس با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر و در طول موج 600 نانومتر، جذب نوری سوسپانسیون باکتریایی روی جذب نوری[45] (OD) 1/0 تنظیم و تعداد تقریبی CFU/ml 107 به دست آمد. در مرحله بعد، به هریک از چاهکها 8/1 میلیلیتر آبگوشت TSB[46] (کیولب، کانادا) و 2/0 میلیلیتر از تلقیح باکتریایی افزوده شد. همچنین، بهعنوان شاهد منفی به چاهکها آبگوشت سترون ریخته شد. میکروپلیتها در 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت گرمخانهگذاری شدند. در مرحله بعد، سوسپانسیون درون چاهکها تخلیه و جذب نوری فاز پلانکتونی[47] در طول موج 620 نانومتر اندازهگیری شد. سپس چاهکها با محلول بافر فسفات سالین[48] (PBS) سه بار شستشو و در دمای محیط خشک شدند. در مرحله بعد، به مقدار 2 میلیلیتر کریستال ویوله[49] یک درصد به چاهکها ریخته شد و رنگآمیزی به مدت 30 دقیقه ادامه یافت. سپس رنگ اضافی چاهکها با آب مقطر شستشو داده شد و در دمای محیط خشک شدند. در ادامه، برای محلولکردن بیوفیلم رنگآمیزیشده، 2 میلیلیتر اتانول مطلق به چاهکها افزوده شد. سپس جذب نوری بیوفیلم در طول موج 540 نانومتر اندازهگیری شد. شاخص تشکیل بیوفیلم[50] (SBF) هر جدایه با فرمول زیر محاسبه شد و با استفاده از جدول 1 تفسیر شدند (19). آزمایشها روی جدایهها و نیز شاهد منفی در سه تکرار انجام شدند. SBF = AB: جذب نوری بیوفیلم رنگآمیزیشده CW: جذب نوری شاهد منفی G: جذب نوری فاز پلانکتونی جدول 1- تفسیر شاخص تشکیل بیوفیلم Table 1- Interpretation of the Biofilm Formation Index
تهیه پالیده عاری از سلول (CFS) لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس: ابتدا لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس PTCC 1643 در آبگوشت MRS (مرک، آلمان) و در انکوباتور دیاکسیدکربن به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد گرمخانهگذاری شد. سپس سوسپانسیون باکتریایی، با سرعت 4000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شد. با رعایت شرایط سترون، محلول رویی جداسازی و با فیلتر سرنگی با قطر منافذ 2/0 میکرومتر صاف شد. سپس غلظتهای 1 درصد، 10 درصد و 100 درصد (خالص) در آبگوشت TSB سترون تهیه شدند (18). .ارزیابی فعالیت حذف بیوفیلم CFS لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس بر جدایههای CRPK: این آزمایش به روش سنجش میکروپلیت انجام شد. ابتدا به مقدار 8/1 میلیلیتر از آبگوشت TSB و سپس به مقدار 2/0 میلیلیتر از تلقیح باکتریایی آمادهشده به چاهکها افزوده شدند. میکروپلیتها در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت گرمخانهگذاری شدند. سوسپانسیون باکتریایی چاهکها با دقت تخلیه و با محلول PBS شستشو و در دمای محیط خشک شدند. سپس غلظتهای 1 درصد، 10 درصد و 100 درصد (خالص) از CFS لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس به مقدار 2 میلیلیتر در چاهکها افزوده و در دمای محیط به مدت 30 دقیقه گرمخانهگذاری شدند. در مرحله بعد، CFS از چاهکها تخلیه و با محلول PBS شستشو و در دمای محیط خشک شد. سپس چاهکها با 2 میلیلیتر از محلول کریستال ویوله یک درصد به مدت 30 دقیقه رنگآمیزی شدند و رنگ اضافی چاهکها با آب مقطر شستشو و خشک شد. در مرحله بعد، بیوفیلم رنگآمیزیشده با 2 میلیلیتر اتانول مطلق محلول شد و جذب نوری آن در طول موج 540 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازهگیری شد. در چاهکهای شاهد منفی، فقط آبگوشت TSB و در چاهکهای شاهد، آبگوشت TSB و تلقیح باکتریایی افزوده شدند (18). آزمایشها روی جدایهها، شاهد منفی و نیز شاهد در سه تکرار انجام شدند. 100 × = درصد کاهش بیوفیلم C: جذب نوری چاهکهای شاهد B: جذب نوری چاهکهای شاهد منفی T: جذب نوری چاهکهای تیمارشده روش تجزیه آماری دادهها: تحلیل آماری دادهها با استفاده از نرمافزار SPSS[51] نسخه 25 انجام گرفت. یافتههای توصیفی متغیرهای مطالعهشده شامل میانگین، انحراف معیار، فراوانی مطلق و نسبی محاسبه و گزارش شدند. همچنین با استفاده از آزمون تجزیه واریانس یکطرفه و آزمون تعقیبی توکی اختلاف میانگین درصد کاهش تولید بیوفیلم جدایههای CRKP متأثر از غلظتهای مختلف CSF لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس بررسی شد. گفتنی است در تمامی مراحل تجزیه و تحلیل، خطای مجاز برای رد فرض صفر (H0)، 5 درصد در نظر گرفته شد. همچنین رسم نمودارها با استفاده از نرمافزار اکسل 2019 صورت گرفت. نتایج فراوانی مطلق و نسبی جدایههای کلبسیلا پنومونیه از نمونههای شیر: نتایج نشان میدهند از مجموع 100 نمونه شیرخام آزمایششده، 12 نمونه (12 درصد) آلوده به کلبسیلا پنومونیه هستند (شکل 1). شکل 1- فراوانی نسبی جدایههای کلبسیلا پنومونیه از نمونههای شیر Figure 1- Relative frequency of Klebsiella pneumoniae isolates from milk samples شناسایی جدایههای مقاوم به کارباپنم کلبسیلا پنومونیه: در تحقیق حاضر از 12 جدایه کلبسیلا پنومونیه، 5 جدایه نسبت به دوریپنم (7/41 درصد)، 4 جدایه نسبت به ارتاپنم (3/33 درصد)، 2 جدایه نسبت به ایمیپنم (7/16 درصد) و 2 جدایه نسبت به مروپنم (7/16 درصد) مقاوم بودند. همچنین 2 جدایه نسبت به آنتیبیوتیکهای کارباپنم مقاوم بودند و بهعنوان جدایههای CRKP شناسایی شدند. از میان جدایهها، 11 جدایه (67/91 درصد) حداقل نسبت به یکی ازکارباپنمها، مقاوم یا نیمهحساس بودند؛ درحالیکه فقط یک جدایه (33/8 درصد) نسبت به کارباپنمها حساس بود. این یافته نشان میدهد 67/91 درصد از جدایههای کلبسیلا پنومونیه دارای فنوتیپ کارباپنمازی هستند. همچنین جدایهها بیشترین مقاومت را به دوریپنم (7/41 درصد) و ارتاپنم (3/33 درصد) و بیشترین حساسیت را به ایمیپنم (3/33 درصد) و مروپنم (2/22 درصد) نشان دادند (جدول 2 و شکل 2). فراوانی مطلق و نسبی توانایی تشکیل بیوفیلم جدایههای CRPK: با توجه به بررسی نتایج شاخص تشکیل بیوفیلم، هر دو جدایه CRKP (100 درصد)، تولیدکنندة متوسط بیوفیلم تشخیص داده شدند. فعالیت حذف بیوفیلم CFS لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس بر جدایههای CRPK: نتایج حاکی است غلظتهای آزمایششدة CFS لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس بیوفیلم جدایههای CRPK را بهصورت معنیدار و وابسته به غلظت کاهش میدهند (01/0p<). همچنین CFS خالص (غلظت 100 درصد)، بالاترین درصد کاهش بیوفیلم را نشان داد (شکل 3). جدول 2- آنتیبیوگرام جدایههای کلبسیلا پنومونیه از نمونههای شیر Table 2- Antibiogram of Klebsiella pneumoniae isolates from milk samples
شکل 2- آنتیبیوگرام جدایههای کلبسیلا پنومونیه از نمونههای شیر Figure 2- Antibiogram of Klebsiella pneumoniae isolates from milk samples شکل 3- میانگین± انحراف معیار درصدکاهش بیوفیلم جدایههای CRPK متأثر از CFS لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس (حروف نامشابه در ستونها نشاندهندة وجود اختلاف معنیدار در سطح 05/0>p است) Figure 3- Mean ± standard deviation of biofilm reduction percentage of CRPK isolates affected by CFS of Lactobacillus acidophilus (dissimilar letters in columns indicate significant differences at the p<0.05 level) بحث و نتیجهگیری. کلبسیلا پنومونیه یک پاتوژن فرصتطلب مهم است که بیماریهای عفونی متعددی در انسانها از جمله سپتیسمی، آبسههای کبدی، اسهال و پنومونی را سبب میشود. همچنین یک عامل بیماریزای اکتسابی از بیمارستان شناخته میشود که با افزایش مرگومیر بیماران در ارتباط است. کلبسیلا پنومونیه علاوه بر محیطهای بالینی، بیشتر در غذاها از جمله سبزیهای خام، غذاهای پودری کودکان، گوشت، ماهی، غذاهای آماده یافت میشود و بهعنوان یک عامل بیماریزای منتقله از غذا در نظر گرفته میشود (20). در کنار اهمیت در پزشکی، این باکتری به سبب ایجاد ورم پستان در گاو و عفونت رحم مادیان در دامپزشکی نیز اهمیت دارد (3). در زمینة میزان شیوع کلبسیلا پنومونیه در شیر و فرآوردههای شیر مطالعات متعددی انجام شده است. در یک مطالعه در استانهای جیانگسو و شان دونگ چین، از مجموع 857 نمونه شیر خام آزمایششده (800 نمونه شیر سالم و 57 نمونه شیر ورم پستانی)، 66 نمونه (7/7 درصد) آلوده به کلبسلا پنومونیه بودند (21). در مطالعهای دیگر در شهر آنکارای ترکیه از مجموع 80 نمونه شیر و محصولات شیر آزمایششده، 25 نمونه (25/31 درصد) آلوده به کلبسیلا پنومونیه بودند (22). همچنین در بررسی دیگر در شهرکرد ایران، از 130 نمونه شیر ورم پستانی آزمایششده، 20 نمونه (38/15درصد) آلوده به کلبسیلا پنومونیه بودند (23). در تحقیق کنونی از مجموع 100 نمونه شیر خام شهرستان پیرانشهر، 12 نمونه (12درصد) آلوده به کلبسیلا پنومونیه بودند. یافتههای مطالعه حاضر با یافتههای یانگ و همکاران در سال 2021 (21)، گون دوغان و یاکار در سال 2006 (22) و نیز کریمی و ممتاز در سال 2019 (23) در زمینة آلودگی شیر خام به کلبسیلا پنومونیه در یک راستا است؛ اما میزان آلودگی متفاوت بوده است و به رعایت موازین بهداشتی در مراحل تولید شیر و نیز وقوع ورم پستان در گله بستگی دارد. بهطورکلی، برای کاهش آلودگیهای میکروبی شیر خام، اجرای برنامههای مبارزه با ورم پستان در گله، نظافت و ضدعفونی مرتب و روزانه تجهیزات و وسایل شیردوشی و مخازن نگهداری شیر خام و نیز خنکسازی سریع شیر خام در دامداری پیشنهاد میشود. وقوع ورم پستان در گلههای شیری و نیز استفاده از درمانهای آنتیبیوتیکی بدون برنامه، خطر ظهور و گسترش باکتریهای مقاوم به چند دارو[lii] (MDR) در شیر و فرآوردههای آن را افزایش داده و بهعنوان یک تهدید بالقوه برای امنیت غذایی و بهداشت عمومی مطرح است (21). کارباپنمها بهدلیل طیف وسیع فعالیت و پایداری در مقابل آنزیم بتالاکتاماز، در درمان عفونتهای ناشی از باکتریهای مقاوم به پنیسیلین و سفالوسپورین استفاده میشوند (24)؛ با وجود این، ظهور ژنهای تولیدکنندة بتالاکتاماز با توانایی هیدرولیز کارباپنم (کارباپنماز) بهخصوص در میان باکتریهای انتروباکتریاسه درحال گسترش است که میتواند مشکلات جدی در درمان عفونتها را ایجاد کند (25). آنزیم KPC (کارباپنماز کلبسیلا پنومونیه)، یکی از آنزیمهای هیدرولیزکنندة کارباپنم است که توسط پلاسمیدها انتقال مییابد و میتواند به سرعت بین باکتریها مبادله و باعث مقاومت آنتیبیوتیکی شود (24، 25). مطالعات محدودی در زمینة میزان شیوع کلبسیلا پنومونیه مقاوم به کارباپنم در شیر خام وجود دارد. در یک تحقیق، فعالیت کارباپنمازی 47 جدایه تولیدکنندة ESBL (41 جدایه اشریشیاکلی و 6 جدایه کلبسیلا پنومونیه) از 150 نمونه شیر خام منطقه دریای سیاه ترکیه مطالعه شد. بررسی فنوتیپی نشان داد از 47 جدایه، 7 جدایه نسبت به ایمیپنم یا مروپنم مقاوماند. سنجش PCR نشان داد 33 جدایه از 47 جدایه، حامل حداقل یکی از ژنهای اصلی کارباپنماز هستند (26). در تحقیق حاضر، از 12 جدایه کلبسیلا پنومونیه از شیر خام، 11 جدایه (67/91 درصد)، حداقل نسبت به یکی از آنتیبیوتیکهای کارباپنم، مقاوم یا نیمهحساس بودند؛ درحالیکه فقط یک جدایه (33/8 درصد) نسبت به کارباپنمها حساس بود. این نشان میدهد 67/91 درصد جدایههای کلبسیلا پنومونیه از شیرهای شهرستان پیرانشهر دارای فنوتیپ کارباپنمازی هستند. همچنین دو جدایه نسبت به آنتیبیوتیکهای کارباپنم مقاوم بودند و بهعنوان جدایههای CRKP شناسایی شدند. نتایج مطالعه حاضر با نتایج اویانلیک و همکاران در سال 2022 در زمینة شیوع جدایههای کلبسلا پنومونیه با فعالیت کارباپنمازی در شیر خام مشابه است؛ اما میزان شیوع بستگی به نحوه استفاده از آنتیبیوتیکها در کشورهای مختلف دارد. اجرای برنامههای مبارزه با اورامپستان در گلههای شیری زیرنظر دامپزشک و اجتناب از استفاده بیرویه و خودسرانه آنتیبیوتیکها پیشنهاد میشود. تشکیل بیوفیلم یک فاکتور حدت در کلبسیلا پنومونیه است (3). در یک مطالعه، مشاهده شد جدایههای کلبسیلا پنومونیه با مقاومت دارویی چندگانه در میان تولیدکنندگان ضعیف بیوفیلم (9/97 درصد) بسیار متداولتر از تولیدکنندگان قوی بیوفیلم (76 درصد) هستند. همچنین نشان داده شد جدایههای مقاوم به کارباپنم کلبسیلا پنومونیه، 91 درصد کمتر تمایل به تشکیل بیوفیلم قوی دارند. همچنین رابطه معکوس معنیداری بین تشکیل بیوفیلم و مقاومت آنتیبیوتیکی گزارش شد (27). در تحقیق حاضر دو جدایه CRKP، تولیدکنندة بیوفیلم متوسط تشخیص داده شدند؛ این یافته با یافتههای کازومانو و همکاران در سال 2019 در یک راستا است. بنابراین، میتوان نتیجهگیری کرد فاکتورهای حدت در میکروارگانیسمها با توجه به شرایط زیست و برای حفظ بقا دستخوش تغییراتی میشوند. با توجه به ماهیت پیچیده و مقاوم بیوفیلمها، یافتن راههای جایگزین برای پاکسازی بیوفیلمها مدنظر محققان قرار گرفته است که در این راستا، ترکیبات مشتقشده از گیاهان، پپتیدهای ضدمیکروبی از منابع مختلف و پروبیوتیکها مطرح شدهاند. در سالهای گذشته، علاقه بیشتری به استفاده موضعی از پروبیوتیکها برای غلبه بر مشکل مقاومت آنتیبیوتیکی مرتبط با بیوفیلم وجود داشته است. پروبیوتیکها میکروارگانیسمهای زندهای هستند که وقتی به مقدار کافی مصرف شوند، اثرات سلامتزایی برای میزبان خواهند داشت. در میان باکتریهای اسید لاکتیک، لاکتوباسیلوسها بزرگترین جنس و پرمصرفترین گونههای پروبیوتیکی را شامل میشوند و ازنظر مقررات غذایی ایمن (GRAS) شناخته میشوند (28). پستبیوتیکها[liii] فرآوردههای محلول یا متابولیتهای ترشحشدة پروبیوتیکها هستند که قادر به ایجاد اثرات سودمند فیزیولوژیکی با مکانیسمهای مستقیم یا غیرمستقیم هستند. پستبیوتیکها فرآوردههای متابولیکی جانبی سلولهای پروبیوتیکی زنده از جمله سوپرناتانت بدون سلول (CFS)، پروتئینهای ترشحشده، باکتریوسینها، اسیدهای آلی و بیوسورفکتانتهای ترشحشده[liv] (BS) را شامل میشوند (29). سوپرناتانت بدون سلول لاکتوباسیلوسها ترکیبی از متابولیتهای با وزن مولکولی پایین (اسیدهای آلی، پراکسید هیدروژن و روترین) و بالا (باکتریوسینها و پلیپپتیدهای شبه باکتریوسین) است (30). چندین یافته نشان میدهند CFS مشتقشده از لاکتوباسیلوس بهعنوان یک مایع پاککنندة زیستی عمل میکند که چسبندگی و تشکیل بیوفیلم پاتوژنها روی سطوح زنده و غیرزنده را کاهش میدهد. در یک مطالعه، غلظتهای مختلف مایع فیلترشده بدون سلول لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس اثرات ضدبیوفیلم و تعدیلکنندة سیستم ایمنی را نشان دادند (31). در مطالعهای دیگر، تشکیل بیوفیلم جدایههای تولیدکنندة ESBL کلبسیلا پنومونیه در حضور سوپرناتانتهای لاکتوباسیلوس بهطور چشمگیری کاهش یافت. همچنین پراکسید هیدروژن موجود در سوپرناتانت، یک محصول مؤثر در برابر رشد و تشکیل بیوفیلم کلبسیلا پنومونیه شناخته شد (32). در یک بررسی، CFS لاکتوباسیلوس هلوتیکوس جداشده از کفیر اثرات ضدبیوفیلم در برابر جدایههای MDR کلبسیلا پنومونیه نشان داد (33). در بررسی دیگر، سوپرناتانت گونههای لاکتوباسیلوس در برابر انتروباکتریاسههای مقاوم به کارباپنم فعالیت ضدمیکروبی از خود نشان داد (34). نتایج مطالعه حاضر نشان دادند CFS لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس اثر ضدبیوفیلم در برابر جدایههای CRKP دارد که نتایج این مطالعه با نتایج مطالعات بالا، در زمینة اثرات ضدبیوفیلم CFS لاکتوباسیلوسها بر جدایههای مقاوم به آنتیبیوتیک کلبسیلا پنومونیه، مشابه و در یک راستا هستند؛ بنابراین، از یافتههای تحقیق حاضر میتوان نتیجهگیری کرد CFS لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس دارای اثرات حذف بیوفیلم بر جدایههای مقاوم به کارباپنم کلبسیلا پنومونیه در شرایط آزمایشگاهی است. ارزیابی اثرات ضدبیوفیلم CFS لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس بر سایر عوامل بیماریزای منتقله از غذا پیشنهاد میشود. سپاسگزاری مقاله پژوهشی حاضر مستخرج از پایاننامه دکتری عمومی دامپزشکی است و نویسندگان مقاله از حمایتهای مادی و معنوی دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد ارومیه و مسئول محترم آزمایشگاه کنترل کیفی و بهداشتی مواد غذایی جناب مهندس باقری تشکر و قدردانی مینمایند.
[1]- Indicator organisms [2]- Foodborne [3]- Sanitation [4]- Escherichia [5]- Klebsiella [6]- Citrobacter [7]- Enterobacter [8]- Pneumonia [9]- Septicemia [10]- Meningitis [11]- Urinary Tract Infection (UTI) [12]- Pyogenic liver abscess [13]- Adhesive fimbrial [14]- Siderophore [15]- Klebsiella pneumoniae [16]- Extended spectrum beta-lactamase (ESBL) [17]- Carbapenemases [18]- Nosocomial [19]- Carbapene-resiatant Klebsiella pneumonia (CRKP) [20]- Lactic acid bacteria (LAB) [21]- Generally Recognized as Safe [22]- Lactic acid [23]- Acetic acid [24]- Formic acid [25]- Supernatant [26]- Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae (CRE) [27]- Helicobacter pylori [28]- Salmonella [29]- Shigella [30]- Pseudomonas aeruginosa [31]- Staphylococcus aureus [32]- Buffered pepton water (BPW( [33]- McConkey agar [34]- Imipenem [35]- Meropenem [36]- Doripenem [37]- Ertapenem [38]- Disk Diffusion [39]- Mueller Hiton agar [40]- Inhibition zone [41]- Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) [42]- Sensitive [43]- Intermediate [44]- Resistant [45]- Optical density (OD) [46]- Tryptic Soy Broth (TSB) [47]- Planktonic phase [48]- Phosphate buffered saline (PBS) [49]- Crystal violet [50]- Specific biofilm formation (SBF) index [51]- Statistical package for social sciences (SPSS) [lii]- Multidrug-resistance (MDR) [liii]- Postbiotics [liv]- Biosurfactants (BS) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مراجع | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
آمار تعداد مشاهده مقاله: 1,630 تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 543 |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||