ارزیابی دو گونه گوشتی بومی با توان القا CAM در خاک های شور و خشک حوضه دریاچه ارومیه

گیاهان CAM انعطاف‌پذیری درخور توجهی در مسیر فتوسنتزی خود بسته به شرایط محیطی نشان می‌دهند و در شرایط خشکی و شوری با در پیش گرفتن مسیر (Crassulacean acid metabolism) CAM، بهره‌وری استفاده از آب را افزایش می‌دهند (Borland et al., 2015; Habibi, 2016). چرخه CAM در طی چهار مرحله انجام می‌گیرد (Winter, 2019). طی مرحله ‌I که در شب اتفاق می‌افتد، دی‌اکسیدکربن اتمسفری و تنفسی توسط آنزیم فسفوانول پیروات کربوکسیلاز (PEPC) سیتوزولی تثبیت می‌شود. در زمان طلوع خورشید، مرحله ‌II چرخه CAM آغاز می‌شود و طی آن بی‌فسفر شدن PEPC شروع می‌شود و مقدار فعالیت آن کاهش می‌یابد. همزمان با بی‌فسفر شدن آنزیم فسفوانول پیروات کربوکسیلاز، فعالیت آنزیم ریبولوز 1و5- بیس‌فسفات کربوکسیلاز (Rubisco) افزایش می‌یابد. طی مرحله ‌III روزنه‌ها بسته می‌شوند و فعالیت آنزیم‌های NADP-مالیک‌آنزیم و NAD-مالیک‌آنزیم افزایش می‌یابد و دکربوکسیلاسیون PEP به پیروات انجام می‌شود و به‌این‌ترتیب فشار دی‌اکسید‌کربن افزایش و غلظت بالایی از آن توسط چرخه کالوین تثبیت می‌شود و اسکلت کربنی لازم برای مرحله ‌I شکل می‌گیرد. البته در گیاهانی که به‌خوبی آبیاری شده‌اند، دکربوکسیلاسیون اسیدهای آلی از مرحله ‌II شروع می‌شود. سرعت تنفس نوری به‌ویژه طی مرحله ‌II و در شروع مرحله ‌III که مالات زیادی در واکوئل‌ها انباشته شده است، کاهش می‌یابد. با اتمام دکربوکسیلاسیون، روزنه‌ها دوباره باز می‌شوند و تثبیت دی‌اکسید‌کربن اتمسفری از طریق مسیر C₃ در طی مرحله ‌IV (غروب) انجام می‌گیرد. با تولید مالات شبانه، آنزیم PEPC مهار می‌شود (Winter, 2019). البته باید توجه داشت که در اثر خشکی الگوی فازهای یادشده تغییر می‌کند و مدت مرحله ‌II به یک ساعت کاهش می‌یابد. در طی مرحله ‌IV تولید مولکول‌های ROS به‌علت تولید اکسیژن در مجاورت روزنه‌ها و کاهش غلظت دی‌اکسیدکربن افزایش نشان می‌دهد که خود باعث افزایش سرعت تنفس نوری می‌شود. گیاهان از نظر مسیر فتوسنتزی CAM در دوگروه اصلی قرار می‌گیرند (Winter, 2019): (1) CAM اجباری (Obligate CAM) که در این گروه تثبیت دی‌اکسید‌کربن در هر دو گروه گیاهان شاهد و دچار تنش خشکی در طی شب روی می‌دهد (مانند کاکتوس و آلوئه‌ورا)، (2) CAM اختیاری (Facultative CAM) که این گیاهان در شرایط پُرآبی و کم‌آبی مسیرهای فتوسنتزی متفاوتی را در پیش می‌گیرند. در این گیاهان با تأثیر عوامل القا‌کننده مسیر CAM مثل خشکی و شوری، پیشرفت فرآیند گذر از مسیر C₃ یا C₄ به CAM و الگوی تبادل دی‌اکسید‌کربن در طی چهار فاز رخ می‌دهد که حالت‌های مختلفی از القاء CAM را در گیاهان نمایان می‌سازد (Winter, 2019). انعطاف‌پذیری فتوسنتزی با اعمال تنش‌های خشکی، شوری و نوری در تعدادی از گونه‌های حدواسط CAM/C₃ اثبات شده است. این گیاهان در شرایط پُرآبی مسیر فتوسنتزی C₃ و در شرایط کم‌آبی مسیر فتوسنتزی CAM را در پیش می‌گیرند و در نتیجه به بهترین شیوه کارآیی بهره‌‌وری آب را بهبود می‌بخشند (Borland et al., 2015; Liu et al., 2018). به‌علت کارآیی بهره‌‌وری آب بالا در این گیاهان، اخیراً تلاش‌های زیادی برای انتقال ژن‌های CAM از طریق مهندسی ژنتیک طی پروسه مهندسی CAM برای تولید گیاهان مقاوم به کم‌آبی و دارای کارآیی بهره‌وری آب بالا شده است (Heyduk et al., 2018; Amin et al., 2019). درجه القاء CAM در گونه‌های حدواسط C₃/CAM در شرایط آب‌و‌هوایی یک منطقه خاص جغرافیایی (مثل آب‌و‌هوای ایران) می‌تواند از انعطاف‌پذیری فتوسنتزی همان گونه‌های CAM در مناطق دیگر دنیا متفاوت باشد.

هدف این پژوهش، انتخاب گونه‌هایی با توان رشد در محیط شور و خشک همزمان با حفظ انعطاف‌پذیری فتوسنتزی بود. متأسفانه تاکنون پژوهش‌هایی در مقیاس وسیع و به‌عنوان غربال‌گری امکان القای مسیر CAM در دنیا کمتر انجام شده است و به‌علت انحصاری و یا بومی بودن تعداد زیادی از گونه‌های مناطق خشک و شور در فلور ایران، این شناخت می‌تواند در آینده با بهره‌گیری از دانش بیوتکنولوژی به بهبود کشاورزی در مناطق خشک، نیمه‌خشک و بیابانی و افزایش رشد و تولیدات گیاهی در زمین‌هایی با خشکی‌های فصلی و متناوب ایران منجر شود. ازطرف‌دیگر، با‌توجه‌به خشک شدن دریاچه ارومیه و تغییرات اقلیمی حاصل از آن، مطالعه انعطاف‌پذیری فتوسنتزی برای انتخاب گونه‌های مناسب برای کشت در خاک اطراف دریاچه پُراهمیت به نظر می‌رسد. در این پژوهش سعی شده است دو گونه گوشتی بومی ایران که توان رشد در شرایط شور و خشک خاک دریاچه را دارند، شناسایی و مطالعه شوند. برای این منظور، گونه ناز طوقه‌ای (Rosularia elymaitica) و قیچ (Zygophyllum fabago) برای پژوهش حاضر انتخاب شدند. علت انتخاب این گونه‌ها در این پژوهش، داشتن حداقل دو شرط بود: (1) همگی جزو فلور طبیعی و بومی منطقه آذربایجان ایران باشند و مقاومت نسبی به خشکی یا شوری نشان دهند و (2) قابلیت القاء مسیر فتوسنتزی CAM و انعطاف‌پذیری فتوسنتری در آنها یا در گونه‌های نزدیک به آنها بررسی شده باشد. بررسی منابع نشان داد که هر چند در جنس Zygophyllum انعطاف‌پذیری فتوسنتزی به‌صورت کامل بررسی نشده است، انتقال از مسیر فتوسنتزی C₃ به CAM-cycling در ناز طوقه‌ای خشکی‌دیده گزارش شده است (Habibi and Hajiboland, 2011).

در همه پژوهش‌های یادشده در بالا، پاسخ گونه‌ها به تنش‌ها به‌صورت جداگانه مطالعه شده است. ولی باتوجه‌به اینکه گیاهان در طبیعت با چندین تنش به‌صورت همزمان مقابله می‌کنند، پاسخ گونه‌های انتخاب‌شده به تنش‌های ترکیبی (تنش توأم شوری و خشکی) هم در شرایط آزمایشگاهی و هم در شرایط رویشگاه طبیعی بررسی شد. برای دستیابی به این اهداف، این پژوهش در قالب دو آزمایش انجام شد. در آزمایش اول، تأثیر سطوح مختلف خشکی و شوری به‌مدت یک‌ماه بر شاخص‌های تحمل به تنش (درصد کاهش عملکرد و مقدار مالون‌دی‌آلدئید) و شاخص‌های درجه القاء CAM (تغییرات شبانه‌روزی اسیدیته و فعالیت آنزیم پپ‌کربوکسیلاز) در دو گونه مطالعه شد تا میزان تحمل گیاهان انتخاب‌شده به تنش شوری و خشکی همزمان با حفظ انعطاف‌پذیری فتوسنتزی مشخص شود. در آزمایش دوم، گیاهان در خاک منطقه آغداش واقع در حوضه دریاچه ارومیه با شوری (42/0±7 دسی‌زیمنس) کشت شدند تا پس از ارزیابی شاخص‌های تحمل به تنش شوری و خشکی و شاخص‌های تعیین‌کننده القاء فتوسنتز CAM در محیط طبیعی، گونه مناسب‌تر برای کشت در خاک‌های خشک و شور حوضه دریاچه ارومیه معرفی شود. ارزیابی گونه‌های مناسب‌تر برای کشت در خاک‌های خشک و شور حوضه دریاچه ارومیه، اقدامی مؤثر برای افزایش پوشش گیاهی اطراف دریاچه خواهد بود.

مواد و روش‌ها

انتخاب گونه‌های مطالعه‌شده و طراحی آزمایش‌ها

گیاهان کامل ناز طوقه‌ای همراه ریشه و اندام هوایی مناسب، از دامنه‌های کوه میشو داغ واقع در جاده تبریز-مرند، جمع‌آوری و به آزمایشگاه منتقل شدند. نمونه‌های یادشده، در خاک جمع‌آوری‌شده از حوضه اطراف دریاچه ارومیه کشت شدند. بذرهای گیاه قیچ از محوطه دانشگاه تبریز جمع‌آوری و کشت شدند. دو گونه انتخاب‌شده به اتاق رشد زیر روشنایی لامپ مهتابی با شدت نور μmol m^-2 s^-1 350، فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی، رطوبت روز 75 و شب 65 درصد و دمای روز 25 و شب 17 درجه سانتیگراد منتقل شدند (Habibi and Hajiboland, 2010).

در آزمایش اول که به‌منظور تعیین میزان تحمل گیاهان انتخاب‌شده به تنش شوری و خشکی همزمان با حفظ انعطاف‌پذیری فتوسنتزی انجام شد، با‌توجه‌به وجود گرادیان شوری در خاک‌های اطراف دریاچه، برای اطمینان از مقدار تحمل گونه‌های مطالعه‌شده، ابتدا خاکی با EC پایین (5/60 درصد ماسه، 7/8 درصد سیلت، 8/30 درصد ذرات رس، 5/29 درصد کربنات‌کلسیم، 45/0 درصد ازت، 5/2 درصد کربن و اسیدیته حدود 1/8) از مناطق اطراف دریاچه انتخاب شد. برای این منظور خاک منطقه شامات واقع در 20 کیلومتری روستای آغداش با فاصله 8 کیلومتری از مصب رودخانه زرینه‌رود در عمق 30 سانتی‌متری جمع‌آوری و به آزمایشگاه انتقال یافت. مقدار EC این خاک با استفاده از EC متر حدود 26/0±60/2 اندازه‌گیری شد. سپس با افزودن نمک کلرید سدیم و رسم منحنی رگرسیون، به EC دلخواه در خاک دست یافتیم که برای هر گیاه با استناد به مقالات متفاوت بود. این کار با استفاده از روش توصیف‌شده در کارهای پیشین (Habibi, 2017) انجام گرفت. پس از پُر کردن گلدان‌ها از خاک مورد نظر و رساندن EC آنها به مقدار مورد نظر، گیاهان در خاک گلدان‌های آماده به تعداد مناسب کشت شدند. سطوح تیمارهای خشکی و شوری بر اساس میزان تحمل گیاهان مورد مطالعه و با استفاده از آخرین منابع موجود (Mulry et al., 2015: Alam et al., 2014)، تعیین گردید.

در آزمایش دوم، برای ایجاد شرایط رشد طبیعی یکسان برای همه گونه‌ها، ابتدا خاک منطقه آغداش با شوری بالا (42/0±7 دسی‌زیمنس) انتخاب شد و دو گونه به این خاک منتقل شدند. میزان شوری خاکی که برای کشت گیاهان شاهد انتخاب شد با استفاده از EC متر در محدوده 26/0±60/2 اندازه‌گیری شد. همچنین، تیمار خشکی یکسان به‌صورت قطع آبیاری به مدت 30 روز برای همه گونه ها اعمال گردید.

تعیین شاخص درصد کاهش عملکرد، محتوی نسبی آب و تغییرات اسیدیته شبانه‌روزی

شاخص درصد کاهش عملکرد بر اساس روش Alam و همکاران (2014) محاسبه شد. محتوی نسبی آب برگ‌ها با استفاده از وزن تر(Fw)، وزن خشک (Dw) و وزن اشباع (Sw) و بر اساس رابطه زیر که توسط Lara وهمکارانش (2003) ارائه شده است، به‌دست آمد:

 RWC=100× (Fw-Dw)/(Sw-Dw)

برای تعیین اسیدیته، نمونه‌های برگی پس از توزین توسط ازت مایع خرد شده و سپس به‌مدت 10 دقیقه در آب مقطر جوشانده شدند. افزودن آب مقطر تا رسیدن به حجم نهایی دو میلی‌لیتر ادامه یافت و سپس تیتراسیون با سود (NaOH) 10 میلی‌مولار تا رسیدن به اسیدیته 7 انجام شد (Lara et al., 2003). برای تعیین اسیدیته شبانه، برگ‌ها 30 دقیقه پس از شروع روشنایی در اتاق رشد (ساعت 6 صبح) و برای اسیدیته روزانه 30 دقیقه پس از شروع تاریکی در اتاق رشد (ساعت 10 شب) برداشت شدند. برای یکنواختی نتایج، از جفت برگ‌های دوم و سوم بهره گرفته شد.

سنجش شاخص‌های فلورسانس کلروفیل

برای تعیین فلورسانس کلروفیل، از دستگاه فلورسانس‌سنج (PEA, Hansatech Instruments Ltd., King’s Lynn, Norfolk, PE 32 1JL, Engl)& استفاده شد. شاخص‌های فلورسانس کلروفیل در برگ‌های سازش‌یافته با تاریکی (به مدت حداقل 20 دقیقه) شامل F₀ (فلورسانس پایه) و F_m (فلورسانس بیشینه) اندازه‌گیری شد. شاخص‌های زیر در اندازه‌گیری‌های فلورسانس اولیه مورد استفاده قرار گرفت: شدت فلورسانس بیشینه (F_m)، شدت فلورسانس در 50 میکروثانیه به‌عنوان فلورسانس پایه، شدت فلورسانس در 300 میکروثانیه (F_300µs)، نسبت فلورسانس متغیر (V) و شدت فلورسانس در 2 میلی‌ثانیه (مرحلهJ) که نشانگر F_J است. سپس محاسبات لازم برای به‌دست آوردن بیشینه عملکرد کوانتومی فتوسیستم II (F_v/F_m)، انجام شد (Strasser et al., 2004).

سنجش رنگیزه‌های برگ

برای سنجش مقدار رنگیزه‌ها، نمونه‌های گیاهی با آب دوبار تقطیر شستشو و روی کاغذ صافی خشک شدند. پس از اندازه‌گیری وزن تر (تقریباً 200 میلی‌گرم)، نمونه‌ها در داخل ورقه آلومینیومی قرار گرفتند و در ازت مایع تا زمان سنجش نگهداری شدند. استخراج رنگیزه با استفاده از حلال استون روی یخ و با هاون چینی سرد انجام شد. غلظت کلروفیـل و کاروتنوئیدها پس از 24 ساعت استخـراج در استن 100 درصد به‌وسیله اسپکتروفتومتر تعییـن شد. جذب در 662، 645 و 470 نانومتر اندازه‌گیـری و غلظت کلروفیل‌های a، b و کاروتنوئیدها طبق فرمول‌های زیر محاسبه شد (Lichtenthaler and Wellburn, 1985).

Chl_a = 11.75 A₆₆₂ - 2.350 A₆₄₅

Chl_b = 18.61 A₆₄₅ - 3.960 A₆₆₂

Ca_x+c = 1000 A₄₇₀ - 2.270 Chl_a - 81.4 Chl_b/22

Chl_a= کلروفیل a، Chl_b= کلروفیل b، Ca_x+c= کاروتنوئید کل، A= جذب در طول موج موردنظر

سنجش فعالیت آنزیم فسفوانول پیروات کربوکسیلاز (PEPC)

برای تعیین فعالیت آنزیم PEPC، عصاره برگی ابتدا با بافر 50 میلی‌مولار تریس- HCl با اسیدیته 2/8 و حاوی 5/0 مولار ساکارز و 2 میلی‌مولار دی‌تیوتریتول (DTT) استخراج شدند. پس از سانتریفیوژ g15000 به‌مدت 15 دقیقه، روشناور برای تعیین فعالیت استفاده شد. محلول واکنش شامل 50 میلی‌مولار تریس- HCl با اسیدیته 2/8، 15 میلی‌مولار MgCl₂، 10 میلی‌مولار NaHCO₃، 2 میلی‌مولار فسفوانول پیروات (PEP)، 15/0 میلی‌مولار NADH و 10 واحد (U) آنزیم مالات‌دهیدروژناز بود (Groenhof et al., 1988). کاهش جذب در اثر اکسیداسیون NADH در طول موج nm340 انداز‌ه‌گیری شد و یک واحد فعالیت آنزیم معادل اکسیداسیون 1 میکرومول NADH در دقیقه در نظر گرفته شد.

سنجش مالون‌دی‌آلدئید

سنجش مالون‌دی‌آلدئید (MDA) به‌عنوان معیاری برای بررسی میزان پراکسیداسیون لیپیدها بر اساس روش Boominathan و Doran (2002) صورت گرفت. عصاره گیاهی در محلول 1/0% (W/V) تری‌کلرو استیک‌اسید (TCA) استخراج شد و به‌مدت پنج دقیقه در g10000 سانتریفیوژ شد. نسبت 1 به 4 از روشناور با محلول 20% از TCA حاوی 5/0% تیوباربیتوریک اسید در لوله آزمایش باهم مخلوط شد و به‌مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 95 درجه سانتیگراد قرار گرفت. سپس لوله‌ها سریعاً در یخ سرد شده و به‌مدت 15 دقیقه در g10000 سانتریفیوژ شدند. همزمان با عصاره‌های گیاهی محلول‌های استاندارد در محدودۀ صفر تا 100 نانومول از 1،1،3،3- تترا اتوکسی‌پروپان تهیه شده و جذب نمونه‌ها در nm 532 توسط اسپکتروفتومتر مورد اندازه‌گیری قرار گرفت. در نهایت مقدار MDA نمونه‌ها بر حسب واحد
nmol g^-1 FW محاسبه شد.

سنجش پتاسیم و سدیم

ابتدا نمونه‌ها با استفاده از کلریدریک‌اسید و نیتریک‌اسید به نسبت 3 به 1 هضم شدند و پس از رقیق‌سازی مقدار عناصر با استفاده از دستگاه نشر اتمی (ICP-AES, INTEGRA XL2, GBC; Australia) موجود در شرکت کلرپارس تبریز اندازه‌گیری شدند.

تجزیه‌و‌تحلیل آماری داده‌ها

آزمایش‌ها به‌صورت طرح کاملاً تصادفی طرح‌ریزی و به اجرا در آمد. هر تیمار دارای 4 تکرار مستقل بود. میانگین و انحراف معیار (SD) داده‌ها و همچنین رسم نمودارها به‌وسیلۀ نرم‌افزار Excel انجام شد. برای تجزیه و تحلیل آماری از نرم‌افزار Sigma Stat  نسخه 3.5 استفاده شد. برای مقایسه میانگین تیمارها از آزمون Tukey در سطح احتمال 05/0≥p استفاده شد.

نتایج.و بحث

آزمایش اول: تعیین میزان تحمل گیاهان انتخاب‌شده به تنش شوری و خشکی همزمان با حفظ انعطاف‌پذیری فتوسنتزی

در این پژوهش، برای تعیین سطوح تحمل به شوری و خشکی گونه‌های مورد مطالعه، دو نکته مورد توجه قرار گرفت: (1) بالاترین سطح تحمل به شوری و خشکی که باعث کاهش کمتر از 50 درصدی عملکرد گردید، برای هر گونه مشخص شد و (2) بالاترین سطح تحمل به شوری و خشکی که باعث ایجاد بیشترین تغییرات اسیدیته شبانه‌روزی شد، برای هر گونه تعیین گردید. افزایش مالون‌دی‌آلدئید به‌عنوان محصول پراکسیداسیون لیپیدهای غشا یک شاخص تعیین‌کننده وقوع تنش اکسیداتیو در سطح سلولی است (Habibi, 2014). از این‌رو مقدار این شاخص به‌عنوان یک نشانگر مهم تنش اکسیداتیو و میزان تحمل به شوری در این پژوهش مورد توجه قرار گرفت. همچنین در این آزمایش، بر اساس یافته‌های Freschi و همکاران (2010)، دو شاخص شامل تغییرات شبانه‌روزی اسیدیته (اختلاف اسیدیته شبانه و روزانه) و فعالیت آنزیم پپ‌کربوکسیلاز (PEPC) به‌عنوان شاخص‌های تعیین القا و بیان CAM مورد استناد قرار گرفتند (Holtum et al., 2017).

پاسخ گیاه ناز طوقه‌ای به شوری و خشکی و ارزیابی انعطاف‌پذیری فتوسنتزی

شوری 3 دسی‌زیمنس تغییر معنی‌داری بر مقدار وزن خشک اندام هوایی ناز طوقه‌ای نداشت. افزایش شوری به 9 دسی‌زیمنس، تنها باعث افت 32 درصدی عملکرد گیاه شد (جدول 1). اعمال تیمار شوری در سطح 12 باعث افت معنی‌دار عملکرد به میزان بیش از 45 درصد گردید. افزایش شوری به سطح 15 باعث خشکیدگی کامل گیاه گردید. افزایش شوری به سطح 9 باعث افزایش معنی‌دار مقدار مالون‌دی‌آلدئید نسبت به شاهد شد. بررسی شاخص تعیین‌کننده میزان انعطاف‌پذیری فتوسنتزی و میزان القا فتوسنتز CAM یعنی تغییرات اسیدیته شبانه‌روزی در گیاهان شوری‌دیده ناز طوقه‌ای نشان داد که افزایش شوری از سطح 9 دسی‌زیمنس تا 12 دسی‌زیمنس ضمن کاهش عملکرد گیاه، تغییری در مقدار اسیدیته شبانه‌روزی ایجاد نمی‌کند. ولی باتوجه‌به اینکه کاهش عملکرد گیاه در تیمار شوری 12 دسی‌زیمنس پایینتر از 50 درصد بود، این سطح از شوری به‌عنوان میزان تحمل به شوری ناز طوقه‌ای تعیین گردید.

جدول 1- تأثیر اعمال سطوح مختلف شوری به‌مدت یک‌ماه بر شاخص‌های تحمل به تنش (درصد کاهش عملکرد و مقدار مالون‌دی‌آلدئید) و شاخص درجه القا CAM (تغییرات شبانه‌روزی اسیدیته) در گیاه .Rosularia elymaitica میانگین‌هایی که حداقل یک حرف مشترک داشته باشند، تفاوت معنی‌داری با یکدیگر ندارند (آزمون توکی در سطح 95%)

Table 1. Effects of different levels of salt stress on the percentage of yield loss (%) and maloendialdehyde (MDA) content, and as well as on CAM expression parameters including dusk/dawn (Δ) titratable acidity in Rosularia elymaitica plants. Data of each parameter followed by the same letter are not significantly different (p<0.05, Tukey test)

بررسی درصد کاهش عملکرد ناز طوقه‌ای در شرایط خشکی نشان داد که افزایش شدت تنش آبی از 40 به 20 درصد ظرفیت مزرعه، باعث افت 11 و 55 درصدی وزن خشک اندام هوایی نسبت به شاهد شد (جدول 2) که با افزایش معنی‌دار میزان مالون‌دی‌آلدئید در تیمار 20 درصد ظرفیت مزرعه همراه بود. بیشترین انباشت اسیدیته شبانه در رژیم آبیاری 40 و 30 درصد ظرفیت مزرعه به‌دست آمد (10 تا 11 برابر شاهد). پس از یک‌ماه اعمال تنش، بالاترین سطح تحمل خشکی این گیاه رژیم آبیاری 30 درصد ظرفیت مزرعه تعیین شدکه با افزایش اسیدیته شبانه همراه بود. مقایسه میزان تغییرات اسیدیته شبانه‌روزی ناز طوقه‌ای با سایر گونه‌های قابل القا تیره کراسولاسه یعنی گونه سدوم آلبوم و Sedum uniflorum نشان داد که خشکی باعث ظهور درجه پایینی از فعالیت CAM یعنی متابولیسم CAM-cycling در گونه ناز طوقه‌ای شده است (Castillo, 1996; Martin et al., 2019). در حالت CAM-cycling گاز CO₂ در طی روز جذب می‌شود و روزنه‌ها در شب بسته‌اند، ولی این گیاهان الگوی نوسان شبانه‌روزی اسیدیته را نشان می‌دهند. در گیاهان CAM-cycling نوسان شبانه‌روزی شبیه نوسان اسیدیته گیاهان CAM است، ولی الگوی تبادل CO₂ آنها شبیه به الگوی تبادل گاز گیاهان C₃ است (Habibi and Ajori, 2015; Habibi, 2016). ناز طوقه‌ای در خاک‌های کم‌عمق و سنگلاخ‌های ارتفاعات شمال‌ غرب ایران می‌روید و در نتیجه در معرض خشکی‌های فصلی قرار می‌گیرد. انتقال از مسیر فتوسنتزی C₃ به CAM-cycling ممکن است در شرایط سخت رویشگاه برای حفظ بقا این گونه نقش مهمی را ایفا کند (Habibi and Hajiboland, 2011).

جدول 2- تأثیر اعمال سطوح مختلف خشکی به‌مدت یک‌ماه بر شاخص‌های تحمل به تنش (درصد کاهش عملکرد و مقدار مالون‌دی‌آلدئید) و شاخص درجه القا CAM (تغییرات شبانه‌روزی اسیدیته) در گیاه ناز طوقه‌ای. میانگین‌هایی که حداقل یک حرف مشترک داشته باشند، تفاوت معنی‌داری با یکدیگر ندارند (آزمون توکی در سطح 95%)

Table 2. Effects of different levels of drought stress on the percentage of yield loss (%) and maloendialdehyde (MDA) content, and as well as on CAM expression parameters including dusk/dawn (Δ) titratable acidity in Rosularia elymaitica plants. Data of each parameter followed by the same letter are not significantly different (p<0.05, Tukey test)

پاسخ گیاه قیچ به شوری و خشکی و ارزیابی انعطاف‌پذیری فتوسنتزی

بررسی درصد کاهش وزن خشک اندام هوایی تیمارهای شوری نسبت به شاهد در گیاه قیچ نشان داد که افزایش شوری از سطح 9 دسی‌زیمنس تا 12دسی‌زیمنس باعث افت 49 درصدی عملکرد گیاه می‌شود. اعمال تیمار شوری در سطوح بالاتر از 12 باعث افت معنی‌دار عملکرد به‌میزان بیش از 50 درصد گردید (جدول 3). افزایش شوری به سطح 12 باعث افزایش معنی‌دار مقدار مالون‌دی‌آلدئید نسبت به شاهد شد. بررسی شاخص تعیین‌کننده میزان انعطاف‌پذیری فتوسنتزی و میزان القا فتوسنتز CAM یعنی تغییرات اسیدیته شبانه‌روزی در گیاهان شوری‌دیده قیچ نشان داد که هیچ یک از سطوح شوری نتوانسته است باعث تغییر معنی‌دار در مقدار این شاخص گردد (جدول 3). در نتیجه، میزان تحمل به شوری گیاه قیچ، 12 دسی‌زیمنس تعیین شد (Alam et al., 2014).

جدول 3- تأثیر اعمال سطوح مختلف شوری به مدت یک‌ماه بر شاخص‌های تحمل به تنش (درصد کاهش عملکرد و مقدار مالون‌دی‌آلدئید) و شاخص درجه القاء CAM (تغییرات شبانه‌روزی اسیدیته) در گیاه قیچ. میانگین‌هایی که حداقل یک حرف مشترک داشته باشند، تفاوت معنی‌داری با یکدیگر ندارند (آزمون توکی در سطح 95%)

Table 3. Effects of different levels of salt stress on the percentage of yield loss (%) and maloendialdehyde (MDA) content, and as well as on CAM expression parameters including dusk/dawn (Δ) titratable acidity in Zygophyllum fabago plants. Data of each parameter followed by the same letter are not significantly different (p<0.05, Tukey test).

بررسی درصد کاهش عملکرد این گیاه در شرایط خشکی نشان داد که با افزایش شدت تنش آبی از 70 درصد ظرفیت مزرعه به 40 درصد ظرفیت مزرعه، تغییر معنی‌داری در مقدار وزن خشک اندام هوایی نسبت به شاهد حاصل نمی‌شود (جدول 4). اعمال آبیاری در محدوه 30 درصد ظرفیت مزرعه (خشکی شدید) تنها باعث افت 30 درصدی عملکرد گردید که با افزایش معنی‌دار میزان مالون‌دی‌آلدئید در این تیمار همراه نبود. با افزایش شدت تنش آبی از 70 درصد ظرفیت مزرعه به 30 درصد ظرفیت، شاهد افزایش انباشت اسیدیته شبانه بودیم و بیشترین انباشت اسیدیته شبانه‌روزی (3/6) در رژیم آبیاری30 درصد ظرفیت مزرعه مشاهد شد. بنابراین، با‌توجه‌به القا درجات پایین فتوسنتز CAM در این تیمار، رژیم آبیاری 30 درصد ظرفیت مزرعه به‌عنوان تیمار بهینه جهت القا CAM در این گیاه در شرایط خشکی تعیین شد. افزایش تنش خشکی از 30 به 20 درصد ظرفیت مزرعه باعث انباشت اسیدیته شبانه‌روزی شد. بر اساس تجربیات پیشین، مراجعه به منابع و مقایسه میزان تغییرات اسیدیته شبانه‌روزی گیاه قیچ خشکی‌دیده با میزان تغییرات اسیدیته شبانه‌روزی در گونه‌های حدواسط شناخته‌شده مقاوم به شوری مانند Mesembryanthemum crystallinum (Matsuoka et al., 2018)، نتایج به‌دست آمده در این پژوهش تنها ظهور متابولیسم CAM-cycling را در این گونه اثبات می‌کنند. مقاومت خوب این گیاه به تنش خشکی و شوری همزمان با انعطاف‌پذیری جزیی فتوسنتزی این نوید را می‌دهد که قابلیت انتقال از مسیر فتوسنتزی C₃ به CAM-cycling در شرایط سخت رویشگاه‌های پیرامون دریاچه ارومیه، مزیت مهمی برای حفظ بقا این گونه در این شرایط دشوار باشد.

القا مسیر فتوسنتزی CAM در پاسخ به اعمال شوری در Mesembryanthemum crystallinum (Matsuoka et al., 2018) و همچنین در Sedum uniflorum (Martin et al., 2019) گزارش شده است. بر خلاف انتظار، هیچ‌کدام از گونه‌های گوشتی مطالعه‌شده در این پژوهش در پاسخ به شوری انعطاف‌پذیری فتوسنتزی نشان ندادند.

جدول 4- تأثیر اعمال سطوح مختلف خشکی به‌مدت یک‌ماه بر شاخص‌های تحمل به تنش (درصد کاهش عملکرد و مقدار مالون‌دی‌آلدئید) و شاخص درجه القا CAM (تغییرات شبانه‌روزی اسیدیته) در گیاه قیچ. میانگین‌هایی که حداقل یک حرف مشترک داشته باشند، تفاوت معنی‌داری با یکدیگر ندارند (آزمون توکی در سطح 95%)

Table 4. Effects of different levels of drought stress on the percentage of yield loss (%) and maloendialdehyde (MDA) content, and as well as on CAM expression parameters including dusk/dawn (Δ) titratable acidity in Zygophyllum fabago plants. Data of each parameter followed by the same letter are not significantly different (p<0.05, Tukey test).

آزمایش دوم: کشت گونه‌ها در خاک حوضه دریاچه ارومیه در رویشگاه طبیعی

در این آزمایش، برای ایجاد شرایط رشد طبیعی یکسان برای همه گونه‌ها، ابتدا خاک منطقه آغداش با شوری بالا (42/0±7 دسی‌زیمنس) انتخاب شد و همه شش گونه به این خاک منتقل شدند. میزان شوری خاکی که برای کشت گیاهان شاهد انتخاب گردید با استفاده از EC متر در محدوده 26/0±60/2 اندازه‌گیری شد. همچنین، تیمار خشکی یکسان به‌صورت قطع آبیاری به مدت 30 روز برای همه گونه‌ها اعمال گردید. شاخص‌های درصد کاهش عملکرد، مقدار مالون‌دی‌آلدئید، نسبت پتاسیم به سدیم، کلروفیل کل و بیشینه عملکرد کوانتومی فتوسیستم II برای ارزیابی تحمل به تنش شوری و خشکی و شاخص‌های تغییرات شبانه‌روزی اسیدیته (اختلاف اسیدیته شبانه و روزانه) و فعالیت آنزیم پپ‌کربوکسیلاز (PEPC) به‌عنوان شاخص‌های تعیین‌کننده القا فتوسنتز CAM در محیط طبیعی سنجش شدند (جدول 5 و 6).

کشت گیاه ناز طوقه‌ای در خاک حوضه دریاچه ارومیه در رویشگاه طبیعی

بیشترین کاهش درصد عملکرد در تیمار توأم شوری و خشکی به‌دست آمد (بالای 50 درصد) (جدول 5) و در انتهای آزمایش گیاهان این تیمار خشک شدند. اعمال شوری تنها، باعث افزایش انباشت مالون‌دی‌آلدئید شد. بیشینه عملکرد کوانتومی فتوسیستم II تحت تأثیر تیمار خشکی تنها و شوری تنها قرار نگرفت. نسبت پتاسیم به سدیم در برگ‌های خشکی‌دیده گیاه ناز طوقه‌ای افزایش معنی‌دار نشان داد که با کاهش معنی‌دار کلروفیل کل همراه بود. درحالی‌که اعمال تنش شوری تنها نتوانست تغییر معنی‌داری در تغییرات اسیدیته شبانه‌روزی ایجاد کند، اعمال تیمار خشکی تنها باعث افزایش چشمگیر اسیدیته شبانه گردید. الگوی تغییرات فعالیت آنزیم پپ‌کربوکسیلاز منطبق بر الگوی تغییرات اسیدیته شبانه‌روزی بود (جدول 5). شاخص F_v/F_m یکی از شاخص‌های مهم برای تعیین مقاومت به انواع تنش‌ها است (Rousseau et al., 2013). تنش شوری از عوامل مهم محدودکننده رشد رویشی و زایشی اکثر گیاهان است (Mosleh Arany et al., 2018; Fazeli et al., 2018). با افزایش شدت تنش شوری در روز سی‌ام، مقدار MDA زیاد شد و افزایش شاخص پراکسیداسیون لیپیدها در شرایط تنش نشان داد که شوری اعمال‌شده پس از 30 روز در این پژوهش باعث تنش اکسیداتیو شده است. کاهش نسبت پتاسیم به سدیم برگی نشان‌دهنده مقاومت اندک ناز طوقه‌ای به تنش شوری است، زیرا حفظ نسبت بالای پتاسیم به سدیم در شرایط تنش شوری یکی از شاخص‌های مقاومت به شوری است (Hniličková et al. 2019). باتوجه‌به مقاومت کم این گیاه به شوری، بیشترین کاهش درصد عملکرد در تیمار توأم شوری و خشکی به‌دست آمد (بالای 50 درصد) و در انتهای آزمایش گیاهان این تیمار خشک شدند.

کشت گیاه قیچ در خاک حوضه دریاچه ارومیه در رویشگاه طبیعی

مقایسه درصد کاهش عملکرد گیاه قیچ تحت تنش با گیاهان شاهد نشان داد که افت عملکرد گیاه قیچ در تیمار توأم شوری و خشکی حدود 28 درصد بود (جدول 6). بیشینه عملکرد کوانتومی فتوسیستم II و مقدار مالون‌دی‌آلدئید تحت تأثیر تیمار خشکی تنها قرار نگرفتند. مقدار کلروفیل کل در تیمارهای شوری تنها، خشکی تنها و تیمار توأم شوری و خشکی کاهش معنی‌داری نشان داد. نسبت پتاسیم به سدیم برگی و مقدار کلروفیل برگ‌های شوری‌دیده گیاه قیچ کاهش معنی‌داری نشان داد. اعمال تیمار خشکی باعث افزایش جزئی و معنی‌دار اسیدیته شبانه گردید. الگوی تغییرات فعالیت آنزیم پپ‌کربوکسیلاز منطبق بر الگوی تغییرات اسیدیته شبانه‌روزی بود و بیشترین میزان فعالیت این آنزیم در تیمارهای خشکی تنها و تیمار توأم شوری و خشکی مشاهده شد.

بر اساس یافته‌های Wang و همکاران (2020)، هرچند گیاهان جنس قیچ تحمل بالایی به شوری و خشکی دارند ولی Z. fabago در مقایسه با Z. brachypterum و  Z. obliquum تحمل کمی به شوری دارد و شدت‌های بالای شوری (200 میلی‌مولار) باعث افت چشگیر رشد و عملکرد این گونه می‌شود. کاهش کلروفیل در تنش توأم شوری و خشکی در این پژوهش با نتایج Mulry و همکاران (2015) در گیاه پورتولاکا اولراسه تطابق داشت. بیشترین کاهش مقدار کلروفیل کل در تیمار تنش توأم شوری و خشکی به‌دست آمد که این کاهش با افت معنی‌دار عملکرد (وزن خشک اندام هوایی) در این تیمار پس از گذشت 30 روز از اعمال تیمار کاملاً همخوانی داشت. عدم تغییر معنی‌دار بیشینه عملکرد کوانتومی فتوسیستم II و مقدار مالون‌دی‌آلدئید نشان‌دهنده مقاومت بالای گیاهان قیچ به تنش توأم شوری و خشکی بود. به‌عبارت‌دیگر، گیاه قیچ سازوکارهای لازم برای حفاظت نوری در شرایط تنش توأم را دارا بود و عدم تغییر معنی‌دار شاخص پراکسیداسیون لیپیدها نشان‌دهنده عدم وقوع تنش اکسیداتیو بود. پس از 30 روز اعمال خشکی، کاهش عملکرد قیچ در خاک شور (42/0±7 دسی‌زیمنس) حوضه دریاچه ارومیه در شرایط طبیعی بیشتر از 28 درصد نبود. در نتیجه این گیاه گزینه مناسبی برای کشت در خاک‌های خشک و شور حوضه دریاچه است.

جدول 5- تأثیر خشکی30 روزه بر درصد کاهش عملکرد (%)، مقدار مالون‌دی‌آلدئید (nmol g^-1 DW)، نسبت پتاسیم به سدیم برگی، مقدار کلروفیل کل (mg g^-1 FW)، بیشینه عملکرد کوانتومی فتوسیستم II (F_v/F_m)، تغییرات شبانه‌روزی اسیدیته (اختلاف اسیدیته شبانه و روزانه) و فعالیت آنزیم پپ کربوکسیلاز (PEPC در گیاه ناز طوقه‌ای کشت‌شده در خاک شور (42/0±7 دسی‌زیمنس) حوضه دریاچه ارومیه در شرایط طبیعی. میانگین‌هایی که حداقل یک حرف مشترک داشته باشند، تفاوت معنی‌داری با یکدیگر ندارند (آزمون توکی در سطح 95%)

Table 5. Effects of 30 days water stress on the percentage of yield loss (%), maloendialdehyde (MDA) content, K/Na ratio, total chlorophyll, maximum quantum yield (F_v/F_m), and as well as on CAM expression parameters including dusk/dawn (Δ) titratable acidity, and the activities of phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) in Rosularia elymaitica plants grown in natural habitats (the salinity level of 7±0.42 dS m^‒1). Data of each parameter followed by the same letter are not significantly different (P < 0.05,Tukey test).

نتیجه‌گیری کلی و پیشنهاد

در آزمایش اول، میزان تحمل به شوری قیچ و ناز طوقه‌ای، 12 دسی‌زیمنس تعیین گردید. برای هر دو گونه بیشترین انباشت اسیدیته شبانه‌روزی، در رژیم آبیاری30 درصد ظرفیت مزرعه مشاهد شد که حاکی از ظهور درجه پایینی از فعالیت CAM یعنی متابولیسم CAM-cycling در این گونه‌ها بود. در آزمایش دوم،کاهش بیش از 58 درصدی عملکرد ناز طوقه‌ای کشت‌شده در خاک شور (42/0±7 دسی‌زیمنس) حوضه دریاچه ارومیه در شرایط رویشگاه طبیعی پس از 30 روز اعمال خشکی نشان داد که به‌علت مقاومت کم به شوری، این گیاه قادر به رشد در خاک‌های خشک و شور حوضه دریاچه نیست. البته با‌توجه‌به اینکه خاک مناطق حوضه دریاچه ارومیه گرادیانی از شوری را نشان می‌دهد که هر ساله با ظهور خشکسالی‌ها متغیر است، توصیه می‌شود باتوجه‌به مقاومت مناسب به تنش خشکی تنها، کشت این گیاه در مناطقی با شوری کم انجام شود. گونه قیچ نسبت به ناز طوقه‌ای، مقاومت بالایی به تنش توأم شوری و خشکی نشان داد. مقاومت بالای گیاه قیچ به تنش توأم شوری و خشکی با حفظ مؤثر فعالیت فتوشیمیایی فتوسنتز و فعالیت آنزیم پپ‌کربوکسیلاز همراه بود. در نتیجه، گیاه قیچ ضمن مقاومت بالا به تنش شوری و خشکی، در شرایط سخت انعطاف‌پذیری فتوسنتزی بروز می‌دهد. از آنجایی که توان انعطاف‌پذیری فتوسنتزی در یک گیاه سازوکار مناسبی برای افزایش کارآیی بهره‌وری از آب در شرایط کم‌آبی محسوب می‌شود، به‌نظر می‌رسد گیاه قیچ می‌تواند گزینه مناسبی برای کشت در خاک‌های خشک و شور حوضه دریاچه باشد.

جدول 6- تأثیر خشکی30 روزه بر درصد کاهش عملکرد (%)، مقدار مالون‌دی‌آلدئید (nmol g^-1 DW)، نسبت پتاسیم به سدیم برگی، مقدار کلروفیل کل (mg g^-1 FW)، بیشینه عملکرد کوانتومی فتوسیستم II (F_v/F_m)، تغییرات شبانه‌روزی اسیدیته (اختلاف اسیدیته شبانه و روزانه) و فعالیت آنزیم پپ‌کربوکسیلاز (PEPC) در گیاه قیچ (Zygophyllum fabago) کشت‌شده در خاک شور (42/0±7 دسی‌زیمنس) حوضه دریاچه ارومیه در شرایط طبیعی. میانگین‌هایی که حداقل یک حرف مشترک داشته باشند، تفاوت معنی‌داری با یکدیگر ندارند (آزمون توکی در سطح 95%)

Table 6. Effects of 30 days water stress on the percentage of yield loss (%), maloendialdehyde (MDA) content, K/Na ratio, total chlorophyll, maximum quantum yield (F_v/F_m), and as well as on CAM expression parameters including dusk/dawn (Δ) titratable acidity, and the activities of phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) in Zygophyllum fabago plants grown in natural habitats (the salinity level of 7±0.42 dS m^‒1). Data of each parameter followed by the same letter are not significantly different (p<0.05,Tukey test).

سپاسگزاری

این پژوهش در قالب طرح مصوب صندوق حمایت از پژوهشگران و فناوران کشور (Iran national Science foundation) با کد 96008637 انجام شده است و نگارندگان مقاله از حمایت مالی این صندوق سپاسگزاری می‌کنند.