پیوندهای مفید
اخبار و اعلانات
آمار
| تعداد نشریات | 42 |
| تعداد شماره‌ها | 1,537 |
| تعداد مقالات | 12,642 |
| تعداد مشاهده مقاله | 26,045,887 |
| تعداد دریافت فایل اصل مقاله | 10,699,689 |
جذب زیستی و بیوسنتز نانوذرات سرب توسط باسیلوس تروپیکوس جداشده از خاک‌های حاوی پسماندهای الکترونیکی در اصفهان | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| زیست شناسی میکروارگانیسم ها | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مقاله 5، دوره 11، شماره 43، مهر 1401، صفحه 45-69 اصل مقاله (1.96 M) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| نوع مقاله: پژوهشی- فارسی | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| شناسه دیجیتال (DOI): 10.22108/bjm.2022.131079.1423 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| نویسندگان | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| فاطمه معینی1؛ منیر دودی* 2؛ زرین دخت امامی کرونی2؛ مسعود فولادگر3 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1دانشجوی دکتری گروه میکروبیولوژی، دانشکدۀ علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد فلاورجان، اصفهان، ایران | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2استادیار گروه میکروبیولوژی، دانشکدۀ علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد فلاورجان، اصفهان، ایران | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 3دانشیار گروه شیمی، دانشکدۀ علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان، اصفهان، ایران | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| چکیده | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مقدمه: پسماندهای الکترونیکی به بقایای دستگاه‌های الکترونیکی گفته می‌شود که بدون پردازش در خاک دفن می‌شوند و حاوی مواد سمی مانند فلزات سنگین هستند. سرب، یکی از فلزات سنگین موجود در بسیاری از کالاهای الکترونیکی است که در صورت عدم پردازش صحیح کالاها، در خاک جمع می‌شود و سمیت ایجاد می‌کند و ممکن است در غلظت‌های بسیار کم به موجودات زنده آسیب برساند؛ بنابراین هدف از این مطالعه بررسی جذب زیستی سرب توسط باسیلوس تروپیکوس جداشده از خاک‌های حاوی پسماندهای الکترونیکی در اصفهان بود. مواد و روش‌ها: در این مطالعه مقطعی، نمونه‌گیری از خاک‌های آلوده چندین منطقه از تپه‌های گردنه زینل اصفهان انجام شد که محل دفن پسماندهای الکترونیکی است و پس از اندازه‌گیری دما، pH، TOC و میزان فلزات در نمونه خاک‌ها، جداسازی باکتری‌های مقاوم به سرب، انجام و میزان رشد باکتری‌ها در غلظت‌های 5 تا 35 میلی‌مولار سرب بررسی شد. سپس حداقل غلظت ممانعت‌کننده از رشد (MIC) و حداقل غلظت کشندگی (MBC) تعیین شد. بررسی مورفولوژی، آنتی‌بیوگرام و شناسایی مولکولی باکتری مدنظر به روش کلنی - واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، انجام و جذب زیستی باکتری با ICP-OES ارزیابی شد؛ درنهایت، به‌منظور ارزیابی ساخت نانوذرات سرب الگوی XRD، تصاویر SEM و EDS سنجش شدند. داده‌های خام حاصل با نرم‌افزار SPSS، آزمون آماریِ Independent t-test شد. نتایج: براساس یافته‌های این پژوهش، pH خاک مورد ارزیابی 4/9، دمای آن 8/27 درجه سانتی‌گراد، TOC نمونه 8/1 درصد و میزان سرب خاک براساس آنالیز ICP-OES برابرppm 4/658 سنجش شد که به‌طور چشمگیری بالاتر از حد طبیعی بود. سویة باکتریایی جداسازی و شناسایی شده دارای 69/99 درصد قرابت ژنتیکی با باسیلوس تروپیکوس بود که توان بالایی در حذف زیستی سرب (35/56 درصد) داشت. نتایج الگوی XRD، SEM و EDS نشان‌دهندة تبدیل فلز سرب جذبشده به نانوذره بودند. بحث و نتیجه‌گیری: با توجه به اینکه باسیلوس تروپیکوس جداسازی‌شده در این پژوهش، مقاومت و جذب بالایی را نسبت به سرب از خود نشان داد، در آینده پس از حذف ژن‌های مقاومت در برابر آنتی‌بیوتیک‌ها، می‌توان از این سویه به‌عنوان گزینه مناسبی برای حذف زیستی این فلز از پسماندهای الکترونیکی و سایر پسماندهای صنعتی استفاده کرد. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| کلیدواژه‌ها | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| باکتری مقاوم به سرب؛ بیوسنتز نانوذره؛ پسماندهای الکترونیکی؛ جذب زیستی | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| اصل مقاله | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
مقدمه. آلودگی محیط زیست با فلزات سنگین، همراه با پیشرفت صنعتی در سراسر جهان درحال گسترش است. سرب، مس، کروم، کادمیوم و نیکل به‌عنوان متداول‌ترین فلزات سنگین استفاده می‌شوند و گسترش‌یافته‌‌ترین آلاینده‌های محیط زیست شناخته شده‌اند (1). شناسایی این فلزات سنگین به‌عنوان کوفاکتورهای واکنش‌های آنزیمی ضروری است؛ اما مقادیر زیاد آنها به‌دلیل مهار واکنش‌های متابولیکی ممکن است باعث سمیت شدید در موجودات زنده شود. میکروارگانیسم‌ها با چندین فرایند ازجمله انتقال ازطریق غشای سلولی، جذب زیستی از دیواره‌های سلولی و به دام انداختن فلز در کپسول‌های خارج سلولی، رسوب فلز در غشا و دیواره سلولی و واکنش‌های اکسید و احیا به این فلزات سنگین پاسخ می‌دهند (2). در سال‌های اخیر، تصفیه زیستی فلزات سنگین با استفاده از میکروارگانیسم‌ها، هم به‌عنوان یک نوآوری علمی و هم به‌دلیل کاربرد بالقوه آن در صنعت، بسیار شایان توجه محققان قرار گرفته است. به‌طور کلی از میان روش‌های زیستی، تجمع زیستی و جذب زیستی به‌وسیلة میکروارگانیسم‌ها کارایی زیادی در دفع فلزات دارند. تجمع زیستی روشی است که در آن از سلول‌ها و میکروارگانیسم‌های زنده به‌منظور جذب فلزات سنگین استفاده می‌شود و جذب زیستی روشی است که در آن از میکروارگانیسم‌های غیرفعال برای دفع فلزات سنگین از محیط استفاده می‌شود (3, 4). پسماندهای الکترونیکی شامل تجهیزات فرسوده الکترونیکی تجاری و خانگی مانند صفحه‌های نمایشگر رایانه‌ها، موبایل، بی‌سیم و بسیاری از وسایل برقی مانند یخچال، تلویزیون، فریزر، ماشین‌های ظرفشویی و لباسشویی و ... هستند (5). برخی از ترکیبات استفاده‌شده در اجزای الکترونیکی برای انسان سمی‌اند؛ برای مثال، سرب معمولاً در لحیم‌کاری صنایع برق و الکترونیک، باتری‌های اسیدی، اجزای الکترونیکی، روکش سیم‌ها، شیشه‌های لامپ اشعه‌های کاتدی و ... استفاده می‌شود. تماس کوتاه‌مدت با مقادیر بالای سرب می‌تواند باعث ایجاد عوارضی در انسان مانند استفراغ، اسهال، تشنج، کما یا حتی مرگ شود. علائم دیگر آن کاهش اشتها، درد شکم، یبوست، خستگی، بی‌خوابی، تحریک‌پذیری و سردرد است. قرارگرفتن در معرض بیش از حد سرب، مانند یک محیط صنعتی، بر کلیه‌ها تأثیر می‌گذارد و این موضوع به‌طور ویژه برای کودکان خردسال خطرناک است؛ زیرا به اعصاب آسیب می‌رساند و باعث اختلالات در خون و مغز می‌شود (6, 7). رزین‌های تبادل یونی[1] و کربن‌های فعال مدت‌هاست به‌عنوان جاذب‌های تجاری مؤثر برای تصفیه فاضلاب‌های صنعتی حاوی آلاینده‌ها شناخته شده‌اند؛ اما هزینه بالا و کارایی پایین آنها باعث ایجاد محدودیت استفادة تجاری در برنامه‌های حذف صنعتی آنها شده است (4). توانایی میکروارگانیسم‌ها برای جذب فلزات از محلول‌های آبی از اوایل قرن 18 بررسی شده است؛ اما در سه دهه گذشته استفاده از میکروارگانیسم‌ها به‌عنوان جاذب برای حذف و بازیابی فلزات از محلول‌های آبی درخور توجه بوده است (8). بسیاری از میکروارگانیسم‌ها مانند باکتری‌ها، مخمرها و جلبک‌ها می‌توانند فلزات محلول را از محیط اطراف به جسم سلولی خود منتقل کنند و برای حذف موفقیت‌آمیز یون‌های فلزات سنگین استفاده شوند. از مزایای عمده جذب زیستی نسبت به روش‌های صنعتی می‌توان به کم هزینه بودن، کارایی بالا، به حداقل رساندن آلودگیهای شیمیایی، استفادة مجدد از جاذب زیستی و امکان بازیابی فلز اشاره کرد (9). با توجه به مزایای استفاده از باکتری‌ها به‌منظور کاهش آلودگی فلزات سنگین، هدف از این مطالعه بررسی جذب زیستی سرب توسط باکتری باسیلوس تروپیکوس[2] جداشده از خاک‌های حاوی پسماندهای الکترونیکی در شهر اصفهان بود. مواد و روش‌ها. جمع‌آوری نمونه: در مطالعه حاضر، جمع‌آوری نمونه به‌صورت میدانی و در ظرف استریل درپوش‌دار از خاک‌های چندین منطقه تپه‌های گردنه زینل واقع در 36 کیلومتری جنوب شرقی شهر اصفهان به مختصات جغرافیایی51 ͦ 47ʹ39ʹʹE 32 ͦ 36ʹ53ʹʹN انجام شد که محل دفن پسماندهای الکترونیکی است. اندازه‌گیری دمای خاک در محل جمع‌آوری نمونه، اندازه‌گیری pH آن با نسبت خاک به آب 1: 5/2 و میزان کل کربن آلی (TOC[3]) نمونه خاک براساس روش Walkley-Black به‌عنوان روش مرجع با استفاده از دی‌کرومات‌پتاسیم (K2Cr2O2) و H2SO4 غلیظ به‌ترتیب با استفاده از دماسنج جیوه‌ای، دستگاه‌های pHمتر (Metrohm 827, Swiss) و TOC analyzer (Series II ANATOC SGE TM، استرالیا) انجام شد (10, 11). غلظت فلزات با روش طیف‌سنجی انتشار نوری پلاسما به روش القایی ([4]ICP-OES) (Nikon,Japan) تعیین شد. برای اندازه‌گیری میزان سرب در نمونه‌های خاک جمعآوریشده، ابتدا 1 گرم نمونه خاک به بشر 200 میلی‌لیتری انتقال داده شد. سپس مقدار 5 میلی‌لیتر اسید نیتریک غلیظ، 2 میلی‌لیتر اسید کلریدریک و چند قطره اسید سولفوریک غلیظ (همگی با مولاریته 5/0) به آن اضافه و روی هیتر (پارس آزما، ایران) قرار داده شد تا به آرامی تبخیر و به‌طور کامل خشک شود. پس از آن، 100 میلی‌لیتر محلول EDTA[5] 01/0 درصد به آن اضافه و از کاغذ صافی واتمن شماره 4 عبور داده شد. محلول باقی‌مانده حاوی یون‌های فلزی بود که با دستگاه ICP سنجش شد (12). .جداسازی باکتری‌های مقاوم به سرب از نمونه خاک‌های بررسی‌شده: برای اجرای این مرحله از روش انتشار در آگار به‌منظور جداسازی باکتری‌های مقاوم به سرب استفاده شد. در این روش از محیط کشت PHG II آگار حاوی 4 گرم پپتون، 1 گرم عصاره مخمر، 2 گرم گلوکز و 15 گرم آگار استفاده شد که در یک لیتر آب مقطر حل و استریل شد. پس از رسیدن دمای محیط کشت به 55 درجه سانتی‌گراد محلول حاوی نمک نیترات سرب[6] (مرک، آلمان) با غلظت 5 میلی‌مولار به محیط کشت افزوده و پس از اختلاط کامل، pH آن روی 7 تنظیم شد. سپس درون پلیت‌های استریل توزیع شد (12). در ادامه، به‌منظور شمارش تعداد باکتری‌های هتروتروف و مقاوم و برای جداسازی باکتری‌های مقاوم به سرب، 100 میکرولیتر از رقت‌های تهیه‌شده از نمونه خاک به‌ترتیب روی محیط کشت PHG II آگار بدون سرب و PHG II آگار حاوی نمک نیترات سرب با غلظت 5 میلی‌مولار، به‌صورت چمنی کشت داده شد. پلیت‌ها 2 تا 5 روز در دمای 30 درجه سانتی‌گراد، انکوبه و سپس باکتری‌های هتروتروف و مقاوم به سرب شمارش شدند. در ادامه، باکتری‌های مقاوم به نیترات سرب، به‌منظور غنی‌سازی، انتخاب و در محیط کشت PHG II براث حاوی نیترات سرب با غلظت اولیه کشت داده شدند و به مدت 24 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند. پس از این مرحله خالصسازی باکتری‌ها روی محیط کشت PHG II آگار صورت گرفت و به‌منظور نگهداری باکتری‌ها، از محیط کشت PHG IIحاوی فلز به‌صورت شیب‌دار استفاده شد و پس از 24 ساعت انکوباسیون و رشد باکتری‌ها در دمای 30 درجه سانتی‌گراد، در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند (12, 13). .تعیین مقاومت باکتری جداشده نسبت به سرب: برای اجرای این مرحله، مقاومت باکتری‌های جداشده نسبت به غلظت‌های مختلف نیترات سرب (5، 10، 15، 20، 25، 30 و 35 میلی‌مولار) روی محیط کشت جامد سنجیده شد تا ضمن مقایسة میزان مقاومت سویه‌ها به غلظت‌های مختلف سرب، حدود غلظت برای تعیین حداقل غلظت مهارکنندة رشد[7] (MIC) و حداقل غلظت کشنده[8] (MBC) برای هر سویه تعیین شود. در ادامه، از روش انتشار از چاهک در آگار برای بررسی مقاومت جدایه‌های منتخب مقاوم نسبت به سرب استفاده شد. در این روش ابتدا از باکتری‌های مدنظر با غلظت معادل نیم مک فارلند (cfu/ml 108× 5/1) روی پلیت‌های حاوی محیط کشت مولر هینتون آگار (شارلو، اسپانیا) تلقیح شد. سپس چاهک‌هایی در داخل پلیت، تعبیه و داخل هر چاهک 90 میکرولیتر از غلظت‌های 5، 10، 15، 20 و 25 میلی‌مولار نیترات سرب به‌طور جداگانه اضافه شد. از سرم فیزیولوژی استریل برای کنترل منفی و از آنتی‌بیوتیک تتراسایکلین به‌عنوان کنترل مثبت استفاده شد. سپس پلیت‌ها به مدت 24 ساعت در انکوباتور 30 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند و عملیات مذکور برای هر غلظت سه بار تکرار شد. پس از آن، میزان مقاومت باکتری مدنظر در برابر غلظت‌های مختلف فلز سرب در محیط جامد ارزیابی شد (12). .تعیین حداقل غلظت ممانعت‌کننده از رشد (MIC) .و .حداقل غلظت کشندگی (MBC) سرب روی باکتری جداشده: برای تعیین میزان MIC و MBCبا در نظر گرفتن نتایج به‌دست‌آمده از رشد سویه‌ها در غلظت‌های مختلف سرب روی محیط جامد، با توجه به نوع سویه از روش کمی سری رقت لوله‌ای[9] حاوی غلظت‌های 5، 10، 15، 20، 25، 30 و 35 میلی‌مولار نیترات سرب در سه تکرار مستقل استفاده شد. به تمامی لوله‌های دارای محیط کشت لوریا برتانی براث[10] (شارلو، اسپانیا) حاوی غلظت‌های مختلف سرب، سوسپانسیون باکتریایی با غلظتی معادل نیم مک فارلند تلقیح شد. دو لوله به‌عنوان کنترل منفی (محیط کشت فاقد باکتری) و کنترل مثبت (محیط کشت دارای باکتری) در نظر گرفته شدند. لوله‌ها به مدت 24 ساعت در 30 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند. پس از آن، حداقل غلظتی از فلز که مانع رشد باکتری‌ها شد، MIC و غلظتی که هیچ رشدی در آن مشاهده نشد، MBC در نظر گرفته شد. با توجه به نامحلول‌بودن نیترات سرب در محیط مایع، برای اطمینان و تأیید مقادیر MIC و MBC، از کشت چمنی تمام لوله‌ها روی محیط کشت لوریا برتانی آگار (شارلو، اسپانیا) در سه تکرار مستقل از هم استفاده شد. پلیت‌ها پس از 24 ساعت انکوباسیون در دمای 30 درجه سانتی‌گراد بررسی شدند و تعداد کلنی باکتری‌ها شمارش شد (14). .ارزیابی میزان رشد باکتری جداشده مقاوم به سرب: به‌منظور ارزیابی رشد باکتری جداشده در محیط کشت لوریا برتانی براث دارای نمک نیترات سرب نسبت به محیط کشت حاوی باکتری و فاقد فلز (گروه کنترل)، ابتدا سوسپانسیون باکتریایی با غلظت معادل نیم مک فارلند از کشت 24 ساعته باکتری در محیط کشت لوریا برتانی براث (شارلو، اسپانیا) تهیه شد. سپس سه ارلن حاوی محیط کشت لوریا برتانی براث با غلظت‌های نیترات سرب صفر (گروه کنترل)، 5 و 10 میلی‌مولار (غلظت‌های کمتر از MIC) تهیه شدند. درون ارلن‌ها 1 میلی‌لیتر از سوسپانسیون باکتریایی معادل نیم مک فارلند تلقیح شد، به مدت 30 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‌گراد و با دور rpm 150، انکوبه و منحنی رشد باکتری ترسیم شد (14). بررسی مقاومت آنتی‌بیوتیکی: برای بررسی مقاومت آنتی‌بیوتیکی از 24 دیسک آنتی‌بیوتیک رایج کشور، محصول شرکت پادتن طب ایران و محیط کشت مولر هینتون آگار استفاده شد. برای این منظور از کشت ۲۴ ساعته باکتری مدنظر، سوسپانسیونی با کدورت معادل نیم مک فارلند، تهیه و آزمون آنتی‌بیوگرام برای هر نمونه به روش استاندارد دیسک دیفیوژن (کربی بائر[11]) انجام شد (15, 16). .بررسی مورفولوژی جدایة مطالعه‌شده به کمک میکروسکوپ الکترونی روبشی SEM)[12]): به‌منظور مشاهدة تغییرات مورفولوژی سطح سلول جدایة باکتریایی مدنظر، قبل و بعد از جذب نمک نیترات سرب، کشت باکتری در دو محیط کشت لوریا برتانی آگار فاقد نمک فلز (گروه کنترل) و محیط کشت لوریا برتانی آگار دارای نمک نیترات سرب در دمای 30 درجه سانتی‌گراد انجام شد. نمونه‌ها به مدت 2 ساعت با گلوتارآلدئید، تثبیت و سپس با درصدهای مختلف اتانول (30 تا 98 درصد، هرکدام 20-15 دقیقه) آبگیری شدند. در ادامه، نمونه‌ها با دستگاه فریز درایر[13] (Labconco، آمریکا)، خشک و با میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) (ZEISS، آلمان) بررسی شدند (17, 18). .شناسایی مولکولی جدایة باکتریایی مقاوم به سرب: شناسایی مولکولی باکتری منتخب با استفاده از تکنیک Colony-PCR و تعیین توالی ژن 16S rDNA مطابق با دستورالعمل جدول 3 و سیکل حرارتی جدول 2 انجام شد (19). در این مطالعه از آغازگرهای عمومی ساخت شرکت رویان زیست ژن تهران برای تکثیر نواحی حفاظت‌شده از ژن 16S rDNA استفاده شد.
جدول 1- مشخصات آغازگرهای عمومی انتخاب‌شده برای تکثیر ژنوم باکتری‌ها در این مطالعه (20)
جدول 2- سیکل حرارتی استفاده‌شده برای انجام واکنش Colony-PCR
جدول 3- دستورالعمل بهینه‌شده برای انجام آزمایش Colony-PCR
پس از اتمام واکنش، محصول PCR توسط الکتروفورز افقی با ژل آگارز 1 درصد بررسی و سپس تعیین توالی شد. توالی‌های به‌دست‌آمده در پایگاه جهانی ژن NCBI، بررسی و با استفاده از BLAST میزان قرابت ژنی توالی باکتری جداسازی‌شده با دیگر توالی‌های ثبت‌شده در بانک جهانی ژن مقایسه شدند. همچنین، درخت فیلوژنی با استفاده از نرم‌افزار MEGA 7 ترسیم شد (12). جذب و حذف زیستی فلز سرب: به‌منظور مطالعة میزان جذب زیستی فلز سرب توسط جدایة منتخب که بیشترین مقاومت نسبت به سرب را نشان داده بود، ابتدا باکتری جداسازی‌شده در 100 میلی‌لیتر محیط کشت لوریا برتانی براث در یک ارلن، تلقیح و به مدت 24 ساعت در 30 درجه سانتی‌گراد در انکوباتور شیکردار با دور rpm 150 قرار داده شد. بعد از 24 ساعت مجدداً به نسبت 1 درصد حجمی- حجمی، در 100 میلی‌لیتر محیط LB براث حاوی نیترات سرب 15 میلی‌مولار، تلقیح و با شرایط کشت قبل به مدت 48 ساعت انکوبه شد. در این مرحله از نمونه کشت‌های 24 و 48 ساعته روی محیط LB آگار حاوی نیترات سرب کشت داده شد تا از زنده‌بودن باکتری‌ها اطمینان حاصل شود. بعد از رشد باکتری‌ها در ارلن، 1 میلی‌لیتر از این محلول به میکروتیوپ استریل انتقال داده و در دمای 4 درجه سانتی‌گراد و دور rpm 10.000 به مدت 8 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس مایع رویی برای سنجش کاهش فلز سرب نسبت به مقدار اولیه (حذف زیستی فلز از محیط کشت) به دقت جدا و رسوب باقی‌مانده در سرم فیزیولوژی استریل دو بار شستشو داده شد. در هر مرحله مایع رویی حاصل از سانتریفیوژ شامل محیط کشت اولیه و سرم فیزیولوژی در مرحله شستشو جمع‌آوری و رسوب باکتری در دمای 60 درجه سانتی‌گراد به مدت 6 ساعت در فور خشک شد. برای اندازه‌گیری مقدار فلز موجود در رسوب باکتری، 1 میلی‌لیتر اسید نیتریک غلیظ نیم مولار به رسوب، اضافه و به مدت 60 دقیقه، در بن‌ماری 100 درجه سانتی‌گراد حرارت داده شد. سپس با آب مقطر دوبار تقطیر، حجم نهایی به 5 میلی‌لیتر رسانده و برای تعیین میزان جذب فلز توسط باکتری، از طیف‌سنجی نوری پلاسما به روش القایی (ICP-OES) (Nikon,Japan) استفاده شد (12). ظرفیت جذب زیستی سویة منتخب (مقدار فلز در هر گرم زیست جاذب) با استفاده از رابطه زیر (فرمول 1) محاسبه شد (21): m/V (C0-Ce) = ظرفیت جذب زیستی :فرمول 1 که در آن C0: غلظت اولیه فلز (mg/L)، Ce: غلظت نهایی فلز (mg/L)، V: حجم محلول (L) و m: جرم جاذب زیستی یا بیومس (g) بود (21). برای اندازه‌گیری میزان حذف فلز در محیط مایع، از مایع رویی جمعآوریشده در هریک از مراحل جداسازی رسوب باکتری از محیط کشت و دو بار شستشوی آن در سرم فیزیولوژی استفاده شد. به‌ازای هر 1 میلی‌لیتر مایع رویی، 1 میکرولیتر اسید نیتریک، اضافه و مشابه بخش قبل، غلظت فلز توسط ICP-OES اندازه‌گیری شد. برای محاسبه مقدار حذف زیستی فلز سرب از رابطه زیر (فرمول 2) استفاده شد (21): C0/ (C0-Ce)100= درصد حذف زیستی فلز :فرمول 2 که در آن C0: غلظت اولیه فلز (mg/L) و Ce: غلظت نهایی فلز (mg/L) بود (21). آزمون‌ها همگی با سه تکرار انجام شدند. بررسی توانایی جدایه در تولید نانوذره سرب: برای بررسی توانایی تولید نانوذره سرب، تک‌کلنی‌های باکتری باسیلوس تروپیکوس در محیط کشت LB براث فاقد فلز سرب به مدت 24 ساعت و در دمای 30 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. پس از آن، باکتری درحال رشد به نسبت 1 درصد حجمی - حجمی در محیط کشت LB براث حاوی نیترات سرب 15 میلی‌مولار، تلقیح و به مدت 5 روز در دمای 30 درجه سانتی‌گراد و rpm 150 انکوبه شد. سپس محیط کشت حاوی باکتری به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ و مایع رویی دور ریخته شد. برای شستشو و خالصسازی زیست‌تودة باکتری، رسوب باکتری سه مرتبه در 1 میلی‌لیتر آب دیونیزه، حل و مراحل سانتریفیوژ و تخلیه مایع رویی تکرار شد. در ادامه، برای لیزکردن باکتری، 1 میلی‌لیتر آب دیونیزه به تودة زیستی باکتری اضافه و توسط ورتکس به خوبی مخلوط شد و 20 دقیقه در بن‌ماری با دمای 100 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت. سپس مشابه شرایط بالا، سانتریفیوژ و محلول رویی کاملاً دور ریخته و اجازه داده شد تا رسوب باکتری خشک شود (22). به‌منظور بررسی سنتز نانوذرات سرب توسط باکتری مدنظر، علاوه بر مشاهدة ایجاد تغییرات ظاهری در رنگ محیط کشت، سنتز آن در مراحل بعدی با سه روش الگوی پراش اشعه ایکس (XRD[14]) (Asenware AW-DX300، انگلیس)، طیف‌سنجی پراش انرژی پرتو ایکس ([15]EDS) (Tescan mirall، چک) و تصویربرداری با میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) (ZEISS، آلمان) صورت گرفت. به‌منظور شناسایی و تعیین ماهیت بلور نانوذرات سرب سنتزشده توسط باکتری باسیلوس تروپیکوس، از روش الگوی پراش اشعه ایکس (XRD) (Asenware AW-DX300، انگلیس) با دامنه زاویة θ2 از ͦ10 تا ͦ90 استفاده شد. اندازه بلورهای نانوذرات سرب با استفاده از رابطه دبای شرر (فرمول 3) محاسبه شد. :فرمول 3 D=kλ/(β cosθ) در این رابطه، D: اندازه بلورهای نانوذرات، K: ثابت شرر (9/0 تا 1)، λ: طول موج منبع تابش اشعه ایکس، β: پهنای پیک‌ها در نصف ارتفاع ماکزیمم و θ: زاویه بین پرتو تابش و بازتابش است (7). نمونه‌ها پس از تأیید در آزمون‌های اولیه ازنظر تولید نانوذرات سرب، با میکروسکوپ الکترونی روبشی انتخاب شدند و سپس برای تجزیه و تحلیل خصوصیات شیمیایی نانوذره از EDS استفاده شد (23). آنالیز آماری داده‌ها: برای آنالیز آماری داده‌ها از نرم‌افزار آماری SPSS نسخه 16 و آزمون واریانس یک‌طرفه (ANOVA) و برای مقایسة نتایج و تعیین فاصله اطمینان توافقی با خطای استاندارد از نرم‌افزار Excel استفاده شد. نتایج خصوصیات خاک حاوی پسماندهای الکترونیکی: در پژوهش حاضر فاکتورهای فیزیکوشیمیایی و زیستی و نیز غلظت فلزات در خاک حاوی پسماندهای الکترونیکی تپه‌های گردنه زینل اصفهان بررسی شدند. pH خاک مورد ارزیابی 4/9، دمای آن 8/27 درجه سانتی‌گراد و TOC نمونه برابر 8/1 درصد سنجیده شد. میزان سرب موجود در خاک براساس آنالیز نمونه به روش ICP-OES برابرppm 4/658 بود. میزان فلزات و شبهفلزات موجود در یکی از تپه‌های آلوده به پسماندهای الکترونیکی واقع در گردنه زینل اصفهان در جدول 4 نشان داده شده است. .جداسازی و شمارش باکتری‌های هتروتروف و مقاوم به سرب: با توجه به نتایج ICP نمونه خاک مطالعه‌شده (جدول 4) و بالابودن غلظت سرب در آن، احتمال حضور باکتری‌های مقاوم به این فلز وجود داشت که برای رشد در این شرایط سازگاری یافته‌اند. مقایسة تعداد باکتری‌های هتروتروف روی محیط کشت بدون سرب و محیط کشت حاوی نیترات سرب 5 میلی‌مولار در شکل 1 ارائه شده است. تعداد باکتری‌های موجود در یکی از آلوده‌ترین خاک‌های حاوی پسماند الکترونیکی در محیط کشت فاقد سرب (CFU/ml 104 × 530 ± 104 × 7970) به‌طور معناداری بیشتر از تعداد باکتری‌ها در محیط دارای سرب (CFU/ml 104 ×40 ± 104 ×1070) بود (P<0.005). میزان مقاومت جدایة میکروبی منتخب در برابر سرب: براساس نتایج به‌دست‌آمده در این پژوهش، سویة FM3 مقاوم‌ترین سویة باکتریایی نسبت به سرب بود که از تپه‌های آلوده به پسماندهای الکترونیکی واقع در گردنه زینل اصفهان جداسازی شد. از جدایة حاصل، کشت 24 ساعته در حضور غلظت‌های 5 تا 35 میلی‌مولار Pb(NO3)2 در دمای 30 درجه سانتی‌گراد به عمل آمد و قادر به رشد تا غلظت 25 میلی‌مولار از نیترات سرب بود. همچنین مقاومت جدایة FM3 نسبت به غلظت‌های مختلف سرب با روش انتشار از چاهک در آگار بررسی شد و پس از گذشت 24 ساعت از کشت چمنی جدایه در محیط کشت مولر هینتون آگار، نتایج ارزیابی شدند. نتایج نشان دادند باکتری تا غلظت 20 میلی‌مولار کاملاً نسبت به سرب مقاوم است و هاله عدم رشد از غلظت 25 میلی‌مولار در اطراف چاهک مشاهده شد (شکل 2). جدول 4- میزان فلزات و شبهفلزات موجود در یکی از تپه‌های آلوده به پسماندهای الکترونیکی واقع در گردنه زینل اصفهان (آنالیز نمونه به روش ICP-OES)
شکل 1- مقایسة میانگین شمارش باکتری‌های هتروتروف روی دو محیط کشت فاقد سرب و حاوی سرب 5 میلی‌مولار (روی محیط کشت PHG II آگار، انکوباسیون 24 ساعته در دمای 30 درجه سانتی‌گراد) شکل2- نمایش مقاومت جدایة FM3 نسبت به غلظت‌های مختلف نیترات سرب با روش چاهک‌گذاری در آگار (روی محیط کشت مولر هینتون آگار، انکوباسیون 24 ساعته و دمای 30 درجه سانتی‌گراد) .میزان MIC و MBC سرب روی باکتری جداشده: حداقل غلظت ممانعت‌کننده (MIC) و حداقل غلظت کشنده (MBC) نیترات سرب روی باکتری جداشده با روش سری رقت لوله‌ای اندازه‌گیری شد. میانگین مقادیر MIC و MBC برای این جدایة مورد مطالعه به‌ترتیب برابر با 9/0± 3/24 و 3/2± 3/28 میلی‌مولار بود. همان‌طور که در قسمت روش کار ذکر شد، برای اطمینان و تأیید مقادیر MIC و MBC، از کشت چمنی لوله‌های حاوی غلظت‌های متفاوت نیترات سرب و سوسپانسیون باکتری در سه تکرار استفاده شد که شمارش تعداد کلنی باکتری‌ها نتایج مشابهی را نشان داد. تعداد کلنی‌ها حاکی از مهار رشد وابسته به غلظت فلز بود (شکل 3). منحنی رشد جدایة مطالعه‌شده: منحنی رشد باکتری منتخب در حضور دو غلظت 5 و 10 میلی‌مولار به‌عنوان غلظت‌های کمتر از MIC و MBC در مقایسه با محیط فاقد نیترات سرب در محیط کشت LB براث در مدت زمان انکوباسیون 30 ساعت و دمای 30 درجه سانتی‌گراد بررسی شد. شکل 3- تعداد کلنی‌های جدایة FM3 براساس غلظت‌های مختلف Pb(NO3) 2 (روی محیط کشت لوریا برتانی آگار، انکوباسیون 24 ساعته در دمای 30 درجه سانتی‌گراد) شکل 4- منحنی رشد جدایة FM3 در محیط کشت لوریا برتانی براث و دمای 30 درجه سانتی‌گراد (* در این منحنی کنترل [ctrl] نشان‌دهندة رشد باکتری در محیط فاقد نیترات سرب است) منحنی رشد جدایة FM3، مطابق شکل 4، نشان داد با افزایش غلظت سرب، رشد باکتری به‌صورت چشمگیری کاهش می‌یابد و این کاهش میزان رشد وابسته به غلظت سرب است. مشاهدات نشان دادند با افزایش غلظت سرب، مرحله تأخیری رشد افزایش یافته و فاز لگاریتمی رشد باکتری نیز با شیب کمتر و تأخیر بیشتر نسبت به گروه کنترل همراه بوده است. فاز لگاریتمی رشد باکتری در عدم حضور فلز سرب پس از 1 ساعت شروع شده بود؛ درحالی‌که شروع فاز رشد لگاریتمی باکتری در حضور فلز تا حداقل 4 ساعت به تأخیر افتاده بود (شکل 4). نتایج آنتی‌بیوگرام جدایة مطالعه‌شده: آزمون تعیین حساسیت باکتری منتخب در برابر 24 آنتی‌بیوتیک رایج کشور براساس روش دیسک دیفیوژن (کربی - بائر) و تست آنتی‌بیوگرام برای جدایة مقاوم به سرب انجام شد. نتایج این بررسی نشان دادند باکتری جداسازی‌شده در مجاورت با برخی از آنتی‌بیوتیک‌ها مانند آمپی‌سیلین، آموکسی‌سیلین، آموکسی‌کلاو، سفتازیدیم، سفالکسین، سفوتاکسیم، سفپیم، سفوکسیتین، متی‌سیلین و پنی‌سیلین مقاوم بود و در برابر سایر آنتی‌بیوتیک‌ها نیمه‌حساس تا حساس بود. تمام آزمایش‌ها با سه تکرار انجام شدند (شکل 5 و 6). شکل 5- نتایج آنتی‌بیوگرام جدایة FM3 در برابر 24 آنتی‌بیوتیک رایج AM: Ampicilin, AMC: amoxicillin, AMX: amoxiclov, AN: Amikacin, CAZ: ceftazidime, CC: Clindamycin, CF: Cefalotin, CN: cephalexin, CO: Chloramphenicol, CP: ciprofloxacin, CRO: Ceftriaxone, CTX: Cefotaxime, E: Erythromycin, FEP: Cefepime, FOX: Cefoxitin, GM: Gentamycin, IPM: Imipenem, ME: Methicillin, NB: Novobiocin, P: Penicillin, RA: Rifampin, SXT: Trimethoprim-sulphamethoxazole, TE: Tetracycline, V: Vancomycin شکل 6- تصاویر آزمون آنتی‌بیوگرام جدایه FM3 نسبت به برخی از دیسک‌های آنتی‌بیوتیک رایج کشور .تغییرات مورفولوژی سطح جدایة مطالعه‌شده براساس تصاویر SEM: مورفولوژی سطح این باکتری با میکروسکوپ الکترونی روبشی قبل و بعد از تیمار با نمک نیترات سرب تجزیه و تحلیل شد. همان‌طور که در شکل 7 الف مشاهده می‌شود، سلول‌های FM3 قبل از قرارگرفتن در معرض سرب، صاف و کشیده‌اند؛ درحالی‌که در مجاورت سرب، مورفولوژی باکتری کاملاً تغییر می‌کند، دیواره سلول‌های باکتری درحال تخریب دیده می‌شود و تغییراتی مانند تورم و کوتاه‌ترشدن سلول باکتری و نامنظمی زیاد و چین و چروک در سلول‌ها مشاهده می‌شود (شکل 7 ب).
شکل 7- تصویر SEM از FM3 در عدم حضور (الف) و حضور نیترات سرب (ب) شناسایی مولکولی جدایة مطالعه‌شده: پس از جداسازی، خالصسازی و تعیین مقاومت سویة منتخب نسبت به فلز سرب و آنتی‌بیوتیک‌ها، مراحل شناسایی مولکولی این سویه انجام شد. بررسی مورفولوژی این جدایه به کمک رنگ‌آمیزی گرم در زیر میکروسکوپ نوری نشان داد باکتری جداشده، باسیل گرم مثبت و دارای آرایش زنجیره‌ای بود (شکل 8 الف). برای شناسایی مولکولی سویه، ابتدا تکثیر ژن 16S rDNA توسط آغازگرهای عمومی (27F و1492R ) و تکنیک کلنی-PCR، انجام و محصول آن روی ژل آگارز 1 درصد بررسی شد. باند مدنظر با طول 1500 جفت‌باز مشاهده شد (شکل 8 ب). تعیین توالی تکثیرشده از ژن مدنظر با روش سنگر توسط شرکت رویان زیست ژن تهران، انجام و در ادامه با استفاده از نرم‌افزار وب بلاست (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) بانک جهانی ژن (NCBI) شناسایی شد. مقایسة توالی‌ها با استفاده از سرور بلاست نشان داد سویة FM3، با 69/99 درصد شباهت، سویه‌ای از باسیلوس تروپیکوس است. درخت فیلوژنی این سویه براساس توالی ژن 16S rDNAو روش Neighbor- Joining با نرم‌افزار MEGA 7 رسم و مشخص شد جایگاه سویة FM3 در میان گونه‌های خانواده باسیلاسه است (شکل 9). اطلاعات درخت فیلوژنی نیز تشابه ژنتیکی بالای FM3 با باسیلوس تروپیکوس را تأیید کرد. این سویه با شماره دسترسی MZ292029 در پایگاه NCBI ثبت شد.
شکل 8- الف) تصویر میکروسکوپی سویة FM3 ب) الکتروفورز محصول PCR سویة FM3روی ژل آگارز با آغازگرهای عمومی 27F و 1492R و مشاهده باند 1500 bp (ستون‌ها از چپ به راست به‌ترتیب مربوط به Ladder، سویة FM3، کنترل مثبت [یک Bacilus sp.] و کنترل منفی است)
شکل 9- درخت فیلوژنی سویة FM3 براساس توالی 16S rDNA با روش Neighbourjoining. مقادیر Bootstrap مبتنی بر 1000 تکرار است که در کنار گره‌ها نشان داده شده است. توالی Staphylococcus fleurettii GTC 1919 به‌عنوان خارج از گروه در نظر گرفته شده است.
.جذب و حذف زیستی فلز سرب توسط باکتری باسیلوس تروپیکوس: شمارش باکتری‌ها به‌منظور بررسی زنده‌بودن و قدرت رشد و تکثیر طی مرحله جذب زیستی، در زمان اولیه و نهایی در شکل 10 ارائه شده است. نتایج نشان دادند این باکتری در شرایط آزمایشگاهی به‌عنوان جاذب زیستی عمل می‌کند و تعداد باکتری‌ها در مرحله جذب زیستی درحال افزایش بود. بررسی حذف زیستی فلز سرب با روش ICP-OES در جدایة مطالعه‌شده با استفاده از فرمول 2 در بخش مواد و روش‌ها نشان داد باکتری جداشده توانایی بالایی در حذف فلز سرب (35/56 درصد) داشت. نتایج این بررسی در جدول 5 ارائه شده‌اند. .بررسی توانایی و تأیید تولید نانوذرات سرب توسط باسیلوس تروپیکوس: همان‌طور که اشاره شد، نشانه اولیه تولید نانوذرات سرب براساس تغییر رنگ محیط کشت باکتری پس از کشت پنج روزه به‌دلیل تغییر ماهیت فلز به‌صورت نانوذره بود که در شکل 11 به وضوح مشخص است. شکل 10- شمارش باکتری باسیلوس تروپیکوس برحسب CFU/ml در دو مرحله ابتدا و انتهای جذب زیستی جدول 5- حذف زیستی فلز سرب توسط باسیلوس تروپیکوس
شکل 11- تغییر رنگ محیط کشت حاوی فلز سرب از شفاف (الف) به کدر، (ب) طی سنتز نانوذره توسط باسیلوس تروپیکوس، (ج) رسوب محیط کشت برای اطمینان از تولید و بررسی خصوصیات شیمیایی این نانوذرات، آنالیز XRD انجام شد. شکل 12 الگوی XRD ساختارهای نانوذرات سنتزشده توسط باسیلوس تروپیکوس را نشان می‌دهد.
شکل 12- الف) تصویرXRD برای نانوذرات سرب سنتزشده، ب) تصویر SEM نانوذرات سرب سنتزشده، ج) آنالیز عنصری نانوذرات سرب سنتزشده با تکنیک EDS نتایج پراش اشعه ایکس حضور ساختار بلوری نانوذرات سرب را تأیید کرد. این الگوی پراش دارای پیک‌هایی در زوایای ͦ90/20، ͦ85/24، ͦ 25، ͦ30/27، ͦ 45/30، ͦ 35/34، ͦ60/40، ͦ 44، ͦ 49 و ͦ 59 به‌ترتیب مربوط به سطوح 50، 92، 113، 97، 80، 102، 49، 58، 57 و 58 بود که نشان‌دهندة تشکیل کریستال سرب با دو ترکیب 2PbCO3·Pb(OH)2 و Pb4(SO4)(CO3)2(OH)2 است. این نتایج با داده‌های مرجع نانوکریستال‌های سرب JCPDS NO.00-001-0687 و JCPDS NO.01-085-1422 همخوانی داشت (24). تجزیه و تحلیل XRD برای تولید نانوذرات سرب شناسایی‌شده حاکی از آن بود که شدیدترین پیک در ͦ 4/34= θ2 و پهنای نصف ارتفاع حداکثری (FWHM[xvi]) معادل 467/0= β قرار داشت که با توجه به رابطه دبای شرر در فرمول 3 در بخش روش‌ها، اندازه کریستال‌های نانوذرات سرب به‌طور تقریبی 18 نانومتر به دست آمد (شکل 12 الف). بررسی تصاویر SEM حضور نانوذرات سرب را در توده سلولی باکتری تأیید کرد. تصاویر به‌دست‌آمده نشان داد ذرات به‌طور عمده به شکل کروی و در برخی نواحی به‌صورت انباشته یا پراکنده کنار هم قرار داشتند و با توجه به مقیاس تصویر، قطر متوسط آنها 50 نانومتر برآورد شد (شکل 12 ب). برای آنالیز عنصری میکروسکوپی، به‌طور تصادفی ذرات، انتخاب و با تکنیک EDS آنالیز شدند. عناصر سرب، گوگرد، کربن و اکسیژن در نمونه شناسایی شدند که با ترکیبات شناسایی‌شده در XRD مطابقت داشتند. میزان سرب شناسایی‌شده، بیش از دیگر عناصر و برابر 2/57 درصد وزنی بود (شکل 12 ج). بحث و نتیجه‌گیری پسماندهای الکترونیکی جزء زباله‌های درحال رشد در جهان‌اند که به‌دلیل صحیح‌نبودن تکنیک‌های فرآوری در خاک تجمع می‌یابند. مطالعات پیشین نشان می‌دهند باکتری‌هایی مانند تیوباسیلوس[xvii]ها و قارچ‌هایی مانند آسپرژیلوس نایجر[xviii] و پنیسیلیوم سیمپلیسیموم[xix] در تجمع فلزات از ضایعات الکترونیکی و الکتریکی نقش دارند (25). تحقیقات برخی از محققان نشان داده است از باسیلوس سابتیلیس[xx] و باسیلوس سرئوس[xxi] به‌دلیل داشتن ظرفیت بالای جذب سرب استفاده شده است (6). سلول‌ها ممکن است با فرایندی که به‌عنوان تجمع زیستی شناخته می‌شوند و برای بسیاری از فلزات ازجمله سرب گزارش شده‌اند، یون‌های فلزی را بگیرند و آنها را روی سطح یا درون سلول خود رسوب دهند. باکتری‌های مقاوم به سرب از مکانیزم‌های مقاومت مختلفی مانند مکانیزم تجزیة خارج سلولی، جذب زیستی، ته‌نشینی، تغییر در مورفولوژی سلول، تولید سیدروفور و تجمع زیستی سرب درون سلولی استفاده می‌کنند (26). میکروارگانیسم‌ها مانند باکتری‌ها، کپک‌ها، مخمرها و جلبک‌ها با جذب روی سطح سلول یا تجمع و پیچیده‌شدن درون سلول، یون‌های فلزی سمی را به حالت غیرسمی کاهش می‌دهند (4). با توجه به خطرات زیست‌محیطی فلزات، حذف آنها به‌ویژه به روش‌های زیستی اهمیت دارد که بیشترین سازگاری را با محیط زیست دارند. جداسازی و شناسایی باکتری‌های مقاوم به فلز سرب با قابلیت جذب و حذف زیستی از پسماندهای الکترونیکی در شهر اصفهان از اهداف این پژوهش بود. همان‌طور که در جدول 4 اندازه‌گیری اولیه فلزات و شبهفلزات نمونه‌های جمعآوریشده از خاک‌های آلوده تپه‌های گردنه زینل اصفهان نشان می‌دهد، میزان سرب موجود در یکی از آلوده‌ترین خاک‌های واجد پسماندهای الکترونیکی براساس آنالیز ICP-OES برابرppm 4/658 بود؛ درحالی‌که مطابق استاندارد جهانی غلظت سرب برای خاک‌های سطحی به‌طور متوسط ppm 32 و از ppm 67-10 متغیر است (27) و این بدان معناست که میزان سرب در نمونة جمعآوریشده بیش از 20 برابر میانگین سرب در خاک‌های جهانی است که دفن پسماند الکترونیکی در آن منطقه را توجیه می‌کند. جداسازی باکتری باسیلوس تروپیکوس از این خاک با مطالعات مشابه مطابقت داشت و وجود باکتری جداسازی‌شده در این خاک با فلز سرب بالا، نشان‌دهندة سازگاری زیستی و مقاومت بالای آن به فلز سرب است. ژانگ و همکاران[xxii] نیز در تحقیقات خود به جدایه‌های تحمل‌کنندة سرب ازجمله باکتری‌های آسینتوباکتر[xxiii]، رالستونیا[xxiv]، کوماموناس[xxv] و کرایزوباکتریوم[xxvi] در خاک‌های حاوی پسماندهای الکتریکی و الکترونیکی اشاره کرده‌اند (28). در مطالعه‌ای دیگر سجادیان و همکاران[xxvii] باکتری‌های مقاوم به سرب مانند پروتئوس میرابیلیس[xxviii]، باسیلوس سرئوس، باسیلوس فانیکولوس[xxix] و زنورهابدوس[xxx] را از خاک‌های آلوده به نفت جداسازی و شناسایی مولکولی کردند (12). از دیگر مناطق آلوده به سرب، جایگاه‌های سوختگیری (پمپ بنزین‌ها) است که کفیل‌زاده و همکاران[xxxi] باکتری‌های مقاوم به سرب شامل باکتری‌های باسیلوس، سودوموناس[xxxii]، کورینه باکتریوم[xxxiii]، استافیلوکوکوس[xxxiv] و اشریشیا کلی[xxxv] را از چنین مکان‌هایی جداسازی و شناسایی کردند (29). از دیگر منابع تولید و توزیع آلودگیهای فلز سرب، پساب کارخانجات صنعتی است که ابراهیمی و آهنی‌آذری[xxxvi] در مطالعه‌ای ویژگی‌های هشت جدایة مقاوم به سرب جداشده از پساب کارخانجات شهرک صنعتی آق‌قلا را بررسی کردند (15). در مطالعة حاضر میانگین مقادیر MIC و MBC برای باکتری منتخب باسیلوس تروپیکوس با استفاده از روش کمی سری رقت لوله‌ای به‌ترتیب برابر با 9/0±3/24 و 3/2±3/28 میلی‌مولار به دست آمد (16). راجا و همکاران[xxxvii] در سال 2006 سویه‌هایی را به‌عنوان مقاوم در نظر گرفته بودند که از رشد آنها در غلظت 1/0 میلی‌مولار فلز سرب ممانعت نشده بود (30). کفیل‌زاده و همکاران نیز گزارش دادند مقاوم‌ترین باکتری‌های جداسازی‌شده دارای MIC برابر با 5/12 میلی‌مولار استات سرب بودند (29). مالیک و همکاران[xxxviii] گزارش دادند سویه‌های باکتریایی جداشده از خاک‌های صنعتی قادر به تحمل غلظت سرب تا حد 23/7 میلی‌مولار بودند (31). نمونه‌های باکتریایی جداسازی‌شده از خاک‌های آلوده به فلزات سنگین گزارش‌شده توسط ابوشناب و همکارانش[xxxix] تا غلظت 15 میلی‌مولار به سرب مقاوم بودند (32). سلمانی و همکاران[xl] سه جدایة باکتریایی متعلق به جنس باسیلوس را جداسازی کردند که قادر به تحمل غلظت نیترات سرب تا 15 میلی‌مولار بودند (33). کوهی دهکردی و همکاران[xli] با بررسی باکتری‌های ریزوسفری در معدن سرب و روی باما در منطقۀ ایرانکوه استان اصفهان نشان دادند از بین پنج گونة باسیلوس شناسایی‌شده، باسیلوس سرئوس بیشترین میزان مقاومت (با MIC معادل 09/5 میلی‌مولار) را نشان داد و پس از آن، باسیلوس آمیلولیکئی‌فاسینس[xlii] قرار گرفت (34). محسنی و همکاران[xliii] با شناسایی ده جدایه از پساب کارخانجات چرم ورامین، غلظت سرب قابل رشد را 2 تا 9 میلی‌مولار سرب گزارش کردند (35). عباسی و همکاران[xliv] با جداسازی و شناسایی باکتری‌های مقاوم به سرب از پساب شهری اهواز، حداقل غلظت بازدارندة سرب توسط باسیلوس لاتروسپروس[xlv] و یرسینیا سودوتوبرکلوزیس[xlvi] را 300 میلی‌گرم بر لیتر گزارش دادند (14). آلبوغبیش و همکاران[xlvii] نیز با مطالعة پساب فاضلاب شهری و پساب کارگاه مسگری شاهین‌شهر اصفهان سه جدایة کلبسیلا اکسی توکا[xlviii]، رنی باکتریوم سالموناریوم[xlix] و رودوکوکوس اکوئی[l] را از پساب مسگری جدا کردند که MIC برای هر سه باکتری معادل 4 میلی‌مولار محاسبه شد. همچنین، باکتری‌های آسینتوباکتر جونی[li]، نایسریا موکوزا[lii] و اشریشیا کلی از تصفیه‌خانة فاضلاب جداسازی شدند که MIC آنها نسبت به فلز سرب به‌ترتیب 8، 12 و 4 میلی‌مولار بود (36). افه و همکاران[liii] در سال 2020 با 8 گونة باکتری از جنس باسیلوس دریافتند باسیلوس تروپیکوس بیشترین مقاومت را نسبت به فلز مس با MIC معادل 1400 میلی‌گرم بر لیتر نشان داده بود (37). مقادیر بالاتر MIC در پژوهش حاضر نسبت به سایر مطالعات مشابه حاکی از مقاومت بیشتر سویة مطالعه‌شده نسبت به فلز سرب است. براساس منحنی رشد این سویه در شکل 4، افزایش غلظت فلز سرب، رشد باکتری را به‌صورت وابسته به غلظت کاهش داد و سبب کندشدن مرحله تأخیری شد. این نتایج با مقایسة شمارش باکتری در محیط حاوی نیترات سرب نسبت به محیط کشت فاقد این فلز در شکل 1 و حاوی غلظت‌های مختلف نیترات سرب در شکل 3 مطابقت داشت. فلز سرب باعث ایجاد سمیت و کاهش رشد در باکتری می‌شود؛ اما همان‌طور که در دو شکل 4 و 10 نشان داده شده است، رشد باسیلوس تروپیکوس جداسازی‌شده در حضور فلز سرب نشان‌دهندة سازگاری زیستی و تحمل سمیت آن است. کاهش تعداد باکتری‌ها در محیط دارای فلز سرب نسبت به محیط کشت فاقد فلز سرب (گروه کنترل) در منحنی رشد (شکل 4) به‌علت سمیت فلز سرب بود که امری طبیعی و قابل انتظار است؛ کفیل‌زاده و همکاران نیز چنین نتایجی را گزارش کرده‌اند (29). در تحقیق اسمکالوا و همکاران[liv] تعداد باکتری‌ها در محیط کشت حاوی سرب بسیار کمتر از تعداد باکتری‌ها در محیط کشت کنترل گزارش شده است (38). نتایج مربوط به رشد باکتری در حضور سرب در این پژوهش نیز نشان‌دهندة رشد باکتری مقاوم به سرب باوجود سمیت فلز است (شکل 4). در پژوهش حاضر، براساس شکل 8-الف با تصاویر به‌دست‌آمده از میکروسکوپ نوری مشخص شد جدایة FM3 باسیل گرم مثبت است و در شناسایی مولکولی، همان‌طور که در شکل 9 مشخص است، قرارداشتن جایگاه سویة FM3 در میان گونه‌های خانوادة باسیلاسه ثابت شد. تصاویر SEM در شکل 7، تغییرات مورفولوژیکی باکتری پس از مجاورت با فلز سرب ازجمله تورم، کوتاه و نامنظم شدن دیواره سلولی باکتری را نشان می‌دهد. مطابق با تحقیقات محققان، این تغییرات مورفولوژیکی سطح باکتری ممکن است به‌دلیل رسوب سرب در اطراف سطح سلول و مرتبط با گروه‌های عملکردی آنها باشد. همچنین، برخی از محققان اشاره کرده‌اند این تغییرات احتمالاً هنگامی رخ می‌دهد که نمونه‌ها در معرض محلول فلزات سنگین قرار گرفته باشند و یون‌های این فلزات ممکن است جایگزین برخی از کاتیون‌های موجود در ماتریکس دیواره سلولی باکتری‌ها شده باشند و پیوند متقابل قوی‌تری را ایجاد کنند؛ درنتیجه، به‌دلیل مکانیسم تبادلات یونی، یون‌های فلزات سنگین مکان‌های اتصال آزاد موجود را اشغال می‌کنند (17, 39, 40). مطالعة گایاتری و همکاران[lv] نیز به این موضوع اشاره دارد. آنها تغییرات مورفولوژیکی باسیلوس لیکنی فرمیس[lvi] جداشده از خاک حاوی پسماند الکترونیکی را قبل و بعد از قرارگرفتن در معرض سرب بررسی کردند و اظهار داشتند اندازة سلول‌های باکتریایی در حضور سرب کاهش می‌یابد (41) که با تغییرات مورفولوژیکی باسیلوس تروپیکوس جداشده از خاک حاوی پسماند الکترونیکی در پژوهش حاضر، پس از مجاورت با فلز سرب مطابقت دارد (شکل 7). در تحقیق لوگاسکاس و همکاران[lvii]، باسیلوس‌ها به‌عنوان فراوان‌ترین باکتری‌های گرم مثبت در خاک‌های آلوده به سرب شناسایی شدند که نشان‌دهندة مقاومت این جنس نسبت به فلز سرب بود. همچنین، ادعا شده بود باکتری‌های مقاوم به سرب با یک فسفاتاز و پروتئین انتقال‌دهنده قادرند در مناطق آلوده به این فلز سنگین بقا یابند. درواقع باسیلوس‌ها یون‌های سرب را به‌صورت رسوب نمک فسفات تحمل می‌کنند (42). در پژوهش حاضر نیز براساس شناسایی مولکولی، مقاوم‌ترین باکتری جداسازی‌شده در برابر سرب از جنس باسیلوس‌ها بود. درخت فیلوژنی این سویه براساس توالی ژن 16S rDNAو روش Neighbor- Joining با نرم‌افزار MEGA 7 رسم و مشخص شد جایگاه سویة FM3 در میان گونه‌های خانوادة باسیلاسه است (شکل 9). اطلاعات درخت فیلوژنی نیز تشابه ژنتیکی بالای FM3 (قرابت 69/99 درصدی) با باسیلوس تروپیکوس (MCCC 1A01406) را تأیید کرد. جذب زیستی فلزات و انباشت آن در بیومس باکتری و حذف فلزات از محیط کشت باکتری، قدرت زیست پالایی میکروارگانیسم را بیان می‌کند و شایان توجه پژوهشگران این حوزه است. همان‌گونه که در شکل 10 مشخص است، بررسی پتاسیل جذب زیستی فلز سرب توسط باکتری باسیلوس تروپیکوس جداسازی‌شده از پسماندهای الکترونیکی از تپه‌های زینل در شهر اصفهان نشان داد این باکتری در محیط کشت حاوی نیترات سرب می‌تواند به رشد خود به‌صورت فعال ادامه دهد و به‌عنوان یک جاذب زیستی عمل کند. نتایج خوانده‌شده توسط دستگاه ICP-OES نشان دادند این باکتری توانایی حذف فلز سرب را تا 35/56 درصد نسبت به مقدار اولیه دارد که در جدول 5 آمده‌اند. برای تعیین ماهیت فلز تجمع‌یافته در باکتری طی فرایند جذب زیستی، بررسی سه پارامتر تغییرات کدورت محیط کشت، آنالیز XRD و تصاویر SEM در کشت پنج روزه در حضور نمک نیترات سرب 15 میلی‌مولار انجام شد. مشاهدة کدورت قابل توجه در کشت پنج روزه در مطالعات، نشانة اولیه تولید نانوذرات براساس تغییر رنگ محیط کشت است و دلیل آن تغییر ماهیت مواد به‌صورت نانوذره مطرح می‌شود (43, 44) که این کدورت در شکل 11 مشاهده می‌شود. شکل 12-الف، آنالیز XRD ساختارهای کریستالی نانوذرات سنتزشده توسط باسیلوس تروپیکوس را نشان داد و تشکیل کریستال سرب با دو ترکیب 2PbCO3·Pb(OH)2 و Pb4(SO4)(CO3)2(OH)2 منطبق بر داده‌های مرجع نانوکریستال‌های سرب با اندازة تقریبی کریستال‌های نانوذرات 18 نانومتر را تأیید کرد. نتایج تصاویر SEM نیز حضور نانوذرات سرب را با قطر متوسط 50 نانومتر تأیید کرد که در شکل 12-ب مشاهده می‌شود. همچنین، در آنالیز عنصری میکروسکوپی، با تکنیک EDS عناصر سرب، گوگرد، کربن و اکسیژن در نمونه شناسایی شدند که با ترکیبات شناسایی‌شده در XRD مطابقت داشتند و میزان سرب شناسایی‌شده 2/57 درصد وزنی مشخص شد که در شکل 12-ج نشان داده شده است. در تعدادی از مطالعات محققان اشاره شده است که حذف زیستی فلزات سنگین بالاتر از 50 درصد توسط انواع میکروارگانیسم‌ها درخور توجه است (37, 45) که با نتایج حاصل از پژوهش حاضر (جدول 5) مطابقت دارد. عباسی و همکاران با مطالعه روی باکتری‌های مقاوم به سرب و حذف این فلز از پساب شهری گزارش دادند باکتری‌های باسیلوس لاتروسپروس و یرسینیا سودوتوبرکولوزیس به‌عنوان باکتری‌های مقاوم از پساب شهری جداسازی و شناسایی شدند که درصد حذف فلز سرب از پساب غنی‌شده با 100 میلی‌گرم در لیتر سرب توسط باکتری‌های باسیلوس لاتروسپروس و یرسینیا سودوتوبرکولوزیس به‌ترتیب 60/50 و 70/45 درصد محاسبه شده بود (14). تونالی و همکاران[lviii] در سال 2005 نشان دادند سویه جاذب سرب جداشده توسط آنها متعلق به جنس باسیلوس بوده و دارای حداکثر ظرفیت جذب سرب برابر با 92/27 میلی‌گرم بر گرم در غلظت اولیه 250 میلی‌گرم بر لیتر بوده است (46). رای و همکاران[lix] نیز جذب سرب توسط باکتری باسیلوس سرئوس را بررسی کردند و نشان دادند با افزایش غلظت محلول فلزی، درصد جذب سرب کاهش یافته بود. درنهایت، بالاترین مقدار جذب سرب توسط این باسیلوس برابر با 96 درصد با میزان 1 درصد تلقیح بیومس تر در محلول حاوی 50 میلی‌گرم بر لیتر از یون سرب حاصل شده بود (47). سید و چینتالا[lx] جذب زیستی سرب توسط سه باکتری باسیلوس لیکنی فورمیس، باسیلوس سرئوس و باسیلوس سابتیلیس از نمونه خاک را به‌ترتیب 9/78، 87 و 5/85 درصد گزارش کردند که تجزیه و تحلیل SEM-EDS در این تحقیق جذب فلز سرب را تأیید کرده بود (48). گایاتری و همکاران در تحقیق خود نشان دادند باسیلوس لیکنی فرمیس جداشده از خاک پسماند الکترونیکی دارای قابلیت جذب زیستی سرب است و با افزایش غلظت سرب از ppm 10 به ppm 25، درصد جذب سرب توسط باکتری از 94/74 درصد به 39/89 درصد افزایش یافت (41). پپی و همکاران[lxi] نیز با مطالعة باسیلوس جداشده از رسوبات رودخانه سارنو در خلیج ناپل ایتالیا نشان دادند این جدایه نسبت به سرب با حداقل غلظت بازدارندگی (MIC) 8/4 میلی‌مولار مقاوم است. همچنین، آنالیز ICP نشان داد پس از تلقیح سرب به محیط کشت با غلظت‌های 48/0 و 2/1 میلی‌مولار، بازدهی حذف باکتری به‌ترتیب 02/31 و 21/28 درصد محاسبه شد. بررسی SEM-EDS نیز جذب زیستی فعال این فلز توسط سلول‌های باکتریایی را تأیید کرد (49). چینتالاپودی و همکاران[lxii] نیز در تحقیق خود نتایج مشابه با نتایج پژوهش حاضر را داشتند و با بررسی جذب زیستی فلز سرب و تشکیل ساختارهای نانوذره توسط باکتری استاندارد باسیلوس سابتیلیس، نشان دادند باسیلوس سابتیلیس 60 درصد پتانسیل جذب زیستی داشت. آنها تولید نانوذره را با طیف‌سنجی پراش انرژی پرتو ایکس (EDS)، میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) و ICP بررسی و تأیید کردند. نتایج EDS نشان دادند بیشترین عنصر در نانوذرات جذبشده با 7/41 درصد وزنی مربوط به سرب بوده است (23). در پژوهش حاضر نیز براساس آنالیز عنصری میکروسکوپی با EDS در شکل 12-ج مشخص شد میزان سرب شناسایی‌شده، بیش از دیگر عناصر و برابر 2/57 درصد وزنی بود. مطالعات نشان می‌دهد جذب سرب در طول فرایند جذب زیستی ازطریق تبادل یونی، پیچیده‌شدن و زیست معدنی شدن صورت می‌گیرد (50). در مطالعات میر و همکاران[lxiii] مشخص شد Pb2+ توسط ویبریو هاروی[lxiv] به PbHPO4، Pb9(PO4)6 یاPbS تبدیل شده است (51). کیائو و همکاران[lxv] در مطالعه‌ای جذب زیستی سرب توسط زیست‌تودة باسیلوس سابتیلیس جداشده از خاک معدن سرب در چین را بررسی کردند که با به‌کارگیری روش‌هایSEM-EDS و XRD تشکیل نانوذرات سرب را تأیید و محصولات متعدد زیست معدنیPb2Pb5(PO4)3OH ، Pb10(PO4)6(OH)2 و Pb5(PO4)3Cl را گزارش کردند (52). نتایج به‌دست‌آمده از پژوهش حاضر نیز با این مطالعات مطابقت دارند و با بررسی توسط XRD، SEMو EDS مشخص شد Pb2+ توسط سویة باسیلوس تروپیکوس جداشده از خاک‌های حاوی پسماند الکترونیکی به 2PbCO3·Pb(OH)2 و Pb4(SO4)(CO3)2(OH)2 تبدیل شد. این نتایج در شکل 12 نشان داده شده‌اند و با سایر مطالعات انجام‌شده در این زمینه مطابقت دارند؛ زیرا گروه‌های عاملی دیواره سلولی باکتری‌ها همچون گروه‌های هیدروکسیل، سولفیدریل، کربوکسیل و فسفات که بار منفی دارند، می‌توانند با کاتیون‌های فلزی مانند Pb2+ واکنش دهند و این مکانیسم در جذب زیستی فلزات توسط میکروارگانیسم‌ها مؤثر است (53). نتایج این پژوهش نشان دادند باکتری جداشده از خاک‌های پسماندهای الکترونیکی تپه‌های زینل واقع در جنوب شرقی اصفهان مقاوم به فلز سرب بوده و از پتانسیل بالایی برای حذف این فلز برخوردار است. با توجه به اینکه فلز سنگین سرب عمده آلودگی ایجادشده توسط پسماندهای الکترونیکی است، می‌توان پیشنهاد داد پس از حذف ژن‌های مقاومت در باکتری باسیلوس تروپیکوس، این باکتری در آینده گزینه مناسبی برای جذب و حذف زیستی سرب از پسماندهای الکترونیکی و سایر پسماندهای صنعتی خواهد بود. جذب فلزات سنگین از انواع پسماندها توسط انواع میکروارگانیسم‌های مقاوم به انواع فلزات سنگین می‌تواند راه‌حل مفیدی برای رفع مشکل زیست‌محیطی ناشی از انواع فلزات سنگین سمی باشد که با فراهم‌کردن بستر و شرایط مناسب برای رشد میکروارگانیسم‌های مذکور، می‌توان از آنها برای سمیت‌زدایی و حذف این فلزات از محیط زیست استفاده کرد. سپاسگزاری این مقاله مستخرج از پایان‌نامه دکتری با کد 172481282350005162285062 است که در آزمایشگاه تحقیقاتی دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان انجام شده است. نویسندگان این مقاله از مسئولان محترم دانشکده علوم زیستی و آزمایشگاه تحقیقاتی این دانشگاه به‌دلیل همکاری‌های لازم و حمایت‌های اجرایی کمال تشکر و امتنان را دارند.
[1]- Ion Exchange Resins [2]- Bacillus tropicus [3]- Total Organic Carbon [4]- Inductively Coupled Plasma - Optical Emission Spectrometry [5]- Ethylenediaminetetraacetic acid [6]- Pb(NO3)2 [7]- Minimum Inhibitory Concentration [8]- Minimum Bactericidal Concentration [9]- Macrodilution [10]- Luria Bertani broth (LB broth) [11]- Disk diffusion (Kirby bauer) [12]- Scanning Electron Microscopy [13]- Freeze dryer [14]- X-ray diffraction [15]- Energy-dispersive X-ray spectroscopy [xvi]- Full-Width at Half-Maximum [xvii]- Thiobacillus [xviii]- Aspergillus niger [xix]- Penicillium simplissimum [xx]- Bacillus subtilis [xxi]- Bacillus cereus [xxii]- Zhang et al. [xxiii]- Acinetobacter [xxiv]- Ralstonia [xxv]- Comamonas [xxvi]- Chryseobacterium [xxvii]- Sajadian et al. [xxviii]- Proteus mirabilis [xxix]- Bacillus funiculus [xxx]- Xenorhabdus [xxxi]- Kafilzadeh et al. [xxxii]- Pseudomonas [xxxiii]- Corynebacterium [xxxiv]- Staphylococcus [xxxv]- Escherichia coli [xxxvi]- Ebrahimi and Ahani Azari [xxxvii]- Raja et al. [xxxviii]- Malik et al. [xxxix]- Abou-Shanab et al. [xl]- Salmani et al [xli]- Koohi Dehkordi et al. [xlii]- Bacillus amyloliquefaciens [xliii]- Mohseni et al. [xliv]- Abbasi et al. [xlv]- Bacillus laterosporus [xlvi]- Yersinia pseudotuberculosis [xlvii]- Alboghobeysh et al. [xlviii]- Klebsiella oxytoca [xlix]- Renibacterium salmoninarum [l]- Rhodococcus equi [li]- Acinetobacter junii [lii]- Neisseria mucosa [liii]- Efe et al. [liv]- Smejkalova et al. [lv]- Gayatri et al. [lvi]- Bacillus licheniformis [lvii]- Lugaskas et al. [lviii]- Tunali et al. [lix]- Ray et al. [lx]- Syed and Chinthala [lxi]- Pepi et al. [lxii]- Chintalapudi et al. [lxiii]- Mire et al. [lxiv]- Vibrio harveyi [lxv]- Qiao et al. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مراجع | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
آمار تعداد مشاهده مقاله: 1,221 تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 282 |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||