اخبار و اعلانات

 آمار

تعداد نشریات42
تعداد شماره‌ها1,537
تعداد مقالات12,623
تعداد مشاهده مقاله25,853,000
تعداد دریافت فایل اصل مقاله10,666,354
برهانی, ماتیا سادات. (1401). اثر روش‌های مختلف تثبیت سویه بر تولید پروتئاز آئروموناس هیدروفیلا MSB16. سامانه مدیریت نشریات علمی دانشگاه اصفهان, 11(42), 17-32. doi: 10.22108/bjm.2021.128199.1382
ماتیا سادات برهانی. "اثر روش‌های مختلف تثبیت سویه بر تولید پروتئاز آئروموناس هیدروفیلا MSB16". سامانه مدیریت نشریات علمی دانشگاه اصفهان, 11, 42, 1401, 17-32. doi: 10.22108/bjm.2021.128199.1382
برهانی, ماتیا سادات. (1401). 'اثر روش‌های مختلف تثبیت سویه بر تولید پروتئاز آئروموناس هیدروفیلا MSB16', سامانه مدیریت نشریات علمی دانشگاه اصفهان, 11(42), pp. 17-32. doi: 10.22108/bjm.2021.128199.1382
برهانی, ماتیا سادات. اثر روش‌های مختلف تثبیت سویه بر تولید پروتئاز آئروموناس هیدروفیلا MSB16. سامانه مدیریت نشریات علمی دانشگاه اصفهان, 1401; 11(42): 17-32. doi: 10.22108/bjm.2021.128199.1382

اثر روش‌های مختلف تثبیت سویه بر تولید پروتئاز آئروموناس هیدروفیلا MSB16

زیست شناسی میکروارگانیسم ها
مقاله 3، دوره 11، شماره 42، تیر 1401، صفحه 17-32    اصل مقاله (1.02 M)
نوع مقاله: پژوهشی- فارسی
شناسه دیجیتال (DOI): 10.22108/bjm.2021.128199.1382
نویسنده
ماتیا سادات برهانی*
استادیار گروه زیست‌شناسی، دانشکدۀ علوم پایه، دانشگاه گنبدکاووس، گلستان، ایران
چکیده
مقدمه: تثبیت سویه‌های میکروبی دارای مزایایی مانند قابلیت تکرار و هزینة کمتر بازیافت سویه در فرایند تخمیر است. هدف از این مطالعه، بررسی اثر تثبیت سویة آئروموناس هیدروفیلا MSB16 بر توانایی تولید پروتئاز آن بود.
مواد و روش‏‏ها: بهترین روش تثبیت سویة MSB16، از میان 5 روش مختلف و با استفاده از پلیمرهای آلژینات، آلژینات - پلی وینیل الکل، آلژینات - پلی وینیل الکل - کربنات کلسیم، آلژینات - نانوذرة گاما آلومینیوم اکسید و همچنین کربوکسی متیل سلولز انتخاب شد. مبنای انتخاب بهترین روش تثبیت، میزان تولید پروتئاز سویة تثبیت‌شده در مقایسه با سویة تثبیت‌نشده به‌صورت مطالعة یک فاکتور در یک زمان است. سپس فاکتورهای مؤثر در روش تثبیت انتخاب‌شده، با استفاده از روش‌شناسی سطح پاسخ، بهینه‌سازی شدند. آنالیز داده‌های مربوط به روش‌شناسی سطح پاسخ با استفاده از نرم‌افزار Design Expert 11 و آزمون تحلیل واریانس بررسی شد.
نتایج: براساس نتایج روش‌شناسی سطح پاسخ، بالاترین میزان تولید پروتئاز توسط سویة تثبیت‌شده، در پلیمر حاوی 3 درصد آلژینات - 3 درصد پلی وینیل الکل - 3 درصد کربنات کلسیم به دست آمد (U/mL 32/205). مدل درجه دوم به‌دست‌آمده، براساس مقدار F (59/25) و مقدار p (0001/0>) ازنظر آماری معنادار بود. بالابودن ضریب تشخیص (9584/0) و معنادارنبودن تست عدم برازش (7818/0) صحت مدل را تأیید می‌کرد. تولید پروتئاز تحت‌تأثیر غلظت کربنات کلسیم و پلی وینیل الکل قرار می‌گرفت و با غلظت کربنات کلسیم رابطة معکوس داشت.
بحث و نتیجه‏گیری: بهینه‌سازی آماری عوامل مؤثر بر تثبیت سویة MSB16 به روش آلژینات - پلی وینیل الکل - کربنات کلسیم به افزایش 13/2 برابری تولید پروتئاز نسبت به سلول‌های میکروبی آزاد و تثبیت‌نشده منجر شد.
کلیدواژه‌ها
تثبیت سویه؛ آلژینات سدیم؛ پلی وینیل الکل؛ کربنات کلسیم؛ روش‌شناسی سطح پاسخ
اصل مقاله

مقدمه

پروتئازها یکی از مهم‌ترین گروه آنزیم‌های صنعتی‌اند که امروزه در صنایع بسیاری ازجمله تولید شوینده‌ها، صنایع غذایی، دارویی، چرم، ابریشم و همچنین بازیافت ضایعات پروتئینی استفاده شده‌اند. میکروارگانیسم‌ها به‌خصوص باکتری‌ها از منابع اصلی تولید پروتئازها در صنعت محسوب می‌شوند. علت این امر، تولید خارج سلولی اغلب پروتئازهای باکتریایی، ساده‌تربودن دستکاری ژنتیکی سویة میکروبی و بهینه‌سازی شرایط کشت آن برای افزایش تولید آنزیم است (1).

محصولات میکروبی می‌توانند توسط سلول‌های آزاد یا سلول‌های تثبیت‌شده تولید شوند. گفتنی است تثبیت سلول می‌تواند بر رشد، فیزیولوژی و فعالیت متابولیکی یک سلول و درنتیجه بر بازده تولید محصولات میکروبی مؤثر باشد (2). یکی از دلایل افزایش تولید محصولات میکروبی توسط سلول‌های تثبیت‌شده، افزایش تراکم سلول‌ها در راکتور صنعتی است. همچنین، تثبیت سلول‌های میکروبی به‌دلیل امکان استفادة مکرر سلول‌ها در فرایند تخمیر، پایداری طولانی مدت آنها، کاهش شستشوی سلول‌ها از راکتور و درنهایت هزینة کمتر بازیافت سویه، بر کاهش هزینة تمام‌شدة آنزیم‌های صنعتی بسیار مؤثر است (3).

به‌منظور تثبیت سلول‌ها، روش‌های متنوعی موجود است که به‌طور کلی می‌توان آنها را به چهار گروه اصلی شامل اتصال یا جذب به حامل جامد[1]، گیرافتادن درون یک ماتریکس (بستر) منفذدار[2]، اتصال سلول‌ها به‌صورت خودبه‌خودی یا با استفاده از عوامل متصل‌کننده[3] و محدودکردن سلول‌ها بین حامل‌های مختلف[4] تقسیم‌بندی کرد (4). از میان روش‌های نامبرده، روش گیرافتادن درون یک بستر منفذدار، به‌دلیل سادگی و پایداری بیشتر سلول‌های تثبیت‌شده در طول زمان، بیشتر شایان توجه قرار گرفته است (5). نتایج مطالعات گذشته نشان داده‌اند سویه‌های میکروبی تثبیت‌شده توسط روش گیرافتادن درون یک بستر منفذدار می‌توانند برای مدت طولانی‌تر زنده باقی بمانند یا افزایش چشمگیری در تولید آنزیم نسبت به سلول‌های آزاد داشته باشند (7و6)؛ با وجود این، انتخاب بستری که سلول‌های میکروبی در آن قرار می‌گیرند، از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است (5). غیرقابل محلول بودن، غیرقابل تجزیه بودن، غیرسمی بودن، ارزان‌بودن و پایداربودن در برابر صدمات مکانیکی و شرایط مختلف فیزیکوشیمیایی، ازجمله خصوصیاتی است که باید برای انتخاب بستر منفذدار مدنظر قرار گیرد. پلیمرهای آلی ازجمله موادی‌اند که بیشتر خصوصیات بیان‌شده را دارند. از میان پلیمرهای آلی که در فرایند تثبیت سلول‌های میکروبی نتایج خوبی به همراه داشته‌اند می‌توان به آلژینات، آگار، آگارز، پلی وینیل الکل، چیتوسان و کربوکسی متیل سلولز اشاره کرد (8). با وجود این، بستر مناسب در تثبیت سلول‌های میکروبی باید به‌طور مجزا برای هر سویة میکروبی به نحوی انتخاب شود که سویة تثبیت‌شده نسبت به سلول‌های آزاد، علاوه بر تولید بالای محصول خود، از پایداری مناسبی نیز برخودار باشد؛ برای مثال، در مطالعة کومار[5] و واتس[6] (2010) تولید پروتئاز توسط سویة باسیلوس سوبتیلیس[7] در حالت سلول‌های آزاد و تثبیت‌شده به روش گیرافتادن در پلیمرهای مختلف ازجمله ژلاتین، پلی آکریل آمید، کلسیم آلژینات و آگار بررسی شد. نتایج این مطالعه نشان دادند بالاترین میزان تولید پروتئاز، کمترین میزان نشست سلول و بالاترین تعداد تکرار فرایند تخمیری تنها توسط سلول‌های تثبیت‌شده در ژلاتین صورت می‌گیرد (9).

علاوه بر انتخاب نوع بستر، شرایط فیزیکوشیمیایی مختلف مانند دما، pH، میزان سلول‌های میکروبی و غلظت استفاده‌شده از مواد بستر، بر پایداری یا عملکرد سلول‌های میکروبی محصورشده در بستر منفذدار مؤثرند؛ بنابراین، در فرایند تثبیت سلول‌های میکروبی، باید دو عامل مهم نوع بستر و بهینه‌سازی شرایط آن در نظر گرفته شود (10). متأسفانه مطالعات اندکی در زمینة بهینه‌سازی تثبیت سویه‌های میکروبی مولد پروتئاز با استفاده از روش‌های آماری صورت گرفته و بیشتر مطالعات به‌صورت تک عاملی (یک فاکتور در یک زمان) بوده است؛ ازجمله این مطالعات، می‌توان به مطالعة پوتومارتی[8] و همکاران (2008) اشاره کرد که در آن متغیرهای مؤثر بر تولید پروتئاز قلیایی باسیلوس لیکن فورمیس[9] NCIM-2042 توسط روش پلاکت بورمن[10] غربالگری و 4 متغیر غلظت سدیم آلژینات، غلظت کلسیم کلرید، سرعت هم‌زنی و میزان سلول‌های تثبیت‌شونده (مایة تلقیح) توسط روش فاکتوریل کامل[11] بهینه‌سازی شدند. نتایج این مطالعه نشان دادند سلول‌های میکروبی تثبیت‌شده تا 12 بار به‌صورت پیاپی بدون نشت بیدها، تولید پروتئاز خوبی نسبت به سلول‌های آزاد نشان داشتند (11). روش تک عاملی به‌دلیل ساده‌بودن اجرای روش و کارآمدبودن در غربالگری فاکتورهای مؤثر بر یک فرایند، بسیار مفید است؛ اما استفاده از روش‌های آماری مانند روش‌شناسی سطح پاسخ، به‌دلیل تکرارپذیری و صرفه‌جویی در زمان و هزینه‌ها، رهیافتی ایدئال به‌منظور بهینه‌سازی شرایط فرایند تثبیت یا تولید یک محصول صنعتی محسوب می‌شود (12). همچنین، برخلاف روش تک عاملی، این رهیافت قادر است با بررسی تعداد کمی از آزمایشات به میانکنش بین متغیرهای مختلف مؤثر بر فرایند پی ببرد (13).

بنابراین در مطالعة حاضر، ابتدا اثر 5 روش مختلف تثبیت از نوع گیرافتادن درون یک بستر منفذدار، بر تولید پروتئاز آئروموناس هیدروفیلا MSB16 بررسی شد. بسترهای مطالعه‌شده شامل سدیم آلژینات، سدیم آلژینات - پلی وینیل الکل، سدیم آلژینات - پلی وینیل الکل - کربنات کلسیم، سدیم آلژینات - نانوذرة گاما آلومینیوم اکسید و کربوکسی متیل سلولز بود. سپس فاکتورهای مؤثر در بهترین روش تثبیت انتخاب‌شده، با استفاده از روش‌شناسی سطح پاسخ و با به‌کارگیری طرح مرکب مرکزی بهینه‌سازی شدند. شایان ذکر است تاکنون گزارشی دربارة تولید پروتئاز توسط سویه‌های تثبیت‌شده با سدیم آلژینات - پلی وینیل الکل -کربنات کلسیم، سدیم آلژینات - نانوذرة آلومینیوم و کربوکسی متیل سلولز داده نشده است.

مواد و روش‌ها.

سویة میکروبی و روش کشت: سویة آئروموناس هیدروفیلا MSB16 در مطالعة قبلی از پساب کارخانجات سوسیس (اصفهان) با استفاده از محیط کشت آگاردار پودر شیر بدون چربی (اسکیم میلک) 2 درصد جداسازی شده بود (14). شمارة دستیابی توالی 16s rDNA این سویه در پایگاه داده‌ای GenBank برابر با KT006757 است. برای تهیه کشت خالص از باکتری جداسازی‌شده، از محیط تریپتیک سوی آگار استفاده شد. همچنین، به‌منظور تهیه مایة تلقیح باکتریایی به محیط کشت تولید پروتئاز، یک لوپ پر از کشت خالص باکتری مدنظر، در 5 میلی‌لیتر محیط تریپتیک سوی براث کشت داده شد. محیط تلقیح‌شده، در دمای 37 درجه سانتی‌گراد تا زمانی در انکوباتور نگهداری شد که جذب نوری محیط کشت در طول موج nm 630 معادل نیم مک فارلند (13/0- 08/0) معادل CFU/mL 108× 2-1 شود. به‌منظور بررسی اثر تثبیت سلول‌های میکروبی بر تولید پروتئاز، از محیط کشت مایع تولید پروتئاز حاوی 2 درصد پودر شیر بدون چربی استفاده شد. این محیط کشت در دمای 110 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه در اتوکلاو استریل شد. بعد از تلقیح 1 درصد حجم بر حجم از مایة تلقیح میکروبی آماده‌شده به محیط کشت تولید پروتئاز، گرمخانه‌گذاری (انکوباسیون) در دمای 30 درجه سانتی‌گراد به مدت 48 ساعت با سرعت هم‌زنی 180 دور بر دقیقه انجام شد.

تثبیت سویه با استفاده از آلژینات سدیم: برای تثبیت سویه با استفاده از پلیمر آلژینات سدیم، 5 میلی‌لیتر از سوسپانسیون باکتری دارای کدورت نیم مک فارلند (CFU/mL 108× 2-1) در 5 میلی‌لیتر محلول آلژینات سدیم 5 درصد به‌صورت سوسپانسیون درآمد. مخلوط پلیمر و باکتری با استفاده از سرنگ انسولین استریل به‌صورت قطره‌قطره به 45 میلی‌لیتر کلرید کلسیم 2/0 مولار از ارتفاع 2-1 سانتی‌متری اضافه شد. سویة تثبیت‌شده به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‌گراد در سرم فیزیولوژی استریل قرار گرفت (15).

.تثبیت سویه با استفاده از آلژینات سدیم - پلی وینیل الکل: برای تثبیت سویه با استفاده از آلژینات سدیم - پلی وینیل الکل، همانند روش قبلی از 5 میلی‌لیتر سوسپانسیون باکتری دارای کدورت نیم مک فارلند (CFU/mL 108× 2-1) استفاده شد؛ با این تفاوت که از استوک مخلوط آلژینات 5 درصد و پلی وینیل الکل 3 درصد استفاده شد. سپس مخلوط پلیمر و باکتری با استفاده از سرنگ انسولین استریل به‌صورت قطره‌قطره به 45 میلی‌لیتر کلرید کلسیم 2/0 مولار از ارتفاع 2-1 سانتی‌متری اضافه شد. سویة تثبیت‌شده به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‌گراد در سرم فیزیولوژی استریل قرار گرفت (16).

.تثبیت سویه با استفاده از آلژینات سدیم - پلی وینیل الکل - کربنات کلسیم: برای تثبیت سویه با استفاده از آلژینات سدیم - پلی وینیل الکل - کربنات کلسیم، ابتدا 5 میلی‌لیتر از سوسپانسیون باکتری دارای کدورت نیم مک فارلند (CFU/mL 108× 2-1)، در 5 میلی‌لیتر از استوک آلژینات 5 درصد - پلی وینیل الکل 3 درصد به‌صورت سوسپانسیون درآمد و سپس به مخلوط حاصل، 1 میلی‌لیتر کربنات کلسیم 3 درصد اضافه شد. مخلوط پلیمر و باکتری با استفاده از سرنگ انسولین استریل به‌صورت قطره‌قطره به 45 میلی‌لیتر کلرید کلسیم 2/0 مولار اضافه شد. سویة تثبیت‌شده به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‌گراد در سرم فیزیولوژی استریل قرار گرفت (17).

تثبیت سویه با استفاده از آلژینات سدیم - نانوذرة گاما آلومینیوم اکسید: به‌منظور تثبیت سویه با استفاده از آلژینات سدیم و نانوذرة گاما آلومینیوم اکسید (γ-Al2O3)، ابتدا رسوب سلولی حاصل از 5 میلی‌لیتر سوسپانسیون باکتری دارای کدورت نیم مک فارلند (CFU/mL 108× 2-1)، با استفاده از سانتریفیوژ در 4000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه به دست آمد. به رسوب باکتری، 5 میلی‌لیتر محلول نانوذره گاما آلومینیوم اکسید، اضافه و سپس مخلوط حاصل روی شیکر به مدت یک شب قرار داده شد تا نانوذرات به سطح میکروب متصل شوند. سپس سوسپانسیون سلولی در 5 میلی‌لیتر آلژینات سدیم 5 درصد حل شد. درنهایت، مخلوط پلیمر و باکتری با استفاده از سرنگ انسولین استریل به‌صورت قطره‌قطره به 45 میلی‌لیتر کلرید کلسیم 2/0 مولار اضافه شد. سویة تثبیت‌شده به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‌گراد در سرم فیزیولوژی استریل قرار گرفت.

تثبیت سویه با استفاده از کربوکسی متیل سلولز: به‌منظور تثبیت سویه با استفاده از کربوکسی متیل سلولز، 5 میلی‌لیتر از سوسپانسیون باکتری دارای کدورت نیم مک فارلند (CFU/mL 108× 2-1)، در 5 میلی‌لیتر کربوکسی متیل سلولز 2 درصد سوسپانسیون شد. مخلوط پلیمر و باکتری درنهایت به‌صورت قطره‌قطره به 45 میلی‌لیتر محلول کلرید فریک 05/0 مولار اضافه شد. سویة تثبیت‌شده به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‌گراد در سرم فیزیولوژی استریل قرار گرفت (18).

غربالگری بهترین روش تثبیت سویة میکروبی: به‌منظور انتخاب بهترین روش تثبیت سویة میکروبی، میزان تولید پروتئاز در سویة میکروبی تثبیت‌نشده (گروه کنترل) و تثبیت‌شده، بعد از گرمخانه‌گذاری (انکوباسیون) در دمای 30 درجه سانتی‌گراد به مدت 48 ساعت با سرعت هم‌زنی 180 دور بر دقیقه بررسی شد. سپس سلول‌های میکروبی تثبیت‌شده از محیط کشت تولید با استفاده از سانتریفیوژ در 4000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه از مابقی محیط کشت جدا شدند و در دمای 4 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند. بعد از گذشت یک ماه دوباره به محیط کشت تولید پروتئاز با همان شرایط قبلی تلقیح و در دمای 30 درجه سانتی‌گراد به مدت 48 ساعت با سرعت هم‌زنی 180 دور بر دقیقه گرمخانه‌گذاری شدند. سپس میزان تولید پروتئاز دوباره سنجش شد. هدف از این کار، بررسی پایداری سویة میکروبی تثبیت‌شده برای تولید پروتئاز در پلیمر آلی بود.

بهینه‌سازی فرایند تثبیت سویة میکروبی با استفاده از روش‌شناسی سطح پاسخ: به‌منظور شناسایی و بهینه‌سازی فاکتورهای مؤثر در تثبیت سویة میکروبی، از روش‌شناسی سطح پاسخ با به‌کارگیری طرح مرکب مرکزی استفاده شد. مقادیر کدشده و مورد آزمایش سه فاکتور مؤثر انتخاب‌شده، در جدول 1 آمده است.

 

 

جدول 1- سطوح متغیرهای مستقل مؤثر بر تثبیت سویة میکروبی براساس مقادیر کدشده و واقعی

+α

+1

0

-1

-α

نام متغیر

شماره متغیر

5/7

6

5/4

3

5/1

غلظت آلژینات (درصد)

X1

5/7

6

5/4

3

5/1

غلظت پلی وینیل الکل (درصد)

X2

5/7

6

5/4

3

5/1

غلظت کربنات کلسیم (درصد)

X3

 

هر فاکتور در پنج سطح و با استفاده از 20 آزمایش طرح مرکب مرکزی با شش تکرار در نقطة مرکزی بررسی شدند. در هر آزمایش که غلظت متفاوتی از مواد استفاده‌شده در تثبیت را داشت، سویة میکروبی به روش ذکرشده در بخش 2-4 تثبیت شد. سپس سویة تثبیت‌شده 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‌گراد در سرم فیزیولوژی استریل قرار گرفت. سپس به محیط کشت تولید پروتئاز با همان شرایط قبلی تلقیح و در دمای 30 درجه سانتی‌گراد به مدت 48 ساعت با سرعت هم‌زنی 180 دور بر دقیقه گرمخانه‌گذاری شد. سپس میزان تولید پروتئاز سنجش شد.

درنهایت، نتایج به‌دست‌آمده به‌صورت یک معادلة درجه دوم بر طبق معادلة شماره 1 به دست آمد که رابطة متغیر وابسته یا پاسخ (مقدار پروتئاز تولیدشده توسط سویة تثبیت‌شده) و متغیرهای مستقل را توصیف کند.

در معادلة 1، b0 عدد ثابت، bi ضرایب خطی (b1, b2, b3)، bii ضرایب درجه دوم (b11, b22, b33) و bij ضرایب میانکنشی (b12, b13, b23,) هستند.

1

 

 

سنجش فعالیت آنزیمی: برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیم پروتئاز از روش رنگ‌سنجی با استفاده از معرف فولین سیوکالتو بر طبق پروتکل با کمی تغییرات استفاده شد (19). بدین منظور، ابتدا رسوب باکتری با استفاده از سانتریفیوژ در 4000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد از مابقی محیط کشت حاوی آنزیم پروتئاز خارج سلولی باکتری جدا می‌شود. سپس 500 میکرولیتر از سوپرناتانت به 2500 میکرولیتر از محلول سوبسترای آنزیم شامل 65/0 درصد کازئینِ حل‌شده در فسفات بافر سالین (2/7pH ) اضافه و اجازه داده شد تا واکنش آنزیمی به مدت 10 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد ادامه یابد. سپس به‌منظور متوقف‌کردن واکنش آنزیمی، 2500 میکرولیتر از محلول تری کلرو استیک اسید 10 درصد به مخلوط واکنش اضافه شد. مخلوط حاصل به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد برای حصول اطمینان از توقف واکنش آنزیمی نگهداری شد. با توجه به اینکه میزان تولید پروتئاز بر مبنای فعالیت آنزیم در هیدرولیز پروتئین کازئین و به عبارت بهتر میزان آزادسازی تیروزین از سوبسترای آنزیم تخمین زده می‌شود، مخلوط واکنش به مدت 10 دقیقه و در 10000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد تا باقی‌ماندة پروتئین هضم‌نشده رسوب داده شود. سپس به 1000 میکرولیتر از سوپرناتانت به‌دست‌آمدة حاوی تیروزین آزاد، 2500 میکرولیتر کربنات سدیم 5/0 مولار و 500 میکرولیتر معرف فولین سیوکالتو 10 درصد اضافه شد. مخلوط حاصل، به مدت 10 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد، نگهداری و سپس جذب نوری آن در طول موج 660 نانومتر بررسی شد. با توجه به تعریف، یک واحد فعالیت آنزیمی (U/mL) به مقداری از آنزیم اطلاق می‌شود که باعث آزادسازی 1 میکروگرم تیروزین در دقیقه در شرایط واکنش شود. به‌منظور محاسبة میزان پروتئاز تولیدی از معادلة 2 استفاده شد.

در این معادله، مقدار x براساس فرمول رگرسیون نمودار استاندارد تیروزین و جذب نوری خوانده‌شده به دست می‌آید. در مورد نمونة کنترل منفی دقیقاً مراحل سنجش آنزیمی نمونه‌های آزمایش انجام شد؛ با این تفاوت که به‌جای آنزیم در لولة کنترل منفی 500 میکرولیتر آب مقطر اضافه شده است.

 

2

 

 

رسم منحنی استاندارد تیروزین: با استفاده از منحنی استاندارد تیروزین در غلظت‌های مشخص، می‌توان فرمولی به دست آورد که از روی جذب نمونة خود، به میزان تولید یا فعالیت آنزیم پروتئاز در نمونه پی ببریم. برای این کار به استوک 1/1 میلی‌مولار تیروزین نیاز است. با توجه به اینکه جرم مولی تیروزین 19/181 (گرم بر مول) است، 10 میلی‌لیتر از استوک 1/1 میلی‌مولار آن با حل‌کردن تقریباً 002/0 گرم تیروزین در آب مقطر به دست می‌آید. برای رسم منحنی استاندارد تیروزین، باید ابتدا غلظت‌های مختلف تیروزین را مطابق جدول 2 تهیه کرد.

جدول 2- تهیه غلظت‌های مختلف تیروزین به‌منظور رسم منحنی استاندارد (19)

نمونه

استوک 1/1 میلی‌مولار تیروزین (µL)

آب دیونیزه (µL)

غلظت تیروزین (µg/mL)

غلظت تیروزین (mM)

1

0

1000

0

0

2

10

990

2

011/0

3

25

975

5

027/0

4

50

950

10

055/0

5

100

900

20

11/0

6

200

800

40

22/0

7

250

750

50

275/0

8

300

700

60

331/0

9

400

600

80

441/0

10

500

500

100

551/0

11

1000

0

200

1/1

 

در روش سنجش آنزیم پروتئاز با استفاده از جذب نوری به هریک از غلظت‌های تهیه‌شدة تیروزین، 5/2 میلی‌لیتر محلول کربنات سدیم 5/0 مولار و سپس 5/0 میلی‌لیتر معرف فولین سیوکالتو اضافه می‌شود. سپس لوله‌ها در شرایط تاریکی در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 دقیقه انکوبه شدند. بعد از اتمام مدت زمان انکوباسیون، جذب هریک از لوله‌ها در طول موج 660 نانومتر خوانده شد. داده‌های مربوط به جذب هریک از غلظت‌های مختلف تیروزین، روی محور yها و غلظت‌های مختلف تیروزین، روی محور xها قرار گرفت و معادلة رگرسیون آن در برنامة Excel محاسبه شد. گفتنی است هر غلظت تیروزین در 3 تکرار، اندازه‌گیری و جذب لولة 1 به‌عنوان بلانک در نظر گرفته می‌شود.

بررسی‌های آماری: تمامی آزمایشات به‌منظور بررسی‌های آماری به‌صورت سه تکرار انجام شد. نتایج به‌دست‌آمده با استفاده از تست آزمون تحلیل واریانس[12] و تست دانکن[13] با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخة 22 (SPSS 22, SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) بررسی شد. تفاوت معنادار آماری بین نتایج گروه کنترل و تست هنگامی گزارش شد که p-value کمتر از 05/0 به دست آمد. طراحی آزمایشات روش‌شناسی سطح پاسخ و نمودارهای مربوطه با استفاده از نرم‌افزار Design Expert نسخة 11 (Stat-Ease, Minneapolis, USA) به دست آمد.

نتایج.

.انتخاب بهترین روش تثبیت با استفاده از مطالعة تک عاملی: نتایج مربوط به اثر تثبیت سویة MSB16 بر تولید پروتئاز در شکل 1 آورده شده است. میزان تولید پروتئاز توسط سویة تثبیت‌نشده برابر با U/mL 2/96 به دست آمد. این میزان تولید آنزیم، با گذشت زمان، حدود 3/2 برابر کاهش یافت (U/mL 3/41)؛ درحالی‌که تولید پروتئاز توسط سویه‌های تثبیت‌شده نسبت به سویة تثبیت‌نشده افزایش نشان داده است و همچنین با وجود اینکه تمامی سویه‌های تثبیت‌شده بعد از گذشت یک ماه، کاهش در تولید پروتئاز نشان دادند، میزان کاهش آنها نسبت به سویة تثبیت‌نشده کمتر بود.

مطابق شکل 1، تولید آنزیم پروتئاز خارج سلولی توسط سلول‌ تثبیت‌شدة MSB16 به خوبی در تمام بسترهای تثبیت بررسی‌شده، صورت گرفته است؛ با وجود این، از میان پلیمرهای مطالعه‌شده، بالاترین میزان تولید پروتئاز با استفاده از پلیمر سدیم آلژینات - پلی وینیل الکل - کربنات کلسیم (U/mL 6/186) به دست آمد. پایین‌ترین میزان تولید پروتئاز خارج سلولی، توسط سلول‌های تثبیت‌شده در پلیمرهای سدیم آلژینات - نانوذرة گاما آلومینیوم اکسید (U/mL 6/159) و کربوکسی متیل سلولز (U/mL 7/158) به دست آمده است. پایین‌ترین میزان تولید آنزیم بعد از گذشت یک ماه نیز در سویة تثبیت‌شده در پلیمرهای سدیم آلژینات - نانوذرة گاما آلومینیوم اکسید مشاهده شده است (U/mL 99). با توجه به نتایج مطالعة تک عاملی، بهترین روش تثبیت سویة MSB16 پلیمر سدیم آلژینات - پلی وینیل الکل - کربنات کلسیم در نظر گرفته شد.

شکل 1- اثر روش‌های مختلف تثبیت سویة میکروبی MSB16 بر تولید آنزیم پروتئاز. سدیم آلژینات (روش 1)، سدیم آلژینات - پلی وینیل الکل (روش 2)، سدیم آلژینات - پلی وینیل الکل - کربنات کلسیم (روش 3)، سدیم آلژینات - نانوذرة گاما آلومینیوم اکسید (روش 4) و کربوکسی متیل سلولز (روش 5). در هر روش، ستون‌های سفید بیان‌کنندة تولید آنزیم با استفاده از سویة تازه تثبیت‌شده و ستون‌های هاشورزده تولید آنزیم با استفاده از سویة تثبیت‌شده بعد از گذشت یک ماه است.

.بهینه‌سازی فاکتورهای مؤثر در روش تثبیت سویه با استفاده از روش‌شناسی سطح پاسخ: در مرحلة بعد، غلظت آلژینات، پلی وینیل الکل و کربنات کلسیم با استفاده از روش‌شناسی سطح پاسخ بهینه‌سازی شد (جدول 3). نتایج آزمایشات طرح مرکب مرکزی نشان دادند سویة تثبیت‌شده در پلیمر حاوی آلژینات 3 درصد - پلی وینیل الکل 3 درصد - کربنات کلسیم 3 درصد، بالاترین میزان تولید پروتئاز (U/mL 32/205) را نشان داده است (جدول 3)؛ درحالی‌که در مطالعة تک عاملی، میزان تولید پروتئاز با استفاده از پلیمر سدیم آلژینات 5 درصد - پلی وینیل الکل 3 درصد - کربنات کلسیم 3 درصد حدود U/mL 6/186 به دست آمده بود.

جدول 3- نتایج مربوط به آزمایشات روش‌شناسی سطح پاسخ با استفاده از طرح مرکب مرکزی

شماره آزمایش

X1

X2

X3

پروتئاز

(U/mL)

آلژینات (%)

پلی وینیل الکل (%)

کربنات کلسیم (%)

1

3

3

3

32/205

2

6

3

3

48/197

3

3

6

3

27/199

4

6

6

3

5/195

5

3

3

6

63/187

6

6

3

6

28/194

7

3

6

6

78/190

8

6

6

6

38/199

9

5/1

5/4

5/4

61/198

10

5/7

5/4

5/4

3/197

11

5/4

5/1

5/4

29/194

12

5/4

5/7

5/4

98/194

13

5/4

5/4

5/1

5/200

14

5/4

5/4

5/7

55/191

15

5/4

5/4

5/4

35/199

16

5/4

5/4

5/4

12/199

17

5/4

5/4

5/4

45/196

18

5/4

5/4

5/4

25/199

19

5/4

5/4

5/4

16/198

20

5/4

5/4

5/4

18/200

 

از میان مدل‌های پیشنهادی توسط نرم‌افزارDesign Expert  برای متغیر پاسخ (تولید پروتئاز در سویة تثبیت‌شده)، مدل درجه دوم مناسب‌ترین مدل پیشنهادی بود (001/0 p-value <). مدل چندجمله‌ای درجه دوم به‌دست‌آمده در معادلة 3 آمده است. در این معادله، X1 برابر با غلظت آلژینات، X2 معادل غلظت پلی وینیل الکل و X3 معادل غلظت کربنات کلسیم است.

 

3

پروتئاز (U/mL) = + (75/198) + (1052/0*X1)+ (1011/0*X2) - (97/2*X3) + (7525/0*X1X2) + (36/3*X1X3) + (03/2*X2X3) – (2491/0*X12) – (42/1*X22) – (14/93*X32)

 

نتایج آنالیز واریانس داده‌های مربوط به روش طرح مرکب مرکزی در جدول 4 آورده شده است. مقادیر F (59/25) و p (0001/0>) مربوط به مدل، معناداربودن آماری مدل به‌دست‌آمده را تأیید می‌کنند. بالابودن ضریب تشخیص (9584/0) و معنادارنبودن تست عدم برازش (فقدان تناسب) نیز صحت مدل به‌دست‌آمده را نشان می‌دهند (جدول 4). مقدار ضریب تشخیص نشان می‌دهد در 84/95 درصد موارد، تغییرات پاسخ به خوبی با مدل توضیح داده می‌شوند. براساس مقادیر p فاکتورهای بررسی‌شده در روش تثبیت، غلظت کربنات کلسیم به شدت در تولید پروتئاز سویة تثبیت‌شده تأثیرگذار بوده است. همچنین با توجه به معناداربودن آماری مقدار p به‌دست‌آمده برای X22 می‌توان گفت غلظت پلی وینیل الکل نیز جزء فاکتورهای مؤثر محسوب می‌شود.

 

 

جدول 4- نتایج آنالیز واریانس تولید پروتئاز سویة آئروموناس هیدروفیلا MSB16 تأثیرگرفته از متغیرهای مستقل در طول آزمایش بهینه‌سازی

عامل

مجموع مربعات

درجه آزادی

میانگین مربعات

مقدار F

مقدار P

معناداربودن آماری

ضرایب رگرسیون

مدل

63/ 286

9

87/31

59/25

0001/0>

+

  

غلظت آلژینات (X1)

1512/0

1

1512/0

1214/0

7348/0

-

1052/0+

غلظت پلی وینیل الکل (X2)

1395/0

1

1395/0

1120/0

7448/0

-

1011/0+

غلظت کربنات کلسیم (X3)

41/120

1

41/120

68/96

0001/0>

+

97/2-

X1X2

53/4

1

53/4

64/3

0856/0

-

7525/0+

X1X3

18/90

1

18/90

41/72

0001/0>

+

36/3+

X2X3

13/33

1

13/33

60/26

0004/0

+

03/2+

X1²

8940/0

1

8940/0

7178/0

4167/0

-

2491/0-

X2²

18/29

1

18/29

43/23

0007/0

+

42/1-

X3²

50/12

1

50/12

04/10

01/0

+

9314/0-

باقی‌مانده

45/12

10

25/1

 

 

 

  

فقدان تناسب

02/4

5

8049/0

4774/0

7818/0

-

  

خطای خالص

43/8

5

69/1

 

 

 

 

خطای کلی

28/299

19

 

    

 

  

 

نمودار پرشیدگی به‌دست‌آمده از مدل پیشنهای، اطلاعات بیشتری را دربارة اثر فاکتورهای بررسی‌شده بر تولید پروتئاز سویة تثبیت‌شده به دست می‌دهد (شکل 2). طبق این نمودار، تولید پروتئاز توسط سویة تثبیت‌شده، به‌دلیل انحنا و شیب بیشتر در نمودار پرشیدگی به غلظت‌های بررسی‌شدة کربنات کلسیم واکنش بیشتری نشان داده است و با تولید پروتئاز رابطة عکس دارد. همچنین، متغیر پاسخ (تولید پروتئاز) علاوه بر غلظت کربنات کلسیم به غلظت پلی وینیل الکل نیز حساس بوده است.

شکل 2- نمودار پرشیدگی به‌منظور مقایسة اثر تمام متغیرهای مستقل مؤثر بر تثبیت سویة MSB16 در سدیم آلژینات - پلی وینیل الکل - کربنات کلسیم در نقطة مرکزی. در این شکل A، B و C به‌ترتیب برابر با آلژینات، پلی وینیل الکل و کربنات کلسیم است.

نمودارهای دوبعدی و سه‌بعدی اثر میانکنش متغیرهای مستقل بررسی‌شده بر تولید پروتئاز، در شکل 3 نشان داده‌ شده‌اند. 

در این نمودارها قسمت‌های آبی و سبز، محدودة مربوط به مقادیر کمتر تولید آنزیمی و قسمت‌های زرد و نارنجی محدودة مربوط به مقادیر بالاتر تولید آنزیمی را نشان می‌دهند. این نمودارها نیز می‌توانند اطلاعاتی را دربارة محدودة تأثیرگذاری فاکتورها بر متغیر پاسخ در اختیار بگذارند؛ برای مثال، با توجه به شکل‌های 3-ب و 3-ج به خوبی مشخص است که کاهش غلظت کربنات کلسیم (محدودة 3-5/1 میلی‌مولار)، به افزایش تولید پروتئاز توسط سویة تثبیت‌شده منجر شده است. همچنین در شکل 3-الف مشخص است در مقایسه با پلی وینیل الکل محدودة وسیع‌تری از آلژینات می‌تواند در تثبیت سویه استفاده شود؛ به‌طوری‌که بر تولید آنزیم تأثیر نگذارد. محدودة غلظت آلژینات بهتر است از 5/1 درصد (معادل عدد 1- در شکل 3-الف) بیشتر باشد.

شکل 3- نمودارهای دوبعدی و سه‌بعدی اثر میانکنش متغیرهای مستقل بررسی‌شده بر تولید پروتئاز توسط سویة MSB16 تثبیت‌شده در سدیم آلژینات - پلی وینیل الکل - کربنات کلسیم. الف) اثر میانکنش غلظت آلژینات و غلظت پلی وینیل الکل، ب) اثر میانکنش غلظت آلژینات و غلظت کربنات کلسیم، ج) اثر میانکنش غلظت پلی وینیل الکل و غلظت کربنات کلسیم بر فعالیت آنزیم

بحث و نتیجه‌گیری

همواره یکی از چالش‌های مهم مواجه‌شده در فرایندهای تخمیر میکروبی در صنعت، کاهش هزینه‌های مربوطه بوده است. در این راستا، تکنولوژی تثبیت سویه، کمک‌کننده است؛ زیرا هزینه‌های مربوط به نگهداری مایة تلقیح میکروبی به محیط‌های کشت، به‌علت پایداری بیشتر سویة میکروبی در گذر زمان و همچنین با افزایش قابلیت تکرارپذیری فرایند تخمیر، کاهش می‌یابد. با توجه به راحت‌تربودن جمع‌آوری سویه‌های میکروبی تثبیت‌شده بعد از اتمام فرایند تخمیر، هزینه‌های مربوط به خالص‌سازی محصول نیز کاهش می‌یابد (20). باوجود این مزایا، گاهی تثبیت سویة میکروبی با تأثیر بر عواملی مانند تغییرات در کشش سطحی و فشار اسمزی، در دسترس بودن آب و اجزای محیط کشت، مورفولوژی سلول و نفوذپذیری غشای سلولی، می‌تواند بر رشد، فیزیولوژی و فعالیت متابولیکی سلول میکروبی و درنتیجه بر بازده تولید محصولات میکروبی برای افزایش یا کاهش تولید محصول مؤثر باشد؛ بنابراین در این مطالعه، اثر روش‌های مختلف تثبیت سویة میکروبی MSB16 بر توانایی تولید پروتئاز آن بررسی شده است.

نتایج رهیافت تک عاملی این مطالعه نشان دادند تولید آنزیم پروتئاز خارج سلولی توسط سلول‌ تثبیت‌شدة MSB16 در بسترهای مختلف (یعنی سدیم آلژینات، سدیم آلژینات - پلی وینیل الکل، سدیم آلژینات - پلی وینیل الکل - کربنات کلسیم، سدیم آلژینات - نانوذرة گاما آلومینیوم اکسید و کربوکسی متیل سلولز) بیشتر از میزان آنزیم تولیدشده توسط سلول‌های تثبیت‌نشده صورت می‌گیرد؛ برای مثال، تولید آنزیم پروتئاز توسط سویة تثبیت‌شده در آلژینات، افزایش حدود 86 درصد را نسبت به سلول‌های آزاد نشان داده است. نتیجة مشابهی در مطالعة آدیناریا[xiv] و همکاران (2005) گزارش شد که در آن تولید پروتئاز توسط سویة تثبیت‌شدة باسیلوس سوبتیلیسPE-11 در آلژینات، حدود 03/79 درصد بوده است که نسبت به دیگر پلیمرهای استفاده‌شده توسط آنها مانند کاراگینان، پلی آکریل آمید، آگار - آگار و ژلاتین، کارآمدتر بود (21). علت تولید بیشتر آنزیم توسط سلول‌های تثبیت‌شده نسبت به سلول‌های آزاد را می‌توان به افزایش غلظت سلول‌ها در اثر تثبیت و درنتیجه افزایش بازده تولید محصول مرتبط دانست. همچنین، میزان تولید پروتئاز در سویه‌های تثبیت‌شده در مطالعة حاضر، بعد از گذشت یک ماه بیشتر از سویة تثبیت‌نشده بود. این نتایج تأیید می‌کنند تثبیت سویة MSB16 می‌تواند در کاهش هزینه‌های تولید آنزیم پروتئاز مؤثر باشد.

همچنین ترکیب پلیمر آلژینات و پلی وینیل الکل، بستر مناسبی برای تثبیت سویة مدنظر بوده است؛ به‌طوری‌که تولید پروتئاز را نسبت به سلول‌های آزاد حدود 81 درصد بهبود بخشید. در مطالعة دانگ[xv] و همکاران (2017) نشان داده شد تثبیت سویه‌های اکسیدکنندة آمونیوم توسط آلژینات - پلی وینیل الکل نسبت به آلژینات به تنهایی، به افزایش پایداری سویه‌ها در pH قلیایی و هنگام استفادة مکرر از سویة تثبیت‌شده منجر می‌شود؛ به‌طوری‌که سلول‌های تثبیت‌شده در آلژینات، به راحتی در pH قلیایی و بعد از 5 بار استفاده آسیب می‌دیدند. این در حالی است که سلول‌های تثبیت‌شده در آلژینات - پلی وینیل الکل، علاوه بر پایداری بیشتر در استفادة مکرر از سویه و در pH قلیایی، توانایی بهتری برای اکسیداسیون آمونیوم داشتند (22). به همین دلیل پلیمر آلژینات - پلی وینیل الکل یکی از پلیمرهای بررسی‌شده در این مطالعه بوده است؛ با وجود این، در مطالعة حاضر افزودن پلی وینیل الکل به آلژینات برای تثبیت سویة MSB16، باعث کاهش اندک در میزان تولید پروتئاز شده است. این امر می‌تواند به‌دلیل انعطاف‌پذیری بیشتر و استحکام کمتر بیدهای حاصل از آلژینات به تنهایی باشد که اجازة انتقال راحت‌تر مواد را به بید فراهم می‌کند (16).

در بین روش‌های مختلف تثبیت، سلول‌های تثبیت‌شده در بیدهای آلژینات - نانوذرة گاما آلومینیوم اکسید، نسبت به روش‌های دیگر، بعد از گذشت یک ماه کاهش بیشتری از تولید پروتئاز نشان داده‌اند؛ علت این امر نیز می‌تواند به خاصیت ضدمیکروبی نانوذرات نسبت داده شود (23).

از میان روش‌های بررسی‌شدة تثبیت، بالاترین میزان تولید پروتئاز با استفاده از پلیمر آلژینات - پلی وینیل الکل - کربنات کلسیم به دست آمد. بر طبق مطالعة وانگ[xvi] و همکاران (2014) بیدهای آلژینات حاوی کربنات کلسیم، شکلی مشابه منافذ کندوی عسل دارند که به تسهیل انتقال سوبسترا و مواد غذایی به سلول‌های تثبیت‌شده در بید منجر می‌شوند. این موضوع علت بالاتربودن نرخ تولید آنزیم توسط سویة‌ MSB16 را در روش آلژینات - پلی وینیل الکل - کربنات کلسیم نسبت به آلژینات - پلی وینیل الکل توضیح خواهد داد (24).

با توجه به نتایج به‌دست‌آمده در مرحلة غربالگری روش تثبیت، در مرحلة بعد، فاکتورهای مؤثر بر روش تثبیت سویه با استفاده از ترکیب پلیمری آلژینات - پلی وینیل الکل- کربنات کلسیم با روش‌شناسی سطح پاسخ بررسی شدند. نتایج آزمایشات طرح مرکب مرکزی نشان دادند سویة تثبیت‌شده در پلیمر حاوی 3 درصد آلژینات - 3 درصد پلی وینیل الکل - 3 درصد کربنات کلسیم، بالاترین میزان تولید پروتئاز (U/mL 32/205) را داشته است. به عبارت دیگر، در مقایسه با تثبیت سویة MSB16 با روش ذکرشده در مطالعة کورکوتاس[xvii] و همکاران (2004)، یعنی استفاده از پلیمر حاوی 5 درصد آلژینات - 3 درصد پلی وینیل الکل - 3 درصد کربنات کلسیم (U/mL 63/186)، تولید پروتئاز حدود 19 درصد و نسبت به سویة میکروبی تثبیت‌نشده (U/mL 2/96) حدود 131 درصد (13/2 برابر) افزایش یافته است. این نتایج نشان می‌دهند روش تثبیت گزارش‌شده در مطالعة کورکوتاس و همکاران (2004)، برای تثبیت مناسب بوده است و همچنین روش‌شناسی سطح پاسخ استفاده‌شده در مطالعة حاضر، توانسته است هم غلظت آلژینات مصرفی و هزینه‌های مربوطه را کاهش و هم با بهینه‌سازی غلظت مواد استفاده‌شده در این روش، میزان تولید آنزیم پروتئاز را افزایش دهد.

با توجه به نتایج آنالیز واریانس، از میان متغیرهای بررسی‌شده، غلظت کربنات کلسیم اثر معناداری بر تولید پروتئاز توسط سویة MSB16 دارد. همچنین، میانکش بین غلظت آلژینات و کربنات کلسیم (0001/0>p-value ) و میانکنش بین غلظت پلی وینیل الکل و کربنات کلسیم (0004/0p-value=) ازنظر آماری معنادار بود. همچنین، تولید پروتئاز توسط سویة تثبیت‌شده، به‌دلیل انحنا و شیب بیشتر در نمودار پرشیدگی به غلظت‌های بررسی‌شدة کربنات کلسیم واکنش بیشتری نشان داده است و می‌توان گفت با آن تقریباً رابطة عکس دارد؛ دلیل این امر را می‌توان اینگونه توضیح داد که کربنات کلسیم بر pH اثرگذار است (16). با توجه به اینکه سویة بررسی‌شده تنها می‌تواند در محدودة pH خنثی یا کمی قلیایی تولید پروتئاز کند، احتمالاً معکوس‌بودن رابطة غلظت کربنات کلسیم و تولید پروتئاز توسط سویة مدنظر به همین دلیل بوده است. همچنین، متغیر پاسخ (تولید پروتئاز) علاوه بر غلظت کربنات کلسیم به غلظت پلی وینیل الکل حساس بوده است.

پیشنهاد می‌شود روش‌های دیگر تثبیت که افزایش چشمگیری در تولید پروتئاز سویة تثبیت‌شده داشتند نیز با استفاده از روش‌شناسی سطح پاسخ بررسی شوند. همچنین پیشنهاد می‌شود اثر روش تثبیت آلژینات - پلی وینیل الکل - کربنات کلسیم برای تولید دیگر آنزیم‌های کاربردی استفاده شود.

سپاسگزاری

نویسندة مقاله از دکتر زهرا اعتمادی‌فر، عضو هیئت علمی گروه زیست‌شناسی دانشگاه اصفهان، به پاس همکاری‌شان تشکر و قدردانی می‌کند.

 

[1]- Immobilization on solid carrier surfaces

[2]- Entrapment within a porous matrix

[3]- Cell flocculation (Aggregation)

[4]- Mechanical containment behind a barrier

[5]- Kumar

[6]- Vats

[7]- Bacillus subtilis

[8]- Potumarthi

[9]- Bacillus licheniformis NCIM-2042

[10]- Plackett–Burman design

[11]- Full factorial design

[12]- ANOVA

[13]- Duncan’s multiple range

[xiv]- Adinarayana

[xv]- Dong

[xvi]- Wang

[xvii]- Kourkoutas

مراجع
  • Adinarayana K, Jyothi B, Ellaiah P. Production of alkaline protease with immobilized cells of Bacillus subtilis PE-11 in various matrices by entrapment technique. AAPS Pharm SciTech. 2005; 6 (3): 391-97.
  • Kourkoutas Y, Bekatorou A, Banat IM, Marchant R, Koutinas AA. Immobilization technologies and support materials suitable in alcohol beverages production: a review. Food microbiology. 2004; 21 (4): 377-97.
  • Junter GA, Jouenne T. Immobilized viable microbial cells: from the process to the proteome… or the cart before the horse. Biotechnology advances. 2004; 22 (8): 633-658.
  • Martins SC, Martins CM, Fiúza LM, Santaella ST. Immobilization of microbial cells: A promising tool for treatment of toxic pollutants in industrial wastewater. African journal of biotechnology. 2013; 12 (28): 4412-18.
  • Zacheus OM, Iivanainen EK, Nissinen TK, Lehtola MJ, Martikainen PJ. Bacterial biofilm formation on polyvinyl chloride, polyethylene and stainless steel exposed to ozonated water. Water Research. 2000; 34 (1): 63-70.
  • Romo S, Pérez‐Martínez C. The use of immobilization in alginate beads for long‐term storage of pseudanabaena galeata (cyanobacteria) in the laboratory. Journal of phycology. 1997; 33 (6): 1073-76.
  • Shrinivas D, Kumar R, Naik GR. Enhanced production of alkaline thermostable keratinolytic protease from calcium alginate immobilized cells of thermoalkalophilic Bacillus halodurans JB 99 exhibiting dehairing activity. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 2012; 39 (1): 93-98.
  • Borin GP, de Melo RR, Crespim E, Sato HH, Contesini FJ. An overview on polymer gels applied to enzyme and cell immobilization. Polymer Gels. 2018; 63-86.
  • Kumar R, Vats R. Protease production by Bacillus subtilis immobilized on different matrices. New York Science Journal. 2010; 3 (7): 20-24.
  • Klein J, Ziehr H. Immobilization of microbial cells by adsorption. Journal of biotechnology. 1990; 16 (1-2): 1-15.
  • Potumarthi R, Subhakar C, Pavani A, Jetty A. Evaluation of various parameters of calcium-alginate immobilization method for enhanced alkaline protease production by Bacillus licheniformis NCIM-2042 using statistical methods. Bioresource Technology. 2008; 99 (6): 1776-86.
  • Tari C, Genckal H, Tokatlı F. Optimization of a growth medium using a statistical approach for the production of an alkaline protease from a newly isolated Bacillus L21. Process Biochemistry. 2006; 41 (3): 659-65.
  • Baş D, Boyacı IH. Modeling and optimization I: Usability of response surface methodology. Journal of food engineering. 2007; 78 (3): 836-45.
  • Borhani MS, Etemadifar Z, Jorjani E. Evaluation of Aeromonas Hydrophila MSB16 Protease Production in Response to Low-Intensity Electric Current, Surfactants, and Nanoparticles. Biological Journal of Microorganism. 2020; 8 (32): 1771-78.

 

 

  • Anwar A, Qader SA, Raiz A, Iqbal S, Azhar A. Calcium alginate: a support material for immobilization of proteases from newly isolated strain of Bacillus subtilis KIBGE-HAS. World Applied Sciences Journal. 2009; 7 (10): 1281-86.
  • Wani PA, Olamide AN, Rafi N, Wahid S, Wasiu IA, Sunday OO. Sodium Alginate/Polyvinyl Alcohol Immobilization of Brevibacillus brevis OZF6 Isolated from Waste Water and Its Role in the Removal of Toxic Chromate. Biotechnology Journal International. 2016; 31: 1-10.
  • Cho SH, Lim SM, Han DK, Yuk SH, Im GI, Lee JH. Time-dependent alginate/polyvinyl alcohol hydrogels as injectable cell carriers. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 2009; 20 (7-8): 863-876.
  • Chandran P, Das N. Degradation of diesel oil by immobilized Candida tropicalis and biofilm formed on gravels. Biodegradation. 2011; 22 (6): 1181-89.
  • Cupp-Enyard C. Sigma's non-specific protease activity assay-casein as a substrate. Journal of Visualized Experiments. 2008; 19: 899.
  • Ramakrishna SV, Prakasham RS. Microbial fermentations with immobilized cells. Current Science. 1999: 87-100.
  • Adinarayana K, Jyothi B, Ellaiah P. Production of alkaline protease with immobilized cells of Bacillus subtilis PE-11 in various matrices by entrapment technique. AAPS Pharm SciTech. 2005; 6 (3): 391- 97.
  • Dong Y, Zhang Y, Tu B. Immobilization of ammonia-oxidizing bacteria by polyvinyl alcohol and sodium alginate. Brazilian journal of microbiology. 2017; 48 (3): 515-21.
  • Rheima AM, Anber AA, Abdullah HI, Ismail AH. Synthesis of Alpha-Gamma Aluminum Oxide Nanocomposite via Electrochemical Method for Antibacterial Activity. Nano Biomedicine and Engineering. 2021; 13 (1):1-5.
  • Wang HQ, Hua F, Zhao YC, Li Y, Wang X. Immobilization of Pseudomonas DG17 onto sodium alginate–attapulgite–calcium carbonate. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 2014; 28 (5): 834-42.
آمار
تعداد مشاهده مقاله: 852
تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 201


سامانه مدیریت نشریات علمی. قدرت گرفته از سیناوب