اخبار و اعلانات

 آمار

تعداد نشریات43
تعداد شماره‌ها1,720
تعداد مقالات14,070
تعداد مشاهده مقاله34,094,461
تعداد دریافت فایل اصل مقاله13,652,891
پاداشت, نسیم, عیسی زاده, خسرو, شاه ایلی, مرجان. (1402). اثرات سمیت سلولی عصاره سیتوپلاسمی لاکتوباسیلوس جدا شده از محصولات لبنی استان گیلان بر روی رده سلولی سرطان روده بزرگ (HT-29). , 12(46), 13-25. doi: 10.22108/bjm.2022.133373.1466
نسیم پاداشت; خسرو عیسی زاده; مرجان شاه ایلی. "اثرات سمیت سلولی عصاره سیتوپلاسمی لاکتوباسیلوس جدا شده از محصولات لبنی استان گیلان بر روی رده سلولی سرطان روده بزرگ (HT-29)". , 12, 46, 1402, 13-25. doi: 10.22108/bjm.2022.133373.1466
پاداشت, نسیم, عیسی زاده, خسرو, شاه ایلی, مرجان. (1402). 'اثرات سمیت سلولی عصاره سیتوپلاسمی لاکتوباسیلوس جدا شده از محصولات لبنی استان گیلان بر روی رده سلولی سرطان روده بزرگ (HT-29)', , 12(46), pp. 13-25. doi: 10.22108/bjm.2022.133373.1466
پاداشت, نسیم, عیسی زاده, خسرو, شاه ایلی, مرجان. اثرات سمیت سلولی عصاره سیتوپلاسمی لاکتوباسیلوس جدا شده از محصولات لبنی استان گیلان بر روی رده سلولی سرطان روده بزرگ (HT-29). , 1402; 12(46): 13-25. doi: 10.22108/bjm.2022.133373.1466

اثرات سمیت سلولی عصاره سیتوپلاسمی لاکتوباسیلوس جدا شده از محصولات لبنی استان گیلان بر روی رده سلولی سرطان روده بزرگ (HT-29)

زیست شناسی میکروبی
مقاله 3، دوره 12، شماره 46، تیر 1402، صفحه 13-25    اصل مقاله (809.95 K)
نوع مقاله: پژوهشی- فارسی
شناسه دیجیتال (DOI): 10.22108/bjm.2022.133373.1466
نویسندگان
نسیم پاداشت1؛ خسرو عیسی زاده* 1؛ مرجان شاه ایلی2
1گروه میکروبیولوژی، واحد لاهیجان، دانشگاه آزاد اسلامی، لاهیجان، ایران
2گروه زیست شناسی، واحد ارسنجان، دانشگاه آزاد اسلامی، ارسنجان، ایران
چکیده
مقدمه: باکتری‌های پروبیوتیک ازجمله لاکتوباسیلوس‌ها به‌عنوان یکی از عوامل پیشگیری از ابتلا به انواع مختلف سرطان شناخته شده‌اند. هدف از این مطالعه بررسی اثرات ضدسرطانی عصاره سیتوپلاسمی لاکتوباسیوس جداشده از محصولات لبنی استان گیلان بر رده سلولی سرطان روده بزرگ HT-29 است.
مواد و روش‏‏ها: در این مطالعه باکتری‌های لاکتوباسیلوس توسط روش‌های متداول کشت و براساس ویژگی‌های بیوشیمیایی از محصولات لبنی جداسازی و شناسایی شدند. سپس با استفاده از آغازگرهای اختصاصی، ژن 16S rRNA باکتری‌ها تکثیر شد و نمونه‌های تأیید‌شده پس از تعیین توالی، با توالی‌های موجود در NCBI مقایسه شدند. غلظت‌های مختلف 5/0، 75/0، 1، 5/1 و 2 میلی‌گرم / میلی‌لیتر از عصاره سیتوپلاسمی سویه منتخب ساخته شدند؛ درنهایت، اثرات سمیت سلولی عصاره سیتوپلاسمی لاکتوباسیلوس بر رده سلولی سرطانی HT-29 و سالم HUVEC توسط روش MTT بررسی شدند.
نتایج: نتایج تست MTT بیان کرد عصاره سیتوپلاسمی لاکتوباسیلوس به‌صورت وابسته به دوز، بقا و تکثیر سلول‌های سرطانی روده بزرگ را در مدت زمان 24 ساعت کاهش می‌دهد که بیشترین اثر مهاری مربوط به غلظت 2 میلی‌گرم / میلی‌لیتر بود. غلظت‌های 1، 5/1 و 2 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر، زنده‌مانی سلول‌ها را به‌ترتیب 87/4±50، 61/8±40 و 80/5±25 درصد کاهش دادند. همچنین میزان IC50 عصاره سیتوپلاسمی بر رده سلولی HT29 معادل 43/1 میلی‌گرم / میلی‌لیتر به دست آمد. همچنین اثرات سایتوتوکسیک بر رده سلولی نرمال HUVEC مشاهده نشد.
بحث و نتیجه‏گیری: براساس نتایج، عصاره سیتوپلاسمی لاکتوباسیلوس جداشده از محصولات لبنی موجب کاهش رشد سلول‌های سرطانی HT-29 شد که با انجام مطالعات بیشتر می‌تواند به‌عنوان یک محصول بیولوژیک در درمان و پیشگیری از سرطان روده بزرگ استفاده شود.
کلیدواژه‌ها
پروبیوتیک؛ لاکتوباسیلوس؛ ضد سرطانی؛ HT-29
اصل مقاله

مقدمه.

سرطان روده بزرگ[1] (CRC) سومین علت شایع مرگ و میر ناشی از سرطان در جهان است که در کشورهای توسعه‌یافته شیوع بیشتری دارد (1). درمان‌های سنتی سرطان عمدتاً برداشتن تومور ازطریق جراحی، رادیوتراپی و درمان دارویی است؛ با این حال، رادیوتراپی به‌طور اجتناب‌ناپذیری می‌تواند به سلول‌های طبیعی اطراف بافت‌های سرطانی آسیب برساند و باعث شکستن DNA دو رشته‌ای و از بین بردن اطلاعات ژنتیکی شود و همچنین می‌تواند باعث فیبروز پیشرونده رگ‌های خونی و بافت‌های نرم شود. درمان دارویی نیز می‌تواند به آسیب بافت‌ها و اندام‌های طبیعی مانند مغز استخوان، کلیه و مخاط دهان منجر شود و متابولیسم طبیعی را مختل کند. التهاب و لنف ادم ثانویه نیز از عوارض جانبی درمان دارویی‌اند (2). در زمان حاضر، محققان به‌طور مداوم درحال بررسی روش‌های درمانی با عوارض جانبی کم و یافتن ترکیبات ضدسرطانی هستند.

پروبیوتیک‌ها میکروارگانیسم‌های زنده‌ای هستند که در صورت مصرف به میزان کافی، تأثیرات مثبتی بر میزبان دارند. باکتری‌های اسید لاکتیک[2] (LAB) یکی از رایج‌ترین انواع میکروبیوتای پروبیوتیک‌اند و برای استفاده در مواد غذایی تأیید شده‌اند (3). مطالعات قبلی نشان داده‌اند برخی از باکتری‌های اسید لاکتیک و مواد مغذی تولیدشده توسط آنها اثرات مهاری بر تومورهای بدخیم دارند (4). لاکتوباسیلوس‌ها گروهی از باکتری‌های گرم مثبت، میله‌ای شکل و تولیدکنندة اسید لاکتیک و به‌عنوان فلور نرمال دستگاه گوارش و دستگاه تناسلی انسان‌ها هستند. مطالعه‌ای نشان داد فریکروم[3] مشتق‌شده از لاکتوباسیلوس کازئی[4] ازطریق مسیر پیام‌رسانی (JNK)[5] موجب سرکوب سلول‌های توموری می‌شود (5). مطالعات نشان داده‌اند لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس[6] و لاکتوباسیلوس کازئی می‌‌توانند به‌عنوان درمان کمکی برای شیمی درمانی 5- فلوئورواوراسیل[7] به‌منظور القای آپوپتوز رده سلولی سرطان کولورکتال استفاده شوند (6). مطالعه جی یون لی و همکاران نشان داد پروبیوتیک‌های لاکتوباسیلوس رامنوسوس[8] R0011 و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس R0052 می‌توانند به‌طور مؤثر علائم روده را در بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال بهبود بخشند (7). براساس گزارش‌ها، مکانیسم ضدسرطانی پروبیوتیک‌ها شامل تغییر ترکیب میکروارگانیسم‌های روده، تخریب ترکیبات سرطان‌زا در روده و تولید ترکیباتی با قابلیت ضدسرطانی و تقویت‌کنندة سد روده‌ای در برابر سلول‌های سرطانی است (8). برخی از پروبیوتیک‌ها و محصولات آنها با تنظیم بیان پروتئین‌های خانواده Bcl-2 و پروتئین‌های خانواده کاسپاز می‌توانند سرطان را مهار کنند؛ برای مثال، لاکتوباسیلوس پاراکازئی[9] K5 می‌تواند با تنظیم بیان پروتئین‌های خاص خانواده Bcl-2، آپوپتوز سلول‌های Caco-2 سرطان کولون انسان را به روشی وابسته به دوز و زمان القا کند (9). انتروکوکوس فاسیوم[10] RM11 و لاکتوباسیلوس فرمنتوم[11] RM28 که در شیر تخمیرشده یافت می‌شوند، به‌ترتیب 21 و 23 درصد از تکثیر سلول‌های Caco-2 جلوگیری می‌کنند (10). باکتری‌های اسید لاکتیک می‌توانند با سایر فلورهای میکروبی روده انسان همکاری کنند تا کربوهیدرات‌های غیرقابل هضم موجود در رژیم غذایی را به اسیدهای چرب با زنجیره کوتاه[12] (SCFAs) مانند بوتیرات و پروپیونات تخمیر کنند و درنتیجه وضعیت پایدار میکروب‌های روده را بهبود بخشند و رشد سرطان روده بزرگ را مهار کنند (11). پروبیوتیک پدیوکوکوس پنتوساسئوس[13] GS4 اسید لینولئیک کونژوگه[14] (CLA) تولید می‌کند که ممکن است نقش مهمی در بهبود سرطان روده بزرگ داشته باشد (12). هدف از این پژوهش بررسی اثر سایتوتوکسیک غلظت‌های مختلف عصاره سیتوپلاسمی لاکتوباسیلوس جداشده از محصولات لبنی بر رده سلولی سرطان روده بزرگ (HT-29) و سلول‌های سالم ورید بند ناف انسان (HUVEC)[15] با استفاده از روش MTT است.

 

مواد و روش‌ها.

جداسازی و شناسایی لاکتوباسیلوس: نمونه‌های لبنی از مناطق مختلف استان گیلان تهیه و به آزمایشگاه منتقل شدند. به‌منظور جداسازی لاکتوباسیلوس‌ها، 1 میلی‌لیتر یا 1 میلی‌گرم از هر نمونه، به 99 میلی‌لیتر آب پپتونه 1/0 درصد اضافه و رقت‌های مختلفی از آنها تهیه شد. هرکدام از رقت‌ها در محیط MRS آگار حاوی 100 میلی‌گرم در میلی‌لیتر سیکلوهگزامید (برای جلوگیری از رشد مخمر) کشت داده و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شدند. کلنی‌های رشدکرده در سطح آگار به‌صورت جداگانه کشت داده و ازنظر واکنش گرم و کاتالاز بررسی شدند. از باکتری‌های میله‌ای گرم مثبت، فاقد اسپور و کاتالاز منفی، کشت خالص تهیه شد و با استفاده از آزمون‌های اکسیداز، رشد در دمای 45 درجه سانتی‌گراد و تحمل NaCl بررسی شدند.

تأیید مولکولی لاکتوباسیلوس.

استخراج DNA: تأیید مولکولی لاکتوباسیلوس با استفاده از روش PCR انجام شد. به این منظور، استخراج DNA با استفاده از کیت استخراج DNA (کارمانیا پارس ژن، ایران) انجام شد. ابتدا رسوب سلولی پس از سانتریفیوژکردن کشت باکتریایی جدا شد. سپس 400 میکرولیتر بافر لیزکننده[16] به آن اضافه و به مدت 15 ثانیه ورتکس شد. محلول به‌دست‌آمده به مدت 20 دقیقه در 65 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شد. پس از اتمام انکوباسیون، 300 میکرولیتر از بافر رسوب‌دهنده[17] به آن اضافه و به مدت 5 ثانیه ورتکس شد. پس از اضافه‌کردن 40 میکرولیتر از بافر حامل[18] و 10 دقیقه انکوباسیون در دمای اتاق، محلول داخل ستون ریخته و سانتریفیوژ با چرخش 8000 دور در دقیقه به مدت 1 دقیقه انجام شد. مایع داخل لوله جمع‌آوری، خارج و ستون داخل آن قرار داده شد. 300 میکرولیتر از بافر شستشو I[19] به آن اضافه و به مدت 1 دقیقه و با سرعت 8000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. پس از سانتریفیوژ، محلول زیری خارج و 400 میکرولیتر از بافر شستشو II[20] به داخل ستون اضافه شد. سانتریفیوژ به مدت 1 دقیقه با سرعت 8000 دور در دقیقه انجام شد. سپس ستون داخل لوله جمع‌آوری جدید قرار گرفت و 50 میکرولیتر آب فاقد دئوکسی ریبونوکلئاز به آن اضافه شد. سانتریفیوژ به مدت 2 دقیقه با سرعت 8000 دور در دقیقه انجام شد. DNA استخراج‌شده در دمای منفی 20 درجه سانتی‌گراد ذخیره شد.

واکنش PCR: واکنش PCR در حجم 20 میکرولیتر شامل 10 میکرولیتر از مستر میکس آمپلیکون Taq DNA Polymerase (حاوی Ampliqon Taq DNA Polymerase، dNTPs و منیزیم کلرید)، 2 میکرولیتر از آغازگرهای عمومی ژن 16S rRNA (جدول 1)، 3 میکرولیتر از DNA و 5 میکرولیتر آب مقطر و طبق برنامه دمایی و زمانی ارائه‌شده در جدول 2 انجام شد؛ درنهایت، محصول PCR با الکتروفورز ارزیابی شد.

 

 

جدول 1- توالی و مشخصات آغازگرهای ژن 16S rRNA

نام ژن

آغازگر

ترتیب توالی

دمای ذوب (درجه سانتی‌گراد)

منبع

16S rRNA

27F

5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

56

(13)

16S rRNA

1492R

5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'

56

 

جدول 2- برنامه دمایی و زمانی واکنش PCR برای تکثیر ژن 16S rRNA

برنامه

دما (درجه سانتی‌گراد)

زمان

تعداد چرخه‌ها

واسرشت‌سازی اولیه

94

5 دقیقه

1

واسرشت‌سازی

94

45 ثانیه

32

اتصال آغازگرها

55

45 ثانیه

32

طویل‌سازی

72

1 دقیقه

32

طویل‌سازی نهایی

72

1 دقیقه

1

 

 

الکتروفورز محصول PCR: الکتروفورز محصول PCR در ژل آگارز 1 درصد انجام شد. برای آماده‌کردن ژل آگارز، 3/0گرم پودر آگارز به کمک حرارت در 30 میلی‌لیتر بافر TAE 1X حل شد. پس از ریختن آگارز در قالب و تشکیل چاهک‌های مخصوص بارگذاری نمونه، محصول PCR قبل از بارگذاری روی پارافیلم قرار داده شد و با بافر بارگذاری حاوی بروموفنول بلو، گلیسرول و EDTA ترکیب و با استفاده از میکروپیپت در قسمت بالایی ژل بارگذاری شد. سپس الکتروفورز روی ژل آگارز 1 درصد با استفاده از دستگاه الکتروفورز افقی به مدت یک ساعت و با ولتاژ 80 ولت انجام شد. پس از گذشت یک ساعت از حرکت محصول PCR روی ژل، ژل روی صفحه دستگاه یووی ترانس ایلومیناتور قرار داده و ازنظر وجود باند بررسی شد.

تعیین توالی و ترسیم درخت فیلوژنی: پس از انجام الکتروفورز و بررسی باندهای تشکیل‌شده روی ژل، نمونه‌های مدنظر همراه با پرایمر‌های 16S rRNA برای تعیین توالی به شرکت (سیناژن، ایران) ارسال شدند. سپس توالی دریافتی هر جدایه با توالی‌های موجود در بانک ژنی مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی (NCBI)[21] توسط ابزار پایه‌ای برای جستجوی برهم‌نهی‌های موضعی (BLAST)[22] مقایسه شد تا نزدیک‌ترین سویه به جدایه‌ها شناسایی شود. گفتنی است از میان 2 سویه جداسازی‌شده، جدایه L1 برای ادامه این پژوهش انتخاب شد، درخت فیلوژنی آن، رسم و اثر ضدسرطانی آن ارزیابی شد. به‌منظور رسم درخت فیلوژنی، توالی‌های یافت‌شده به همراه توالی جدایه مدنظر وارد نرم‌افزار تجزیه و تحلیل ژنتیک تکاملی مولکولی (مگا 7، MEGA 7)[23] شدند و هم‌ردیفی[24] آنها انجام شد. پس از هم‌ردیفی، درخت فیلوژنی با روش اتصال همسایگی (NJ)[25] و بوت استرپ (Bootstrap) 1000 رسم شد (14، 15).

آماده‌سازی عصاره سیتوپلاسمی لاکتوباسیلوس: برای آماده‌سازی عصاره سیتوپلاسمی، کلنی‌های رشدکرده روی MRS آگار[26] به MRS براث، منتقل و به مدت 24 ساعت در 37 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شدند. سپس 1 میلی‌لیتر از کشت 24 ساعته در 50 میلی‌لیتر محیط کشت تازه MRS براث مجدداً کشت داده و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد با چرخش 120 دور در دقیقه گرماگذاری شد. جذب نوری محیط کشت در طول موج 600 نانومتر اندازه‌گیری شد تا میزان جذب نوری محیط کشت حاوی باکتری به 1 برسد. سپس برای جداسازی رسوب سلولی، محیط کشت حاوی باکتری به لوله منتقل و به مدت 10 دقیقه با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. پس از شستشو با محلول نمکی بافر فسفات (PBS)[27]، باکتری با استفاده از روش فریز - ذوب‌کردن[28] لیز شد و سپس عمل خردکردن با سونیکاتور انجام گرفت. با استفاده از سانتریفیوژ، دیواره‌های سلولی رسوب داده شدند و مایع رویی به‌عنوان عصاره سیتوپلاسمی جدا شد. سنجش پروتئین موجود در عصاره سیتوپلاسمی با روش برادفورد محاسبه شد. سپس غلظت‌های مختلف 5/0، 75/0، 1، 5/1 و 2 میلی‌گرم / میلی‌لیتر از عصاره سیتوپلاسمی تهیه و با فیلتر 22/0 میکرومتری استریل شدند.

کشت سلولی: رده سلولی سرطان کولون (HT29) و سلول‌های اندوتلیالی ورید ناف انسان (HUVEC) از بانک سلولی انستیتو پاستور ایران خریداری شدند. سلول‌ها در محیط کشت DMEM حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS) و 1 درصد محلول پنی‌سیلین استرپتومایسین (Pen-Strep)[29] کشت داده و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و 5 درصد CO2 انکوبه شدند.

بررسی بقای سلولی (MTT assay): به‌منظور بررسی اثرات سمیت سلولی عصاره باکتریایی از روش رنگ‌سنجی MTT استفاده شد (16). اساس این روش شکستن نمک زرد تترازولیوم توسط سلول‌های زنده به کریستال‌های فورمازان بنفش رنگ غیرمحلول در آب است. نمک تترازولیوم در حضور آنزیم دهیدروژناز میتوکندریایی سلول‌های زنده، شکسته و به ترکیب نامحلول فورمازان به رنگ بنفش تبدیل می‌شود. فورمازان توسط حلال‌های آلی مانند DMSO، حل و جذب نوری رنگ بنفش توسط اسپکتروفتومتری در طول موج 490 نانومتر قرائت می‌شود.

ابتدا 200 میکرولیتر (105☓1) از سلول‌های HT-29 و HUVEC در هر چاهک از پلیت 96 خانه‌ای منتقل و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. بعد از گذشت 24 ساعت، 200 میکرولیتر از غلظت‌های مختلف عصاره سیتوپلاسمی در چاهک‌ها ریخته شد. در چاهک‌های کنترل هیچ تیماری روی سلول‌ها صورت نگرفت. سپس انکوباسیون به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انجام شد. پس از اتمام زمان انکوباسیون، محتوای پلیت، خالی و با PBS شستشو داده شد و داخل هر چاهک 20 میکرولیتر از محلول 5 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر MTT، اضافه و میکروپلیت در فویل آلومینیومی قرار داده و به مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. پس از اتمام 4 ساعت، محتوای چاهک‌ها دور ریخته و به هر چاهک 20 میکرولیتر محلول DMSO اضافه شد و پلیت به مدت 5 دقیقه روی چرخنده[30] قرار گرفت تا کریستال‌های فورمازان به‌طور کامل پخش شود؛ درنهایت، جذب نوری چاهک‌های رنگ‌شده در طول موج 490 نانومتر با دستگاه خوانشگر میکروپلیت[31] (بایوتک ELX 800، آمریکا) خوانده شد و میزان بقای سلولی از فرمول زیر محاسبه شد:

 

100×(جذب نوری سلول‌های کنترل / جذب نوری سلول‌های تیمارشده)=میزان بقای سلولی

 

 

نتایج

جداسازی لاکتوباسیلوس‌ها: نمونه‌های لبنی پس از رقیق‌سازی و تهیه سوسپانسیون، در MRS آگار به مدت 24 تا 48 ساعت و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد کشت داده شدند. کلنی‌های ظاهرشده بر سطح آگار بررسی شدند و از کلنی‌های گرد و مایل به رنگ سفید کشت خالص تهیه شد. کلنی‌ها براساس رنگ‌آمیزی گرم و تست کاتالاز بررسی شدند. تعداد 5 کلنی باکتریایی دارای خواص بیوشیمیایی لاکتوباسیلوس ازجمله میله‌ای شکل، گرم مثبت و کاتالاز منفی بودند. سپس کلنی‌های تأییدشده توسط آزمون‌های تحمل غلظت‌های مختلف NaCl و رشد در دمای 45 درجه سانتی‌گراد ارزیابی و درنهایت، 2 نمونه منتخب L1 و L2 برای شناسایی مولکولی استفاده شدند.

شناسایی باکتری‌ها با استفاده از PCR و توالی‌یابی: آزمایش PCR برای ژن 16S rRNA در 2 جدایه‌ مدنظر، انجام و محصول PCR الکتروفورز شد. محصول PCR هر 2 نمونه، باندی حدود 1540 جفت‌باز را روی ژل 1 درصد ایجاد کردند که نشان‌دهندة‌ تکثیر ژن 16S rRNA در نمونه‌ها بود (شکل 1)؛ درنهایت، به‌منظور تأیید محصول PCR، نمونه‌های منتخب به همراه آغازگرهای اختصاصی برای تعیین توالی به شرکت (سیناژن، ایران) فرستاده شدند. برای شناسایی باکتری مدنظر در حد گونه، توالی‌های دریافتی با توالی‌های ثبت‌شده در پایگاه NCBI با استفاده از بلاست مقایسه شدند. نتایج بلاست نشان دادند توالی نمونه‌های L1 و L2 با مشابهت 51/88 درصد و 32/87 درصد، به‌ترتیب مربوط به لاکتوباسیلوس دلبروکی HBUAS53123 و لیموسی‌لاکتوباسیلوس فرمنتوم HFD1 هستند (جدول 3).

ترسیم درخت فیلوژنی: براساس توالی ژن 16S rRNA ارتباط فیلوژنی جدایه‌ L1 با دیگر سویه‌های موجود در پایگاه NCBI تعیین شد. همان‌طور که در شکل 2 نشان داده شده است، جدایه L1 و لاکتوباسیلوس دلبروکی HBUAS53123 با بوت استرپ 62 درصد در یک خوشه از درخت فیلوژنی قرار گرفتند که می‌توان نتیجه گرفت نزدیک‌ترین سویه به جدایه L1 است.

 

 

شکل 1- تصویر قطعه 1540 جفت‌بازی ژن 16s rRNA جدایه‌های مطالعه‌شده (ستون 1 مربوط به جدایه L1 و ستون 2 مربوط به جدایه L2 است). ستون M مارکر 1000 جفت‌بازی

 

جدول 3- نتایج بلاست توالی ژن 16S rRNA جدایه‌های L1 و L2 با توالی‌های موجود در سایت NCBI

شماره دسترسی

همپوشانی (درصد)

همسانی (درصد)

سویه

جدایه

MH392983.1

92

56/88

لاکتوباسیلوس دلبروکی HBUAS53123

L1

CP050919.1

28

32/87

لیموسی‌لاکتوباسیلوس فرمنتوم  HFD1

L2

 

 

شکل 2- درخت فیلوژنتیک جدایه L1 براساس آنالیز توالی ژن 16S rRNA

 

بررسی میزان سمیت سلولی با آزمون MTT: تیمار سلول‌های HT29 با غلظت‌های 5/0، 75/0، 1، 5/1 و 2 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر از عصاره سیتوپلاسمی لاکتوباسیلوس با استفاده از تست MTT طی مدت 24 ساعت انجام شد. غلظت‌های 5/0و 75/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر بر رشد سلولی اثر مهاری نداشتند؛ با این حال، غلظت‌های 1، 5/1 و 2 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر، زنده‌مانی سلول‌ها را به‌ترتیب 87/4±50، 61/8±41 و 80/5±25 درصد کاهش دادند. براساس نتایج، فعالیت ضدتکثیری عصاره سیتوپلاسمی لاکتوباسیلوس به‌صورت وابسته به دوز بود و در غلظت 2 میکروگرم / میلی‌لیتر بیشترین اثر مهاری (75 درصد) مشاهده شد. همچنین میزان IC50 عصاره سیتوپلاسمی بر رده سلولی HT-29 معادل 43/1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر به دست آمد (شکل 3). همچنین، نتایج بررسی سمیت سلولی در رده سلولی نرمال HUVEC نشان دادند غلظت‌های استفاده‌شده از عصاره سیتوپلاسمی در مدت 24 ساعت نه‌تنها بر سلول اثر مهاری ندارند، بلکه تکثیر سلولی را به میزان غیرچشمگیری افزایش می‌دهند (شکل 4).

 

 

 

شکل 3- درصد بقای سلول‌های HT-29 پس از تیمار با غلظت‌های مختلف عصاره سیتوپلاسمی لاکتوباسیلوس

 

 

شکل 4- درصد بقای سلول‌های HUVEC پس از تیمار با غلظت‌های مختلف عصاره سیتوپلاسمی لاکتوباسیلوس

 

بحث و نتیجه‌گیری

با وجود پیشرفت‌های اخیر در استراتژی‌های درمان سرطان، سرطان‌ها دومین عامل مرگ‌ومیر در سراسر جهان‌اند. اگرچه برخی از درمان‌های ضدسرطان مانند جراحی، شیمی درمانی و رادیوتراپی با موفقیت‌های متفاوتی در بسیاری از انواع بیماران سرطانی استفاده شده است، این درمان‌ها گران‌اند و عوارض جانبی زیان‌باری ازجمله سمیت قلبی، اسهال، تنگی روده و ناتوانی در جذب مؤثر مواد مغذی دارند (17، 18). پروبیوتیک‌ها به‌عنوان درمان‌های مکمل برای افزایش اثربخشی عوامل ضدسرطان پیشنهاد شده‌اند و در مطالعات متعددی فعالیت ضدسرطانی آنها بررسی شده است؛ با این حال، فعالیت ضدتکثیری پروبیوتیک‌ها بسیار وابسته به سویه است و به‌طور گسترده‌ای از یک سویه به سویه دیگر و با توجه به نوع سلول سرطانی متفاوت است. علاوه بر این، استفاده از اجزای مختلف باکتریایی ازجمله دیواره‌های سلولی، مایع رویی کشت و عصاره سیتوپلاسمی نتایج متفاوتی مانند فعالیت ضدتکثیری، القای آپوپتوز و سایر خواص ضدسرطانی ایجاد می‌کند. در مطالعه حاضر لاکتوباسیلوس دلبروکی براساس روش‌های متداول کشت و بیوشیمیایی و همچنین آنالیز مولکولی براساس ژن 16S rRNA از نمونه‌های لبنی جداسازی شد. سپس اثرات ضدسرطانی عصاره ستوپلاسمی آن با استفاده از آزمون سمیت‌سنجی بررسی شدند.

نتایج بررسی اثر غلظت‌های مختلف عصاره سیتوپلاسمی لاکتوباسلوس دلبروکی بر سلول‌های سرطانی HT-29 نشان دادند غلظت‌های 1، 5/1 و 2 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر، طی زمان 24 ساعت زنده‌مانی سلول‌ها را به‌ترتیب 87/4±50 )(P value <0.01)، 61/8±41 (P value <0.01) و 80/5±25 (P value <0.001) درصد کاهش می‌دهند؛ با این حال، غلظت‌های 5/0 و 75/0 از عصاره موجب افزایش ناچیزی در تکثیر سلول‌های سرطانی شدند. همچنین، غلظت 43/1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر از عصاره سیتوپلاسمی رشد سلول‌های HT-29 را تا 50 درصد کاهش داد. در مطالعه‌ای که اثر ضدتکثیری عصاره سیتوپلاسمی لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و لاکتوباسیلوس دلبروکی بر رده سلولی HT-29 با روش MTT بررسی شد، پس از انکوباسیون ۲۴ ساعته غلظت‌های ۵ و ۸ میلی‌گرم بر میلی‌لیتر از عصاره سیتوپلاسمی لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و لاکتوباسیلوس دلبروکی به‌ترتیب زنده‌مانی سلول‌ها را به میزان ۴۰ و ۱۹ درصد کاهش دادند (P value <0.001)؛ با این حال، غلظت‌های 08/0 و 8/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر از عصاره لاکتوباسیلوس دلبروکی به‌صورت چشمگیری (P value <0.05) رشد سلول‌های سرطانی را افزایش دادند (19). براساس این مشاهدات به نظر می‌رسد غلظت‌های پایین‌تر عصاره سیتوپلاسمی لاکتوباسیلوس دلبروکی، با ایجاد تغییراتی در مسیر پیام‌رسانی سلولی موجب افزایش زنده‌مانی سلول‌های سرطانی HT-29 می‌شود.

در پژوهش حاضر، عصاره سیتوپلاسمی علاوه بر اینکه هیچ سمیتی بر سلول‌های سالم اندوتلیال ورید ناف انسان نداشت، به شکل غیرچشمگیری زنده‌مانی سلول‌ها را افزایش داد. با توجه به اینکه سلول‌های اندوتلیال ورید ناف انسان پتانسیل مهاجرت به ماتریکس خارج سلولی و تشکیل عروق خونی جدید را دارند و برای رگ‌زایی و متاستاز، تهاجم و برهم‌کنش سلول‌های توموری با سلول‌های میزبان ضروری‌اند، به نظر می‌رسد افزایش سلول‌های HUVEC به نفع سلول‌های سرطانی و افزایش شانس متاستاز باشد (20).

در مطالعه‌ای اثر غلظت‌های ۲۰۰۰-۵۰ میکروگرم بر میلی‌لیتر دیواره سلولی و عصاره سیتوپلاسمی لاکتوکوکوس لاکتیس تهیه‌شده با روش ذوب - انجماد بر رده سلولی سرطان روده بزرگ SW480 ارزیابی شد. براساس نتایج، اجزای مختلف باکتریایی به‌ترتیب زنده‌مانی سلول‌ها را در محدوده 98-۴۹ درصد و محدوده 97-۴۷ درصد کاهش دادند؛ با این حال، اثرات سمیت بر رده سلولی مطالعه‌شده در مقایسه با گروه کنترل تیمارنشده تغییر چشمگیری نداشت (21). در مطالعه کیم و همکاران[xxxii] (22)، عصاره سیتوپلاسمی لاکتوکوکوس لاکتیس فعالیت ضدتکثیری چشمگیری در برابر رده سلولی سرطان روده بزرگ SNUC2A نشان داد. براساس نتایج غلظت 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر از عصاره سیتوپلاسمی، زنده‌مانی سلول سرطانی را تا بیش از 80 درصد کاهش داد.

در مطالعه‌ای مشخص شد کفیر به‌طور چشمگیری نسبت Bax به Bcl-2 را در سلول‌های سرطانی HT-29 و Caco-2 افزایش می‌دهد که نشان‌دهندة القای آپوپتوز سلولی در رده‌های سلولی سرطانی است (23). همچنین مشخص شده است لاکتوباسیلوس روتری با شرکت در مسیر خارجی آپوپتوز از بروز سرطان روده بزرگ جلوگیری می‌کند (24). لاکتوباسیلوس می‌تواند با تولید نیترات و نیتریت بر Bcl-2 اثر مهاری داشته باشد و به این شیوه موجب القای آپوپتوز شود (25). آپوپتوز، یک فرایند تنظیم‌شدة مرگ سلولی است که باعث حذف آسیب‌ها یا سلول‌های ناخواسته، بدون آسیب در ارگانیسم‌های چندسلولی می‌شود. این فرایند به‌منظور کنترل رشد و ثابت نگه‌داشتن شرایط محیط داخل بدن انجام می‌شود و ازطریق تغییرات ریخت‌شناسی ازجمله چروکیدگی سلولی، متراکم‌شدن کروماتین و تشکیل اجسام آپوپتوتیک[xxxiii] مشخص می‌شود (26).

فعالیت ضدسرطانی لاکتوباسیل‌ها می‌تواند ناشی از پلی‌ساکاریدها و پپتیدوگلیکان‌ها باشد؛ با این حال، حضور آنزیم‌ها، پروتئین‌ها و سموم موجود در عصاره سیتوپلاسمی لاکتوباسیلوس‌ها به‌طور چشمگیری زنده‌ماندن سلول‌های سرطانی کولورکتال را کاهش می‌دهند (27). اثرات ضدسرطانی لاکتوباسیلوس‌ها می‌تواند به‌دلیل وجود پپتیدهای موجود در عصاره سیتوپلاسمی آنها به نام لاکتوفرین باشد. لاکتوفرین فعالیت ضدسرطانی خود را با القای آپوپتوز و همچنین مهار چرخه سلولی و مهاجرت در سلول‌های سرطانی اعمال می‌کند. اساس ویژگی ضدسرطانی لاکتوفرین را می‌توان به اتصال الکترواستاتیکی ناحیه N ترمینال کاتیونی این پپتید، به مولکول‌های اسیدی ازجمله پروتئوگلیکان‌ها، گلیکوزآمینوگلیکان‌ها[xxxiv] و اسیدهای سیالیک نسبت داد که در سطح سلول‌های سرطانی به شدت بیان می‌شوند (28). یکی دیگر از مکانیسم‌های ضدسرطانی لاکتوباسیلوس‌ها، تقویت سیستم ایمنی با تولید سیتوکین‌های IFN-γ و TNF-α و درنتیجه، حذف سلول‌های توموری است (29).

همچنین مشخص شده است یکی از مکانیسم‌های ضدتکثیری لاکتوباسیلوس، وجود اسیدهای چرب با زنجیره کوتاه در عصاره سیتوپلاسمی آن است. درواقع، SCFAs همراه با لیگاندهای TLR، با تأثیر بر پیام‌رسانی سلولی، در چرخه سلولی و تکثیر اختلال ایجاد می‌کنند (30)؛ درنتیجه، اثرات پروبیوتیکی لاکتوباسیلوس به تحریک سیستم ایمنی محدود نمی‌شوند؛ بلکه از زنده‌ماندن و تکثیر سلول‌های سرطانی روده بزرگ جلوگیری می‌کنند. نتایج این مطالعه نشان دادند عصاره سیتوپلاسمی لاکتوباسیلوس دلبروکی بر رشد سلول‌های سرطانی HT-29 اثر مهاری دارد که احتمالاً به‌دلیل وجود ترکیبات ضدسرطانی است.

با توجه به نتایج به‌دست‌آمده از مطالعه حاضر، استفاده از پروبیوتیک لاکتوباسیلوس دلبروکی، ابزاری امیدوارکننده برای پیشگیری از بروز سرطان روده بزرگ می‌تواند باشد؛ با این حال، انجام مطالعات بیشتر برای شناسایی مسیرهای پیام‌رسانی و مکانیسم‌های دخیل در اثرات ضدسرطانی این باکتری و شناسایی ترکیبات موجود در عصاره سیتوپلاسمی آن لازم است.

 

[1]- Colorectal cancer (CRC)

[2]- Lactic acid bacteria (LAB)

[3]- Ferrichrome

[4]- Lactobacillus casei

[5]- c-Jun N-terminal kinase (JNK) signaling pathway

[6]- Lactobacillus acidophilus

[7]- 5-fluorouracil (5-FU)

[8]- Lactobacillus rhamnosus

[9]- Lactobacillus paracasei

[10]- Enterococcus faecium

[11]- Lactobacillus fermentum

[12]- Short-chain fatty acids (SCFAs)

[13]- Pediococcus pentosaceus GS4

[14]- Conjugated linoleic acids (CLA)

[15]- Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)

[16]- Lysis buffer

[17]- Precipitation buffer

[18]- Carrier buffer

[19]- Wash buffer I

[20]- Wash buffer II

[21]- National Center for Biotechnology Information

[22]- Basic Local Alignment Search Tool

[23]- Molecular Evolutionary Genetics Analysis

[24]- Alignment

[25]- Neighbor Joining

[26]- De man, rogosa and sharpe (MRS) agar

[27]- Phosphate-buffered saline (PBS)

[28]- Freeze-Thaw

[29]- Penicillin Streptomycin solution (Pen-Strep)

[30]- Rotator

[31]- Microplate Reader

[xxxii]- Kim et al.

[xxxiii]- Apoptotic

[xxxiv]- Glycosaminoglycans (GAGs)

مراجع

(1) dos Reis, S. A., da Conceição, L. L., Siqueira, N. P., Rosa, D. D., da Silva, L. L., & Peluzio, M. do C. G. Review of the mechanisms of probiotic actions in the prevention of colorectal cancer. Journal of Nutrition Research 2017; 37: 1-19.

(2) Liu, C., Zheng, J., Ou, X., & Han, Y. Anti-cancer Substances and Safety of Lactic Acid Bacteria in Clinical Treatment. Journal of Frontiers in Microbiology 2021; 12.

(3) Riaz Rajoka, M. S., Zhao, H., Mehwish, H. M., Li, N., Lu, Y., Lian, Z., Shao, D., Jin, M., Li, Q., Zhao, L., & Shi, J. Anti-tumor potential of cell free culture supernatant of Lactobacillus rhamnosus strains isolated from human breast milk. Food Research International Journal 2019; 123: 286-297.

(4) Saber, A., Alipour, B., Faghfoori, Z., Mousavi jam, A., & Yari Khosroushahi, A. Secretion metabolites of probiotic yeast, Pichia kudriavzevii AS-12, induces apoptosis pathways in human colorectal cancer cell lines. Journal of Nutrition Research 2017; 41: 36-46.

(5) Ijiri, M., Fujiya, M., Konishi, H., Tanaka, H., Ueno, N., Kashima, S., Moriichi, K., Sasajima, J., Ikuta, K., & Okumura, T. Ferrichrome identified from Lactobacillus casei ATCC334 induces apoptosis through its iron-binding site in gastric cancer cells. Journal of Tumor Biology 2017; 39 (6): 101042831771131.

(6) Baldwin∗, C., Millette∗, M., Oth, D., Ruiz, M. T., Luquet, F. M., & Lacroix, M. Probiotic Lactobacillus acidophilus and L. casei Mix Sensitize Colorectal Tumoral Cells to 5-Fluorouracil-Induced Apoptosis. Journal of Nutrition and Cancer 2010; 62 (3): 371-378.

(7) Lee, J. Y., Chu, S. H., Jeon, J. Y., Lee, M. K., Park, J. H., Lee, D. C., Lee, J. W., & Kim, N. K. Effects of 12 weeks of probiotic supplementation on quality of life in colorectal cancer survivors: A double-blind, randomized, placebo-controlled trial. Journal of Digestive and Liver Disease 2014; 46 (12): 1126-1132.

(8) Zhu, Q., Gao, R., Wu, W., & Qin, H. The role of gut microbiota in the pathogenesis of colorectal cancer. Journal of Tumor Biology 2013 34; 3: 1285-1300.

(9) Rosa, L. S., Santos, M. L., Abreu, J. P., Balthazar, C. F., Rocha, R. S., Silva, H. L. A., Esmerino, E. A., Duarte, M. C. K. H., Pimentel, T. C., Freitas, M. Q., Silva, M. C., Cruz, A. G., & Teodoro, A. J. Antiproliferative and apoptotic effects of probiotic whey dairy beverages in human prostate cell lines. Food Research International Journal 2020; 37: 109450.

(10) Thirabunyanon, M., Boonprasom, P., & Niamsup, P. Probiotic potential of lactic acid bacteria isolated from fermented dairy milks on antiproliferation of colon cancer cells. Journal of Biotechnology Letters 2008; 31 (4): 571–576.

(11) Wang, G., Yu, Y., Wang, Y., Wang, J., Guan, R., Sun, Y., Shi, F., Gao, J., & Fu, X. Role of SCFAs in gut microbiome and glycolysis for colorectal cancer therapy. Journal of Cellular Physiology 2019; 234 (10): 17023-17049.

(12) Dubey, V., Ghosh, A. R., Bishayee, K., & Khuda-Bukhsh, A. R. Appraisal of the anti-cancer potential of probiotic Pediococcus pentosaceus GS4 against colon cancer: in vitro and in vivo approaches. Journal of Functional Foods 2016; 23: 66-79.

(13) Frank, J. A., Reich, C. I., Sharma, S., Weisbaum, J. S., Wilson, B. A., & Olsen, G. J. Critical Evaluation of Two Primers Commonly Used for Amplification of Bacterial 16S rRNA Genes. Journal of Applied and Environmental Microbiology 2008; 74 (8): 2461-2470.

(14) Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. In: Molecular Biology and Evolution. London: Oxford University Press (OUP); 1993.

(15) Kumar, S., Stecher, G., Li, M., Knyaz, C., & Tamura, K. MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across Computing Platforms. Journal of Molecular Biology and Evolution 2018; 35 (6): 1547-1549.

(16) Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 1983; 65 (1-2): 55-63.

(17) Perez-Tomas, R. Multidrug Resistance: Retrospect and Prospects in Anti-Cancer Drug Treatment. Journal of Current Medicinal Chemistry 2006; 13 (16): 1859-1876.

(18) Curigliano, G., Mayer, E. L., Burstein, H. J., Winer, E. P., & Goldhirsch, A. Cardiac Toxicity from Systemic Cancer Therapy: A Comprehensive Review. Journal of Progress in Cardiovascular Diseases 2010; 53 (2): 94-104.

(19) Baghbani-Arani, F., Asgary, V., & Hashemi, A. Cell-free extracts of Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus delbrueckii display antiproliferative and antioxidant activities against HT-29 cell line. Journal of Nutrition and Cancer 2019; 72 (8): 1390-1399.

(20) Eccles, S. A. Parallels in invasion and angiogenesis provide pivotal points for therapeutic intervention. The International Journal of Developmental Biology 2004; 48 (5-6): 583-598.

(21) Hosseini, S. S., Goudarzi, H., Ghalavand, Z., Hajikhani, B., Rafeieiatani, Z., & Hakemi-Vala, M. Anti-proliferative effects of cell wall, cytoplasmic extract of Lactococcus lactis and nisin through down-regulation of cyclin D1 on SW480 colorectal cancer cell line. Iranian Journal of Microbiology 2020; 12 (5): 424-430.

(22) Kim, J. Y., Woo, H. J., Kim, Y. S., Kim, K. H., & Lee, H. J. Cell Cycle Dysregulation Induced by Cytoplasm of Lactococcus lactis ssp. lactis in SNUC2A, a Colon Cancer Cell Line. Journal of Nutrition and Cancer 2003; 46 (2): 197-201.

(23) Khoury, N., El-Hayek, S., Tarras, O., El-Sabban, M., El-Sibai, M., & Rizk, S. Kefir exhibits anti‑proliferative and pro‑apoptotic effects on colon adenocarcinoma cells with no significant effects on cell migration and invasion. International Journal of Oncology 2014; 45 (5): 2117-2127.

(24) Iyer, C., Kosters, A., Sethi, G., Kunnumakkara, A. B., Aggarwal, B. B., & Versalovic, J. Probiotic Lactobacillus reuteri promotes TNF-induced apoptosis in human myeloid leukemia-derived cells by modulation of NF-κB and MAPK signalling. Journal of Cellular Microbiology 2008; 10 (7): 1442-1452.

(25) Xu, W., Liu, L. Z., Loizidou, M., Ahmed, M., & Charles, I. G. (2002). The role of nitric oxide in cancer. Cell Research 2002; 12 (5-6): 311-320.

(26) Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicologic Pathology 2007; 35 (4): 495-516.

(27) Tukenmez, U., Aktas, B., Aslim, B., & Yavuz, S. The relationship between the structural characteristics of lactobacilli-EPS and its ability to induce apoptosis in colon cancer cells in vitro. Journal of Scientific Reports 2019; 9 (1): 1-14.

(28) Cutone, A., Ianiro, G., Lepanto, M. S., Rosa, L., Valenti, P., Bonaccorsi di Patti, M. C., & Musci, G. Lactoferrin in the Prevention and Treatment of Intestinal Inflammatory Pathologies Associated with Colorectal Cancer Development. Cancers 2020; 12 (12): 3806.

(29) Brisbin, J. T., Gong, J., Parvizi, P., & Sharif, S. Effects of Lactobacilli on Cytokine Expression by Chicken Spleen and Cecal Tonsil Cells. Journal of Clinical and Vaccine Immunology 2010; 17 (9): 1337-1343.

(30) Kahouli, I., Malhotra, M., Westfall, S., Alaoui-Jamali, M. A., & Prakash, S. Design and validation of an orally administrated active L. fermentum-L. acidophilus probiotic formulation using colorectal cancer Apc Min/+ mouse model. Journal of Applied Microbiology and Biotechnology 2016; 101 (5): 1999-2019.

آمار
تعداد مشاهده مقاله: 1,919
تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 448


سامانه مدیریت نشریات علمی. طراحی و پیاده سازی از سیناوب