شناسایی ساختار جمعیت دو اندوفیت قارچی Fusarium sp. وThielavia sp. و فراوانی مکانی-زمانی آنها در بافت‌های مختلف شش گونة گیاه هالوفیت

مقدمه

نخستین‌بار گیاه‌شناس آلمانی دی‌باری^[1] (8) کلمه «اندوفیت^[2]» را ارائه داد. اندوفیت‌ها معمولاً به‌عنوان گروهی از میکروارگانیسم‌ها تعریف می‌شوند که بدون ایجاد علائم بیماری در بافت‌های داخلی گیاه و به‌صورت همزیست با گیاه زندگی می‌کنند (16). اندوفیت‌ها تا به امروز تقریباً از همه بافت‌های گیاهی جداسازی شده‌اند (36). اندوفیت‌ها که بخش عمده‌ای از آنها را قارچ‌ها تشکیل می‌دهند، پتانسیل فوق‌العاده‌ای برای بهره‌برداری در گیاهان دارند (19). تاکنون تنها بخش کمی از اندوفیت‌های موجود در گیاهان شناسایی شده‌اند (39). عوامل زنده و غیرزندة متعددی بر ترکیب جوامع اندوفیتی موجود در گیاهان تأثیر می‌گذارند. یکی از مهم‌ترین این عوامل، گونة گیاه‌ میزبان (در سطوح پایین‌تر الگوی ژنتیکی گیاه میزبان) و مرحله رشدی آن و دیگری محیطی است که اندام گیاه در آن فعالیت دارد (مانند خاک برای اندوفیت‌های ریشه)؛ با این حال، این اثرات ممکن است بین اکوسیستم‌های مجزا متفاوت باشند (22).

گیاهان دارای اندوفیت‌های قارچی علاوه بر توانایی جذب بهتر مواد غذایی و رشد و عملکرد بالاتر، قادر به تحمل بیشتر تنش‌های زنده و غیرزنده مانند تنش شوری، خشکی و گرما نسبت به گیاهان فاقد اندوفیت‌اند (30). گونه‌های اندوفیت قارچی، در بیشتر گونه‌های گیاهی ساکن زیستگاه‌های مختلف یافت می‌شوند (43). آنها می‌توانند در بافت‌های ریشه، ساقه و برگ مستقر شوند (47) و طیف گسترده‌ای از همیاری با گیاهان را به نمایش بگذارند (31). اندوفیت‌های قارچی محتوای چندین ماده مغذی مهم در بافت‌ها را تغییر می‌دهند و نقش مهمی در دفاع از گیاه دارند (1).

تحقیقات دربارة جوامع اندوفیتی در میزبان نشان داده است به‌طورکلی می‌توان تعداد زیادی از گونه‌های قارچی را پس از استریل‌سازی سطح از بافت‌های گیاهی جداسازی کرد (13). در همه گونه‌های گیاهی بررسی‌شده، به‌طورکلی الگوی جوامع اندوفیتی ارتباط مستقیمی با الگوی جغرافیایی توزیع گونه‌های گیاهی میزبان آنها دارد (33)؛ برای مثال، جوامع اندوفیتی در گونه‌های گیاهی میزبان که در یک مکان رشد می‌کنند، مشابه‌اند؛ اما تفاوت‌های چشمگیری در میزان غنا و توزیع گونه‌های قارچی در بافت‌های مختلف گیاه میزبان وجود دارد. سن گیاه میزبان نیز ممکن است بر غنا و توزیع گونه‌های اندوفیت قارچی تأثیر بگذارد (11). میزان کلونیزاسیون بالاتر قارچ اندوفیت را می‌توان در ایستگاه‌های همگن با کانوپی^[3] بسته مشاهده کرد. ممکن است بین ارتفاع یا آب‌وهوای مرطوب با جمعیت اندوفیت‌ها همبستگی وجود داشته باشد (27). جمعیت اندوفیت‌ها از گونه‌ای به گونة دیگر و از گیاهی به گیاه دیگر متفاوت است (10). در همان گونه، جمعیت اندوفیت علاوه بر اینکه ممکن است از یک منطقه به منطقه دیگر منحصربه‌فرد باشد، با تغییر شرایط آب‌وهوایی در همان منطقه نیز متفاوت است (10). محققان تلاش کرده‌اند مکانیسم‌های مولکولی مؤثر در ایجاد جوامع اندوفیت در گیاهان را روشن کنند؛ اما اطلاعات بسیار محدودی در این زمینه در دسترس است (37). شواهدی وجود دارند که نشان می‌دهند سایه نسبت به نور باعث افزایش تراکم اندوفیت در بافت برگ شش گونة چمن شد (7). همان‌گونه که می‌دانیم تنوع زیستی موجودات توزیع یکنواختی ندارند و توزیع آنها در مناطق مختلف، بسیار متفاوت است و عواملی مانند دما، بارش، ارتفاع، خاک، جغرافیا و وجود گونه‌های دیگر بر نوع تنوع آنها اثرگذارند (4). در این مطالعه، تنوع زیستی اندوفیت‌های قارچی در شش گونة گیاه هالوفیت^[4] در مناطق مختلف استان هرمزگان بررسی شد.

مواد و روش‌ها

جمع‌آوری گیاهان هالوفیت: برای اجرای این تحقیق، ابتدا مناطق رویش گونه‌های گیاهی هالوفیت در استان هرمزگان با استفاده از منابع موجود ازجمله فلور ایرانیکا، هرباریوم موجود در مرکز تحقیقات، آموزش کشاورزی و منابع طبیعی استان هرمزگان (هرباریوم) و سایت‌های جهانی (15) و مقالات منتشرشده انجام گرفت. اسامی گونه‌های مورد مطالعه در هر منطقه و اطلاعات جغرافیایی مربوط به هر رویشگاه در جدول 1 ذکر شده‌اند؛ بر همین اساس، نمونه‌برداری از 20 منطقة استان هرمزگان در دو فصل تابستان و زمستان 1397 انجام شد.

جداسازی اندوفیت قارچی

آماده‌سازی محیط کشت دکستروز آگار (PDA): 39 گرم ماده مغذیPDA  (QLAB آلمان) در 1000 میلی‌لیتر آب مقطر، حل و سپس محیط کشت در اتوکلاو (با دمای 121 درجه سانتی‌گراد و فشار 2/1 اتمسفر) قرار داده شد. پس از نیمه سرد شدن، محیط کشت به پتری‌‌دیش‌های (فرازبین - ایران) 8 سانتی‌متری به میزان یک چهارم ریخته شد (17).

جداسازی و خالص‌سازی: استریل‌سازی و جداسازی قارچ‌ها از گونه‌های گیاه هالوفیت با استفاده از روش (17) (با تغییرات جزئی) انجام شد. ریزنمونه‌های برگ، ساقه و ریشه با آب مقطر اتوکلاوشده به مدت 15 دقیقه شست‌وشو شدند. ابتدا نمونه‌ها به مدت یک دقیقه در اتانول 70 درصد قرار داده شد. سپس نمونه‌ها در هیپوکلریت سدیم 10 درصد برای سه دقیقه غوطه‌ور و نمونه‌ها سه بار با آب مقطر شست‌وشو شدند. نمونه‌های استریل‌شده، روی کاغذ صافی قرار داده شد تا رطوبت اضافی بافت حذف شود. قطعات کوچک به طول 5 میلی‌متر با استفاده از تیغ اسکالپل برش داده شدند. از هر بافت استریل، چهار عدد با ابعاد یکسان در هر پتری حاوی محیط کشت PDA قرار داده شدند تا امکان رشد برای اندوفیت‌های قارچی فراهم شود.

ظروف پتری با استفاده از پارافیلم محکم بسته شدند. ظروف پتری تا زمان رشد اندوفیت در انکوباتور با دمای 1±28 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند. برای اطمینان از استریل سطحی قطعات، بافت غیراستریل (فقط کاملاً در آب شسته شدند) به‌طور همزمان در محیط کشت رشد قرار گرفت و در همان شرایط به‌طور مساوی انکوبه شد. برای بررسی تولید اندوفیت‌های قارچی، محیط کشت‌ها هر سه روز یک‌بار بررسی شدند. اندوفیت‌های قارچی، بعد از 6-4 هفته رشد، برای خالص‌سازی با استفاده از روش نوک هیف، دوباره در محیط کشت PDA جدید قرار داده شدند. پس از رشد کافی، یک قطعه هیف مجزا از حاشیه پرگنه با سوزن بسیار ظریف برداشته و روی محیط کشت جدید انتقال داده شد (6).

شناسایی فنوتیپی: شناسایی جدایه‌های قارچی با استفاده از اسلایدهای میکروسکوپی آغشته به رنگ لاکتوفنل طبق کلید شناسایی (2) و با استفاده از میکروسکوپ نوری انجام شد.

جدول 1- مشخصات جغرافیایی مناطق جمع‌آوری گونه‌های گیاهی هالوفیت در استان هرمزگان

گونه‌های گیاهی هالوفیت: (1) Salsola imbricata (2) Suaeda aegyptiaca (3) Suaeda vermiculata (4) Cornulaca monacantha (5) Halocnemum strobilaceum (6) Bienertia cycloptera

شناسایی مولکولی

استخراج DNA: مقدار یک گرم از میسلیوم در یک هاون سترون ریخته و به کمک نیتروژن مایع پودر شد. سپس به میکروتیوب دو میلی‌لیتری منتقل شد. مقدار 800 میکرولیتر بافر استخراج DNA با 10 درصد مرکاپتواتانول به هر نمونه، اضافه و در حمام آب گرم به مدت یک ساعت در 65 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. طی این مدت هر 5 دقیقه یک بار میکروتیوب به آرامی تکان داده شد. 500 میکرولیتر کلروفرم ایزوآمیل الکل (1:24) به هر میکروتیوپ اضافه و به مدت 15 دقیقه، در 12000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. از بخش رویی به مقدار 400 میکرولیتر برداشته و هم حجم آن ایزوپروپانول سرد ریخته شد. نیم ساعت نمونه‌ها در فریز 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. سپس، میکروتیوپ‌ها برای 10 دقیقه، 12000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. بعد از آن، مایع رویی به آرامی خالی شد و به لوله‌های محتوای DNA، 100 میکرولیتر اتانول 70 درصد افزوده و به مدت 8 دقیقه در 8000 دور سانتریفیوژ شد. این مرحله سه بار تکرار شد. میکروتیوپ‌ها به مدت دو ساعت روی کاغذ جاذب ر‌طوبت قرار گرفتند تا رسوب به‌دست‌آمده خشک شود. سپس، به هر لوله، 70 میکرولیتر آب مقطر دیونیزه افزوده شد (35).

تکثیر قطعة ITS قارچ‌ها با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR): واکنش زنجیره‌ای پلیمراز براساس برنامه دمایی و زمانی PCR که در جدول 2 آورده شده است و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی زیر انجام شد؛ درنهایت، قطعة تکثیرشده به شرکت توپاز ژن فرستاده شد (35).

ITS: (5´-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´)

ITS: (5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´(

جدول 2- برنامه دمایی و زمانی PCR برای اندوفیت‌های‌ قارچی

آنالیز آماری

شناسایی اندوفیت قارچی: پس از ویرایش قطعة حدود bp 800 در بانک جهانی اطلاعات (NCBI) به‌ترتیب اندوفیت‌های قارچی Fusarium sp. و Thielavia sp. با شماره دسترسی MW595827 و MT277124.1 ثبت شدند.

شاخص تنوع زیستی: شاخص‌های تنوع زیستی به‌منظور بررسی و اندازه‌گیری تنوع زیستی اندوفیت‌های قارچی Fusarium sp. و Thielavia sp.  در مکان‌ها، فصل‌ها، بافت‌های مختلف و گونه‌های گیاهی هالوفیت با استفاده از نرم‌افزار PAST محاسبه شدند.

ارزیابی و تعیین کمیت تنوع: در این تحقیق برای محاسبة تنوع گونه‌ای، از شاخص‌های سیمپسون، شانون و غنای مارگالف استفاده شد.

شاخص سیمپسون (34)

1-D=1-

شاخص شانون وینر (H) (41)

H=-

که در آن، H شاخص تنوع شانون وینر و P_i فراوانی نسبی افراد گونة i در نمونه مدنظر است.

شاخص مارگالف (24)

R=

که در آن، R غنای گونه‌ای، S تعداد گونه‌ها و LnN لگارتیم طبیعی افراد است.

نتایج

شناسایی فتوتیپی اندوفیت‌های قارچی: از بین جدایه‌های رشدکرده براساس صفات ظاهری رنگ پرگنه، مشخصات کنیدیوم و آرایش اسپور و با استفاده از کلیدهای معتبر شناسایی (2)، دو اندوفیت قارچی Fusarium sp. وThielavia sp.  شناسایی شدند .

شناسایی مولکولی

تعداد و فراوانی نسبی اندوفیت‌های‌ قارچی گونه‌های گیاهان هالوفیت براساس بافت گیاهی: بیشترین تعداد و فراوانی کلونیزاسیون^[8] مربوط به اندوفیت قارچی Thielavia sp. به میزان 75/21 درصد در ساقه و در فصل زمستان در جزیره لارک بود (جدول 3 و 4). درصد فراوانی اندوفیت قارچی Thielavia sp. در تمامی گونه‌های گیاهی مورد مطالعه 62 درصد بود.

جدول 3- مقایسة تعداد جدایه دو اندوفیت‌ قارچی Fusarium sp. وThielavia sp.  در بافت‌ها و در فصول مختلف

* تعداد جدایة اندوفیت را نشان می‌دهد.

جدول 4- مقایسة تعداد جدایه دو اندوفیت‌ قارچی Fusarium sp. وThielavia sp.  در شش گونة گیاه هالوفیت براساس مناطق مطالعه‌شده

بررسی شاخص‌های‌ تنوع اندوفیت‌های‌ قارچی در بافت‌های شش گونة هالوفیت مطالعه‌شده در دو فصل تابستان و زمستان: با بررسی شاخص‌های تنوع سیمپسون و شانون مشخص شد بیشترین تنوع به‌ترتیب به میزان 498/0 و 691/0 در ساقه گونة گیاهی B. cycloptera و بیشترین تنوع از لحاظ غنای مارگالف در برگ به مقدار 445/0 مشاهده شد (جدول 5).

بررسی شاخص‌های‌ تنوع اندوفیت‌های قارچی در مناطق جمع‌آوری گونه‌های گیاهی مطالعه‌شده در دو فصل تابستان و زمستان: بیشترین میزان شاخص تنوع سیمپسون و شانون برای اندوفیت‌های قارچی در جزیره ابوموسی به‌ترتیب 500/0 و 693/0 و بیشترین میزان غنای مارگالف به میزان 455/0 در بندر سیریک مشاهده شد (جدول 6).

جدول 5- شاخص تنوع دو اندوفیت‌ قارچی Fusarium sp. وThielavia sp.  در بافت‌های مختلف شش گونة گیاهی هالوفیت در فصل تابستان و زمستان

جدول 6. شاخص تنوع دو اندوفیت‌ قارچی Fusarium sp. وThielavia sp.  در شش گونة گیاهی هالوفیت در دو فصل تابستان و زمستان

بحث و نتیجه‌گیری

قارچ‌های اندوفیت به‌عنوان گروهی از میکروارگانیسم‌ها توصیف شده‌اند که بافت‌های داخلی گیاهان را کلونیزه و تمام یا بخشی از چرخة زندگی خود را در این مکان سپری می‌کنند، بدون اینکه آسیب یا بیماری مشهودی در گیاه میزبان ایجاد کنند (3). قارچ‌های اندوفیت از جنبه‌های مختلف دارویی، کشاورزی و بوم‌شناختی حائز اهمیت‌اند (46). آنها در ایجاد و شکل‌گیری یا به وجود آمدن یک اکوسیستم^[ix] نقش اساسی دارند (42). مطالعات تعیین دامنة میزبان برای درک توزیع اندوفیت و تنوع زیستی بسیار ضروری است. همچنین، اندوفیت‌ها ابزاری مناسب برای شناسایی و مطالعة روابط فیلوژنی‌اند (21).

میزان کلونیزاسیون، تنوع و ترکیب جمعیت اندوفیت تأثیرگرفته از گونه‌ و بافت‌ میزبان و عوامل غیرزنده است (19)؛ برای مثال، سان و همکاران (40) گزارش کردند گونة‌ میزبان و نوع بافت‌ آن به‌طور آشکار بر جمعیت قارچ‌های اندوفیت در گیاه چوبی Stipa grandis اثر داشته است و میزان کلونیزاسیون قارچ‌های اندوفیت در شاخه‌ها به‌طور چشمگیری بیشتر از برگ‌ها بود. ترکیب جمعیت قارچ‌های اندوفیت در بافت‌های مختلف (شاخه، ساقه‌ و برگ‌ها) در میان گونه‌های میزبان متفاوت است (25). در تحقیقاتی همسو با نتایج مطالعة حاضرگزارش شد میزان کلونیزاسیون و غنای قارچ‌های اندوفیت بین گونه‌های هالوفیت متفاوت است (28، 38 و 45). نتایج مشابهی در مطالعات قبلی روی حرا (45)، هالوفیت‌های کویر (40)، گیاهان gypsophilous (28) و گیاهان دیگر اکوسیستم‌ها (38) گزارش شده است؛ برای مثال، ایکسینگ (45) میزان کلونیزاسیون قارچ‌های اندوفیت را به‌ترتیب در ریشه‌ها (5/12 تا 7/41 درصد)، ساقه‌ها (8 تا 54 درصد) و برگ‌ها (5/12 تا 1/25 درصد) گزارش کرد. میزان فراوانی قارچ‌های اندوفیت در مطالعة حاضر در دو فصل تابستان و زمستان در ساقه‌ها بیشتر از برگ و ریشه بود. تفاوت بین کلونیزاسیون اندوفیت و تنوع ممکن است به عوامل زنده و غیرزنده مربوط شود (45). نتایج ما نشان دادند ترکیب جوامع اندوفیت قارچی در گونه‌های مختلف هالوفیت متفاوت است. نتایج مشابهی در برخی مطالعات قبلی دربارة گیاهان هالوفیت کویری گزارش شده‌اند (45). در این مطالعه جمعیت اندوفیت‌ها همچنین تأثیرگرفته از نوع اندام گیاه (برگ، ساقه و ریشه) است که نتایج مطالعات قبلی انجام‌شده در اکوسیستم‌های خشک و نیمه‌خشک را تأیید می‌کند (28 و 38). در مطالعة دیگری نشان داد شد ارقام مختلف برنج دارای جوامع قارچی متفاوتی است (5، 9، 20 و 32)؛ با این حال، تجزیه و تحلیل نتایج مقالة حاضر، وجود الگوهای روشن تنوع غنا بین انواع بافت‌ها را نشان می‌دهد و چندین فرضیه را برای آن الگوها پیشنهاد می‌کند که شایستة مطالعة بیشتر هستند. به‌طور کلی، یافته‌های ما نشان می‌دهند تنوع و فراوانی اندوفیت‌های قارچی در گونه‌های گیاهی هالوفیت می‌توانند علاوه بر فصل، تحت‌تأثیر گونة میزبان و اندام آن تغییر کند. تحقیقات دربارة غنا و تنوع اندوفیت‌ها از مکان‌های مختلف احتمالاً درک بیشتری از کلونیزاسیون، توزیع و نقش آنها در تناسب اندام گیاهان را فراهم می‌کند که ممکن است تفاوت‌های جمعیت بین دو بافت را توضیح دهد (12، 23 و 38). عوامل متعددی مانند گونه یا رقم میزبان، نوع خاک، وضعیت فیزیولوژیک گیاه و بافت یا اندام گیاه میزبان، ممکن است تفاوت‌های مشاهده‌شده در تنوع قارچ‌ها را نشان دهند (14). جنس‌های قارچی که شناسایی شدند، در چندین مطالعة دیگر نیز شناسایی شده‌اند (18، 26، 29، 42 و 44).

مطالعة ما پتانسیل بررسی دو اندوفیت قارچیFusarium sp.  و Thielavia sp. جداسازی‌شده از گیاهان هالوفیت برای نشان‌دادن تنوع غنی دو گونه‌‌ را برجسته می‌کند. تحقیقات بیشتر برای شناسایی اهمیت عملکردی و اکولوژیک قارچ‌های اندوفیت خاص در گیاه در شرایط مختلف یا در مکان‌های مختلف نیاز است. اگر هریک از این جدایه‌ها برای کاربردهای مفید بیشتر توسعه یابد، تجزیه و تحلیل ما از تغییرات مکانی و زمانی در ترکیب جوامع دلیلی را برای این شک فراهم می‌کند که حضور آنها در گیاه محدود به گونه‌های خاصی از هالوفیت یا محدود به مکان‌های خاص آزمایش‌شده نخواهد بود. نتایج نشان می‌دهند حضور اندوفیت‌های قارچی در هالوفیت می‌تواند از هر دو زمان فصل و بافت‌های مختلف تأثیر بگیرد؛ اما در غیاب هر گونه الگوی منسجم در سراسر مکان‌ها، عوامل واسطه‌کنندة برهمکنش‌های خاص بین قارچ و گیاه باید به‌صورت محلی ارزیابی شوند.

[1]- de Bary

[2]- Endophyte

[3]- Canopy

[4]- Halophyte

[5]- Initial denaturation

[6]- Annealing

[7]- Elangation

[8]- Colonization

[ix]- Ecosystem