بررسی اثر لاکتوفریسین به‌دست‌آمده از لاکتوفرین بر باکتری‌های استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس آئروژینوزا

مقدمه.

امروزه مطالعات گسترده‌ای دربارة ترکیبات شیر انواع حیوانات شیرده مانند گاومیش، گوسفند، بز و  شتر و اثرات تغذیه‌ای آن در انسان صورت گرفته است. شیر شتر به‌عنوان یک منبع پروتئینی غنی (9/4-5/2 درصد) و همچنین وجود اسیدهای چرب غیراشباع بالا (43 درصد)، داشتن اثرات ضدسرطانی^[1]، کاهش‌دهندة آلرژی^[2] و اثر ضددیابتی^[3] شایان توجه قرار گرفته و به تازگی نیز به‌عنوان یک جایگزین برای کودکانی پیشنهاد شده است که حساسیت به شیر گاو دارند. تعداد پپتیدهای فعال زیستی شناسایی‌شده و مشتق‌شده از پروتئین‌های شیر درحال افزایش است (2،1).

عمل ضدمیکروبی در ایمنی ذاتی توسط پروتئین‌ها و پپتیدهای ضدمیکروبی مختلف انجام می‌شود که به‌صورت تکاملی حفظ شده‌اند (6-3).

لاکتوفرین^[4] جزء اصلی شیر و یک گلیکوپروتئین متصل به آهن است که در بیشتر ترشحات برون‌ریز مانند شیر، اشک، ترشحات بینی، بزاق، ادرار، ترشحات رحمی و مایعات آمنیوتیک^[5] یافت می‌شود (9-7).

همچنین لاکتوفرین در گرانول‌های ثانویه نوتروفیل‌ها^[6] یافت شده است (10).

محققان دریافته‌اند لاکتوفرین هضم‌شده توسط پپسین فعالیت ضدمیکروبی قوی‌تری نسبت به پروتئین بومی دارد. پپتید ضدمیکروبی مشتق‌شده از لاکتوفرین، لاکتوفریسین^[7] نامیده می‌شود. لاکتوفریسین برای اولین‌بار توسط تومیتا و همکاران^[8] با اثر پپسین معده بر لاکتوفرین گاوی جدا شد که متعلق به گروه متنوعی از پپتیدهای ضدمیکروبی کاتیونی است و در ناحیه N ترمینال لاکتوفرین قرار دارد و در بسیاری از عملکردهای دیگر لاکتوفرین نیز نقش دارد (12،11).

پپتیدهای ضدمیکروبی، پپتیدهای کوچکی هستند که فعالیت آنتی‌بیوتیکی گسترده‌ای را علیه
باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی مختلف، قارچ‌ها، تک‌یاخته‌ها و ویروس‌ها نشان می‌دهند (19-13).

ظهور و انتشار سویه‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک‌ها به‌ویژه سویه‌های بیمارستانی استافیلوکوکوس اورئوس^[9] و سودوموناس آئروژینوزا^[10] در سراسر جهان افزایش یافته و به اپیدمی جهانی درآمده است؛ ازاین‌رو، جستجو برای یافتن جایگزین‌های ضدمیکروبی مناسب ضروری است (21،20).

با توجه به اینکه فعالیت ضدمیکروبی لاکتوفرین در تحقیقات به اثبات رسیده است، مطالعه حاضر برای ارزیابی بررسی اثر لاکتوفریسین به‌دست‌آمده از لاکتوفرین بر باکتری‌های سودوموناس آئروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس انجام گرفت.

مواد و روش‌ها.

خالص‌سازی لاکتوفرین: خالص‌سازی لاکتوفرین شیر شتر پس از چربی‌زدایی (توسط سانتریفوژ و عبور از کاغذ صافی) با استفاده از کروماتوگرافی تعویض یونی سی‌ام سفادکس سی 50^[11] انجام شد. برای تأیید از الکتروفورز ژل پلی‌آکریل‌آمید^[12] و آزمایش تترامتیل بنزیدین^[13]، استفاده و میزان پروتئین به روش برادفورد اندازه‌گیری شد. برای افزایش غلظت لاکتوفرین فراکسیون‌ها لیوفیلیزه شدند (22،23).

تهیه لاکتوفریسین: برای به دست آوردن لاکتوفریسین، لاکتوفرین در آب مقطر با غلظت 5 درصد (w/v)، حل و برای رسیدن به 3=pH، اسید کلریدریک 1 نرمال، افزوده و پپسین با غلظت نهایی 3 درصد (w/w سوبسترا) اضافه شد. سپس هیدرولیز در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 4 ساعت انجام شد. واکنش با حرارت‌دادن در دمای 80 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه خاتمه یافت و برای رسیدن به 7=pH، هیدروکسید سدیم 1 نرمال افزوده شد. رسوب تشکیل‌شده ازطریق سانتریفوژ برداشته و مایع رویی لیوفیلیز و نگهداری شد. برای تأیید از SDS-PAGE با استفاده از پلی آکریل آمید 20 درصد و رنگ‌آمیزی نیترات نقره استفاده و پروتئین به روش برادفورد اندازه‌گیری شد (24).

تهیه سوش باکتریایی: باکتری‌های سودوموناس آئروژینوزا (ATCC27853) و استافیلوکوکوس اورئوس (ATCC25923) از مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی شعبه شمال شرق، تهیه و تعداد باکتری‌ها^[14] اندازه‌گیری شدند و از رقت‌های 10⁶، 10⁷ و 10⁸ استفاده شد (18،24).

.بررسی اثر غلظت‌های مختلف لاکتوفریسین بر .باکتری‌های استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس آئروژینوزا: اثر غلظت‌های 10، 15 و 30 میکروگرم بر میلی‌لیتر لاکتوفریسین بر رشد و تکثیر استافیلوکوکوس اورئوس و اثر غلظت‌های 10، 25 و 45 میکروگرم بر میلی‌لیتر لاکتوفریسین بر رشد و تکثیر سودوموناس آئروژینوزا از ساعت‌های 0 تا 24 (به فاصله هر دو ساعت) بررسی شد. در این بررسی تعداد باکتری استافیلوکوکوس اورئوس، 10⁵×33، 10⁶×33 و 10⁷×33 بر میلی‌لیتر و تعداد باکتری سودوموناس آئروژینوزا، 10⁴×5/15، 10⁵×5/15 و 10⁶×5/15 بر میلی‌لیتر است. از محیط BHI^[15] برای رشد باکتری‌ها به میزان 100 میکرولیتر برای هر چاهک استفاده شد. به‌منظور مقایسه کنترل رشد برای استافیلوکوکوس اورئوس از 10⁵×33، 10⁶×33 و 10⁷×33 باکتری بر میلی‌لیتر، فسفات بافر سالین^[16] و BHI و به‌منظور مقایسه کنترل رشد برای سودوموناس آئروژینوز از 10⁴×5/15، 10⁵×5/15 و 10⁶×5/15 باکتری بر میلی‌لیتر، فسفات بافر سالین و BHI استفاده شد (25،2).

آنالیز داده‌ها: به‌منظور تجزیه و تحلیل آماری روی یافته‌های به‌دست‌آمده، ابتدا با استفاده از نرم‌افزار گراف پد پریسم 9^[17] آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه^[18]، انجام و ازنظر آماری مقادیر 05/0> P معنی­دار در نظر گرفته شد. در صورت وجود اختلاف معنی­دار میان گروه­ها به‌منظور تفکیک گروه­هایی که با یکدیگر اختلاف معنی­دار داشتند، از آزمون توکی^[19] استفاده شد. نمودارها توسط نرم‌افزار اکسل^[20] رسم شدند.

نتایج

نتایج خالص‌سازی لاکتوفرین: شیر شتر پس از چربی‌زدایی با استفاده از کروماتوگرافی تعویض یونی خالص شد. در SDS-PAGE باندهای پروتئینی حدود 80 کیلودالتونی مشاهده شد (شکل 1) و میزان پروتئین 433 میکروگرم بر میلی‌لیتر به دست آمد. نتایج آزمایش TMB نشان دادند فراکسیون‌های 6/0، 7/0 و 8/0 لاکتوفرین است.

شکل 1- باند پروتئینی حدود 80 کیلودالتونی لاکتوفرین

نتایج تهیه لاکتوفریسین: در SDS-PAGE باندهای پروتئینی حدود 6 کیلودالتونی مشاهده شد (شکل 2) که نشان‌دهندة لاکتوفریسین نسبتاً خالص بوده است و میزان پروتئین 5/74 میکروگرم بر میلی‌لیتر به دست آمد.

شکل 2- باند پروتئینی حدود 6 کیلودالتونی لاکتوفریسین با استفاده از ژل پلی اکریل آمید ۲۰ درصد و رنگ‌آمیزی نیترات نقره

.نتایج بررسی اثر غلظت‌های مختلف لاکتوفریسین بر .باکتری‌های استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس آئروژینوزا: براساس نتایج، لاکتوفریسین میزان رشد استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس آئروژینوزا را در مقایسه با گروه کنترل کاهش داد. نتایج حاصل از بررسی آماری غلظت‌های 5، 8 و 15 میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر لاکتوفریسین روی 3 رقت 10⁶، 10⁷ و 10⁸ باکتری استافیلوکوکوس اورئوس و غلظت‌های 5، 13 و 23 میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر لاکتوفریسین روی ۳ رقت 10⁶، 10⁷ و 10⁸ سودوموناس آئروژینوزا در تصویر به‌صورت گروه یک، دو و سه بیان شده است. نتایج نشان دادند کاهش رشد در تمام رقت‌های استافیلوکوکوس اورئوس پس از تیمار با غلظت ۵ میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر لاکتوفریسین موجب کاهش رشد شد؛ اما در بررسی آماری معنی‌دار نبود. تأثیر غلظت ۸ میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر بر رقت‌های 10⁶ و 10⁷ استافیلوکوکوس اورئوس معنی‌دار بود (p<0/05) و غلظت ۱۵ میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر لاکتوفریسین باعث کاهش رشد هر سه رقت باکتریایی شد. با افزایش رقت باکتری‌ها، اثربخشی لاکتوفریسین نیز کاهش یافت. همچنین کاهش میزان جذب در تمام رقت‌های سودوموناس آئروژینوزا پس از تیمار با غلظت ۵ میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر لاکتوفریسین موجب کاهش رشد شد؛ اما معنی‌دار نبود. غلظت ۱۳ میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر لاکتوفریسین، روی رقت‌ 10⁶ سودوموناس آئروژینوزا معنی‌دار بود و باعث کاهش رشد شد (p<0/05). همچنین تأثیر لاکتوفریسین بر رقت‌های 10⁷ و 10⁸ سودوموناس آئروژینوزا معنی‌دار بود و در مقایسه با گروه کنترل باعث کاهش رشد شد (p<0/01). غلظت ۲۳ میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر لاکتوفریسین نیز روی رقت‌های 10⁶، 10⁷ و 10⁸ سودوموناس آئروژینوزا معنی‌دار بود و باعث کاهش رشد شدند که مقادیر معنی‌داری به‌ترتیب p<0/01، p<0/05 و p<0/001 بودند (جدول 1 و شکل 5).

میزان درصد مهارکنندگی در غلظت‌های ۸ و ۱۵ میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر لاکتوفریسین به‌ترتیب در محدوده ۱۹ تا ۴۱ درصدی و ۲۶ تا ۴۸ درصدی مشاهده شد (شکل 3).

غلظت‌های ۱۳ و ۲۳ میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر لاکتوفریسین به‌ترتیب موجب مهار ۳۵ تا ۴۳ درصدی و ۴۲ تا ۵۰ درصدی سودوموناس آئروژینوزا شدند (شکل 4).

در شکل 5 مقایسه میزان رشد استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس آئروژینوزا پس از تیمار با غلظت‌های 15 و ۲۳ میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر در مقایسه با گروه کنترل آورده شده است.

جدول 1- تأثیر مهار رشد باکتری‌های مطالعه‌شده پس از تیمار با غلظت‌های مختلف لاکتوفریسین در مقایسه با گروه کنترل

شکل 3- مقایسه درصد مهار رشد باکتری استافیلوکوکوس اورئوس توسط لاکتوفریسین

میزان درصد مهارکنندگی در غلظت‌های ۸ و ۱۵ میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر لاکتوفریسین به‌ترتیب در محدوده ۱۹ تا ۴۱ درصدی و ۲۶ تا ۴۸ درصدی مشاهده شد.

شکل 4- مقایسه درصد مهار رشد باکتری سودوموناس آئروژینوزا توسط لاکتوفریسین

غلظت‌های ۱۳ و ۲۳ میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر لاکتوفریسین به‌ترتیب موجب مهار ۳۵ تا ۴۳ درصدی و ۴۲ تا ۵۰ درصدی سودوموناس آئروژینوزا شدند.

شکل 5- مقایسه میزان رشد استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس آئروژینوزا پس از تیمار با غلظت‌های 15 و 23 میکروگرم بر میلی‌لیتر لاکتوفریسین در مقایسه با کنترل‌ها

بحث و نتیجه‌گیری

مصرف بی‌رویه آنتی‌بیوتیک‌ها سبب به وجود آمدن سویه‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک و تهدیدی برای سلامت تبدیل شده است و تحقیق را برای توسعه عوامل ضدمیکروبی جدید لازم می‌کند (20،26).

پپتیدهای ضدمیکروبی مجموعه وسیعی از مولکول‌های تولیدشده توسط موجودات زنده هستند که موانع طبیعی در برابر عفونت‌اند. لاکتوفرین نقش مهمی در سیستم ایمنی ذاتی دارد و به‌عنوان یک مولکول مهم دفاعی میزبان به شمار می‌رود. پپتیدهای مشتق‌شده از لاکتوفرین، نظیر لاکتوفریسین و لاکتوفرامپین، اثرات ضدمیکروبی قوی‌تری نسبت به پروتئین کامل از خود نشان می‌دهند؛ به‌ویژه، لاکتوفریسین فعالیت ضدباکتریایی، ضدقارچی، ضدویروسی و ضدانگلی قوی با کاربردهای امیدوارکننده برای پیشگیری و درمان را نشان داده است (25،27).

لاکتوفریسین یک پپتید مشتق‌شده از لاکتوفرین است و تحقیقات انجام‌شده اثرات ضدمیکروبی این پپتید را نشان می‌دهد. لاکتوفریسین از هضم لاکتوفرین توسط پپسین شناسایی شد. این پپتید طیف متنوعی از فعالیت‌های بیولوژیکی ازجمله فعالیت‌های آنتی‌اکسیدانی، تعدیل سیستم ایمنی، تعدیل رشد سلولی و اتصال و مهار چندین ترکیب زیست‌فعال مانند لیپوپلی‌ساکارید را دارد (25،24،18،2).

نتایج مطالعه حاضر نشان می‌دهند لاکتوفریسین شتر در شرایط آزمایشگاهی کاهش رشد سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس را باعث شده است. غلظت‌های ۱۳ و ۲۳ میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر لاکتوفریسین در بازه زمانی ۲۴ ساعته به‌صورت وابسته به دوز موجب مهار رشد سودوموناس آئروژینوزا در مقایسه با گروه کنترل و غلظت‌های ۸ و ۱۵ میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر لاکتوفریسین موجب مهار رشد استافیلوکوکوس اورئوس در مقایسه با گروه کنترل شدند؛ با این حال، غلظت ۵ میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر لاکتوفریسین تأثیر معنی‌داری بر کاهش رشد استافیلوکوکوس اورئوس نداشته است. همچنین براساس نتایج، کاهش رشد در استافیلوکوکوس اورئوس وابسته به دوز بود؛ به صورتی که با افزایش غلظت لاکتوفریسین میزان مهار رشد نیز افزایش یافت. این مشاهدات نشان داد لاکتوفریسین برای ممانعت از رشد و بقای عوامل بیماری‌زا می‌تواند مفید باشد.

در پژوهش برونی و همکاران^[xxi]، لاکتوفریسین به‌عنوان یک عامل ضدباکتریایی قوی‌تر از لاکتوفرین معرفی شد. در این پژوهش مقایسه فعالیت لاکتوفریسین گونه‌های مختلف (گاو، موش و بز) نشان داد لاکتوفریسین گاوی^[xxii] اثر ضدمیکروبی بیشتری دارد. این محققان بیان کردند MIC لاکتوفریسین گاوی در برابر سویه‌های اشریشیا کلی^[xxiii] حدود 30 میکروگرم بر میلی‌لیتر بوده است؛ درحالی‌که MIC لاکتوفریسین انسانی^[xxiv] 100 میکروگرم بر میلی لیتر است (25).

نتایج پژوهش واکابایاشی و همکاران^[xxv] نشان دادند لیستریا مونوسیتوژنز توسط لاکتوفریسین مهار و غیرفعال می‌شود. این محققان نشان دادند در شرایط مختلف، لاکتوفریسین اثربخشی مشابه بسیاری از آنتی‌بیوتیک‌هایی را نشان می‌دهد که باعث مهار رشد لیستریا مونوسیتوژنز در غلظت‌های کمتر از 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر می‌شود. علاوه بر این، لاکتوفریسین باعث از بین رفتن سریع و برگشت‌ناپذیر بقای هر چهار سویه لیستریا مونوسیتوژنز مدنظر شد (24).

نتایج پژوهش بلامی و همکاران^[xxvi] نشان دادند طیف گسترده‌ای از باکتری‌های گرم منفی و گرم مثبت توسط لاکتوفریسین مهار و غیرفعال می‌شوند (18).

در پژوهش فارنود و همکاران^[xxvii] نشان داده شد لاکتوفریسین انسانی و لاکتوفریسین گاوی پپتیدهای ضدمیکروبی هستند که از ناحیه N ترمینال لاکتوفرین گاوی و لاکتوفرین انسانی مشتق شده‌اند و فعالیت ضدمیکروبی بیشتری دارند (28).

همچنین در پژوهش هو و همکاران^[xxviii] بیان شد لاکتوفریسین به غشای سلولی نفوذ می‌کند و فعالیت‌های درون سلولی دارد. نتایج نشان دادند لاکتوفریسین تحمل اشریشیا کلی را در برابر محرک‌های محیطی کاهش می‌دهد و با تأثیر مستقیم بر فسفوریلاسیون سیستم دو جزئی^[xxix] از رشد باکتری‌ها جلوگیری می‌کند (29).

کاتیلا و همکارانش^[xxx] اثر ضدباکتریایی غلظت‌های 67/0، 67/1 و 67/2 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر لاکتوفرین بر ایزوله‌های اشریشیا کلی، استافیلوکوکوس اورئوس و استافیلوکوک‌های کواگولاز منفی^[xxxi] و همچنین بر سودوموناس آئروژینوزا و کلبسیلا پنومونیه جداشده از پستان گاو را بررسی کردند. بیشترین فعالیت بازدارندگی علیه اشریشیا کلی و سودوموناس مشاهده شد. همچنین لاکتوفرین اثر چشمگیری بر حداکثر جذب (014/0 = p) استافیلوکوکوس اورئوس داشت؛ درحالی‌که هیچ اثر معنی‌داری برای CNS مشاهده نشد (30).

در مطالعات اولیه، محققان علت مهار رشد باکتری‌ها توسط لاکتوفرین و لاکتوفریسین را کسب آهن ضروری از محیط بیان کردند؛ اما یافته‌های جدیدتر برهمکنش‌های سلولی گسترده‌تری را دخیل می‌دانند. لاکتوفریسین با برهمکنش مستقیم با قسمت لیپید A در لیپوپلی‌ساکارید باکتری‌های گرم منفی و آسیب‌رساندن به غشای باکتری موجب تغییر در نفوذپذیری غشای خارجی و آزادسازی لیپوپلی‌ساکارید^[xxxii] می‌شود (31).

ایجاد دپلاریزاسیون و متعاقب آن از دست دادن یکپارچگی غشای داخل سیتوپلاسمی، مکانیسم اصلی لاکتوفریسین برای مرگ سلولی در باکتری‌های مدنظر می‌تواند باشد (32).

مکانیسم ضدمیکروبی لاکتوفریسین علیه باکتری‌های گرم مثبت، همانند لاکتوفرین می‌تواند به‌دلیل برهمکنش آن با اسید لیپوتیکوئیک باشد که به کاهش بار منفی در غشا منجر می‌شود؛ در این صورت لیزوزیم به پپتیدوگلیکان دسترسی پیدا می‌کند و سبب ایجاد منفذ در باکتری می‌شود (33).

با بررسی‌‌های انجام‌شده مشخص شد در جهان تحقیقات بسیار کمی انجام گرفته و در ایران نیز تحقیقی انجام نشده است. با توجه به خاصیت ضدمیکروبی لاکتوفریسین، بررسی بیشتر پپتیدهای مشتق‌شده از لاکتوفرین و بررسی تأثیر آنها بر عوامل بیماری‌زا و استفاده درمانی آنها پیشنهاد می‌شود.

سپاسگزاری

از حمایت‌های مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی شعبه شمال شرق و جناب آقای دکتر حسین زحمتکش برای یاری‌های ارزنده‌شان طی پژوهش حاضر سپاسگزاری می‌شود.

[1]- Anti-Cancer

[2]- Allergy Reducer

[3]- Anti-Diabetic

[4]- Lactoferrin (LF)

[5]- Amniotic Fluid

[6]- Neutrophils Secondary Granules

[7]- Lactoferricin (LFcin)

[8]- Tomita et al.

[9]- Staphylococcus aureus

[10]- Pseudomonas aeruginosa

[11]- CM-Sephadex C-50

[12]- Polyacrylamide Gel Electrophoresis PAGE) SDS-PAGE)

[13]- TMB=Tetramethylbenzidine

[14]- CFU=Colony Forming Unit

[15]- Brain Heart Infusion

[16]- PBS=Phosphate-Buffered Saline

[17]- GraphPad Prism 9

[18]- ANOVA one-way

[19]- Tukey

[20]- Excel

[xxi]- Bruni et al.

[xxii]- bLfcin

[xxiii]- E.coli

[xxiv]- hLfcin

[xxv]- Wakabayashi et al.

[xxvi]- Bellamy et al.

[xxvii]- Farnaud et al.

[xxviii]- Ho et al.

[xxix]- Two-component Systems (TCS) 

[xxx]- Kutila et al.

[xxxi]- CNS

[xxxii]- LPS=Lipopolysaccharide