بررسی سنتز برون سلولی نانوذرات مگنتیت توسط باکتری اندوفیت Bacillus sp. BR06 تحت استراتژی عصارة عاری از سلول

مقدمه

نانوذرات، ذراتی با حداقل یک بعد در مقیاس نانو (1 تا 100 نانومتر) هستند که به‌طور گسترده‌ای در طبیعت به‌‌عنوان محصولی از پدیده‌های طبیعی همانند فعالیت‌های آتشفشانی، فرایند‌های دریایی، دودهای حاصل از آتش‌سوزی جنگل‌ها، پخت غذا و اگزوز وسایل حمل‌و‌نقل وجود دارند (1 و 2). با کوچک‌ترشدن ذرات و عبور از وضعیت میکروذرات به نانوذرات، با افزایش نسبت سطح به حجم، رفتار اتم‌های روی سطح یک ذره، بر آنهایی که در داخل ذره قرار گرفته‌اند غلبه پیدا می‌کند؛ در چنین شرایطی فلزات خواص فیزیکی و شیمیایی متفاوتی نسبت به نمونة معمولی فلز ارائه می‌دهند (3 و 4). نانوذرات فلزی تولید‌شده توسط فناوری نانو، به‌دلیل کاربردهای بسیار در زمینه‌های زیست‌پزشکی، زیست‌محیطی، تحویل دارو و نانوپزشکی درخور توجه قرار گرفته است (5). نانوذرات پارامغناطیسی مگنتیت (Fe₃O₄) با توجه به تأثیر آنها در بسیاری از زمینه‌های کاربردی از قبیل تحویل دارو، تصویربرداری با تشدید مغناطیسی، جداسازی سلول، مهندسی بافت، فعالیت ضدمیکروبی و درمان هایپرترمی^[1] برای سرطان، طی چند دهه اخیر شایان توجه دانشمندان قرار گرفته است. اندازه ذرات، خواص مغناطیسی و خواص سطحی نانوذرات مذکور اهمیت زیادی دارند. گزارش شده است این خواص تأثیرگرفته از روش سنتز هستند (6). نانوذرات مگنتیت در مطالعات ردیابی سلول، تحویل ژن، کنترل الگوی سلولی و ساخت بافت‌های پیچیده سه‌بعدی نیز کاربرد دارند (7). طیف گسترده‌ای از روش‌های فیزیکوشیمیایی برای سنتز نانوذرات Fe₃O₄، ازجمله روش هیدروترمال^[2]، روش سل‌ژل^[3]، روش هم‌رسوبی، حلال گرمایی، سنتز الکتروشیمیایی و سونوشیمیایی گزارش شده است (8 و 9). روش‌های شیمیایی و فیزیکی به‌دلیل پیچیدگی فرایند، گران قیمت بودن، آلودگی زیست‌محیطی به‌دلیل استفاده از مواد شیمیایی سمی و عدم استفاده از نانوذرات حاصل در کاربردهای زیستی، برای تولید مواد زیست‌سازگار مناسب نیستند (10)؛ بنابراین، توسعة روش‌های زیستی به‌عنوان یک روش نسبتاً ساده، ارزان و سازگار با محیط زیست برای سنتز نانوذرات از اهمیت بالایی برای گسترش کاربردهای زیست پزشکی آنها برخوردار است (11). در دو دهه گذشته مطالعات زیادی برای تولید میکروبی نانوذرات مگنتیت انجام شده که به شناسایی جدایه‌ها‌ی باکتری و قارچی مختلف شامل سویه‌های آسینتوباکتر^[4] (12)، ورتیسیلیوم^[5] و فوزاریوم^[6] (13)، ترموآنئروباکتر^[7] (14)، باسیلوس سابتیلیس^[8] (15)، تیوباسیلوس تیوپاروس^[9] (16)، باسیلوس مگاتریوم^[10] (17) منجر شده‌اند. میکروب‌های اندوفیتی (باکتری یا قارچ) در یک رابطة همزیستی با گیاهان‌اند. تراکم بیشتری از اندوفیت‌ها در قسمت‌های زیرزمینی گیاهان نسبت به قسمت‌های بالایی زمین وجود دارد و بیشتر در ریشه‌ها یافت می‌شوند. برای همزیستی پایدار، اندوفیت‌ها ترکیبات مختلفی را ایجاد می‌کنند که رشد گیاه را تحریک می‌کند و مکانیسم دفاعی گیاهان را بهبود می‌بخشد و آنها را از بیماری‌زاهای گیاهی محافظت می‌کند (18). به‌تازگی، سنتز نانوذرات مختلف شامل نقره، طلا، مس، اکسید روی، کلرید کلسیم، اکسید کبالت و اکسید منیزیم ازطریق اندوفیت‌ها گزارش شده که افق جدیدی از تحقیقات روی روابط زیست‌شناسی و فناوری نانو را به وجود آورده است (19)؛ با این حال، مطالعه‌ای در ارتباط با قابلیت سنتز زیستی نانوذرات مگنتیت توسط باکتری‌های اندوفیت انجام نشده است. میکروب‌های اندوفیت همزیست با گیاهان دارای مخزن منحصربه‌فرد از متابولیت‌های ثانویه بالقوه‌اند که تمایل به کاهش (احیا) یون‌های فلزی به نانوذرات دارند. در این مطالعه، قابلیت سویه‌های بومی اندوفیت به‌عنوان زیست‌کاتالیزگر در سنتز نانوذرات مگنتیت بررسی شد.

مواد و روش‌ها

مواد شیمیایی و محیط‌های کشت استفاده‌شده: اکسید آهن (III) با فرمول شیمیایی Fe₂O₃ با خلوص بالای 99 درصد از شرکت سیگما - آلدریچ^[11] آمریکا خریداری شد. محیط کشت نوترینت براث (پپتون 10 گرم در لیتر، عصارة گوشت 10 گرم در لیتر و نمک کلرید سدیم 5 گرم در لیتر) از هایمدیا^[12]هند خریداری شد. آگار و محیط‌های کشت سیمون سیترات آگار، نشاسته آگار و کازئین آگار از شرکت مرک^[13] آلمان خریداری شدند. کیت رنگ‌آمیزی گرم از تالیژن پارس واقع در شهرک علمی تحقیقاتی اصفهان تهیه شد. دیسک اکسیداز از پادتن طب ایران خریداری شد. کیت استخراج DNA شرکت متابیون^[14] آلمان خریداری شد. برای تهیه ژل آگارز از آگارز تهیه‌شده از سیگما - آلدریچ استفاده شد. مواد به‌کاررفته در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز^[15] شامل مسترمیکس^[16] و آغازگرهای جهانی^[17] از شرکت سیناژن ایران تهیه شدند.

.جداسازی باکتری‌های اندوفیت و خالص‌سازی آنها: 22 جدایة باکتری اندوفیت جداشده از ریشة گیاه توت‌فرنگی جمع‌آوری‌شده از مزارع مختلف توت‌فرنگی در استان کردستان، به‌عنوان جدایه‌های منتخب در بررسی سنتز زیستی نانوذرات مگنتیت استفاده شدند. برای جداسازی باکتری‌های اندوفیت، نمونه‌ها پس از انتقال به آزمایشگاه، به قطعات کوچک‌تر تقسیم شدند و پس از شستشو با آب مقطر، به‌منظور ضدعفونی سطحی بافت‌ها به مدت 1دقیقه در اتانول 70 درصد وزنی / حجمی و سپس به مدت 2 دقیقه در هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد وزنی / حجمی و پس از آن در اتانول 70 درصد به مدت 30 ثانیه قرار داده شدند. برای حذف هیپوکلریت سدیم، بافت‌های ضدعفونی‌شده سه بار با آب مقطر استریل شستشو داده می‌شوند. بافت‌های ضدعفونی‌شده به‌طور کامل له و 10 میلی‌لیتر آب به هر نمونه اضافه شد. پس از گذشت 30 دقیقه، 100 میکرولیتر از سوسپانسیون تهیه‌شده روی محیط کشت نوترینت آگار غنی‌شده با 5 گرم در لیتر عصارة مخمر به‌صورت چمنی کشت داده شدند. سپس نمونه‌ها به مدت یک هفته در دمای 25 درجة سانتی‌گراد برای رشد کلنی‌ها در داخل انکوباتور نگه‌داری شدند (20)؛ درنهایت، جدایه‌های خالص باکتری ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از ویژگی‌های ریخت‌شناسی انتخاب ﺷﺪﻧﺪ.

بررسی توانایی سنتز برون‌سلولی نانوذرات مگنتیت توسط جدایه‌های باکتری اندوفیت تحت استراتژی عصارة عاری از سلول: از استراتژی عصارة عاری از سلول^[18] برای بررسی سنتز برون‌سلولی نانوذرات مگنتیت و انتخاب جدایة باکتری برتر استفاده شد (21). برای این منظور، از محیط کشت نوترینت آگار یک لوپ کامل کلنی خالص از باکتری‌های رشد‌یافته (کشت 24 ساعته) در محیط کشت نوترینت براث (50 میلی‌لیتر محیط کشت مایع در ارلن‌های 250 میلی‌لیتری) تلقیح و در انکوباتور شیکردار به مدت 24 ساعت با دور rpm 200 و دمای 25 درجة سانتی‌گراد گرماگذاری شد. از این محیط به‌عنوان کشت بذر به‌منظور تلقیح در محیط‌های کشت استفاده شد. یک درصد از سوسپانسیون باکتری‌های تهیه‌شده (با غلظت معادل نیم مک‌فارلند CFU/ml10⁸ ×5/1) در ارلن‌های 250 میلی‌لیتری حاوی 50 میلی‌لیتر محیط کشت نوترینت براث در دمای 25 درجة سانتی‌گراد روی شیکر مدور (200 دور در دقیقه)، به مدت 24 ساعت گرماگذاری شد. به‌منظور جداکردن تودة زیستی باکتری از محیط کشت مایع نوترینت براث، از سانتریفیوژ یخچال‌دار با سرعت 8000 دور در دقیقه در دمای 4 درجة سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه استفاده شد. بعد از سه بار شستشو با آب دوبار تقطیر استریل، 5 گرم از تودة زیستی مذکور در ارلن‌های 250 میلی‌لیتری حاوی 50 میلی‌لیتر آب دوبار تقطیر استریل ریخته شد و به مدت 24 ساعت در شیکر انکوباتوردار در دمای 25 درجة سانتی‌گراد و دور شیکر rpm 200 قرار داده شد. تودة زیستی باکتری با استفاده از سانتریفیوژ پس از طی دوره انکوباسیون، جدا و از عصارة عاری از تودة‌ زیستی باکتری جمع‌آوری‌شده به‌عنوان بیوکاتالیست برای تبدیل زیستی اکسید آهن Fe₂O₃ به نانو‌اکسید آهن مگنتیت (Fe₃O₄ NP) استفاده شد. برای این منظور محلول استوک Fe₂O₃ با غلظت نهایی 5/2 میلی‌مولار، به ارلن‌های 250 میلی‌لیتری حاوی 50 میلی‌لیتر از عصارة عاری از سلول باکتری اضافه شده و در شرایط دمایی 25 درجة سانتی‌گراد و دور شیکر rpm 200 به مدت‌زمان 48 ساعت انکوبه‌گذاری شد. به‌عنوان محیط‌های کنترل منفی به‌طور همزمان از محلول اکسید آهن Fe₂O₃ (بدون تلقیح عصارة عاری از سلول) و عصارة عاری از سلول (بدون حضور Fe₂O₃) استفاده شد. ویژگی نانو‌ذرات مگنتیت تشکیل‌شده در محلول واکنش، مورد آنالیزهای چشمی و اسپکتروفتومتری مرئی ماورای بنفش^[19] قرار داده شد (22).

شناسایی فنوتیپی و مولکولی جدایة باکتری اندوفیت منتخب: شناسایی اولیه جدایة باکتری BR06 با آزمایش‌های ریخت‌‌‌شناسی و بیوشیمیایی نظیر بررسی رنگ کلنی، واکنش رنگ‌آمیزی گرم، بررسی شکل میکروسکوپی باکتری با استفاده از میکروسکوپ نوری و الکترونی روبشی، تست‌های کاتالاز و اکسیداز، توانایی تولید اسپور، تست مصرف سیترات، هیدرولیز نشاسته، هیدرولیز کازئین، تست احیای نیترات، رشد در دماها و pH‌های مختلف، رشد در غلظت‌های مختلف نمک کلرید‌ سدیم، تولید اسید از منابع کربوهیدراتی (گلوکز، فروکتوز، گالاکتوز، لاکتوز، سوکروز، آرابینوز، تری‌هالوز و گلیکوژن) براساس دستورالعمل کتاب برگی^[20] انجام شد (23). به‌منظور استخراج DNA ژنومی، از کیت استخراج DNA طبق دستورالعمل شرکت سازنده استفاده شد. با هدف شناسایی مولکولی جدایة باکتری BR06 از آغازگرهای جهانی ژن 16s rDNA fd1 (5´-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´)^[21] و rp2 (5´-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3´)^[22] استفاده شد (24). واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در دستگاه ترموسایکلر (BioRAD ساخت کشور آمریکا) با حجم 25 میکرولیتر حاوی 5/12 میکرولیتر مسترمیکس، یک میکرولیتر از هر آغازگر رفت و برگشت (با غلظت اولیه 25 میکرومولار)، یک میکرولیتر DNA الگو (با غلظت 80 نانوگرم بر میکرولیتر) و 5/9 میکرولیتر آب مقطر دیونیزه استریل انجام شد. چرخه حرارتی به‌صورت یک چرخه واسرشت‌سازی^[23] اولیه به مدت چهار دقیقه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد شروع شد و در ادامه به‌صورت 30 چرخه شامل واسرشت‌سازی در دمای 94 درجه سانتی‌گراد به مدت یک دقیقه، اتصال آغازگر در دمای 52 درجه به مدت یک دقیقه، بسط در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت دو دقیقه و بسط نهایی در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه در نظر گرفته شد. محصول واکنش PCR روی ژل آگارز 1 درصد ارزیابی شد (25). توالی‌یابی محصول واکنش PCR توسط ABI3730xl DNA sequencer شرکت ماکروژن کره‌جنوبی انجام شد. توالی‌های به‌دست‌آمده پس از ویرایش توسط نرم‌افزار BioEdit با توالی‌های موجود در بانک اطلاعات ژن با استفاده از ابزار جستجوی بلاست^[24] مقایسه شدند. درنهایت درخت فیلوژنی به روش Neighbor Joining با بوت استرپ^[25] 1000 و با استفاده از نرم‌افزار MEGA نسخه 7 انجام شد (26).

.اثر غلظت‌های مختلف Fe₂O₃ بر تولید برون‌سلولی نانوذرة مگنتیت: برای بررسی اثر غلظت‌های اولیه پیش‌ساز Fe₂O₃ بر سنتز برون‌سلولی نانوذرة مگنتیت (Fe₃O₄ NP)، غلظت‌های مختلفی از Fe₂O₃ شامل 1، 5/2، 5، 5/7 و 10میلی‌مولار به عصارة عاری از تودة زیستی اضافه شد. بعد از 48 ساعت، تشکیل نانومگنتیت با روش اسپکتروفتومتر بررسی شد. گفتنی است تمام آزمایش‌ها در این مرحله در دمای واکنش 25 درجه سانتی‌گراد، pH برابر 7 و دور شیکر برابر rpm 200 انجام شدند. تمام آزمایش‌ها در سه تکرار انجام شدند (27).

اثر دورة انکوباسیون: به‌منظور تعیین بهترین زمان واکنش تبدیل زیستی تحت استراتژی عصارة عاری از سلول، اثرات دورة انکوباسیون شامل 6، 12، 18، 24، 36 و 48 ساعت روی سنتز برون‌سلولی نانومگنتیت در غلظت بهینة اکسید آهن فریک بررسی شد. تمام آزمایش‌ها در سه تکرار انجام شدند (21).

.مشاهدات ظاهری و دستگاهی برای تأیید سنتز زیستی برون‌سلولی نانوذرات مگنتیت: نانوذرات مگنتیت تشیکل‌شده در مخلوط واکنش حاصل از برهمکنش عصارة عاری از سلول جدایة باکتری اندوفیت BR06 در معرض Fe₂O₃، با استفاده از تغییر رنگ، آنالیز طیف‌های اسپکتروفتومتری در ناحیه فرابنفش^[26] (Specord 210 ساخت کشور آلمان)، طیف‌سنجی تبدیل فوریه مادون قرمز^[27] (Bruker Vector 22 ساخت کشور آلمان)، الکترومیکروگراف‌های تهیه‌شده با میکروسکوپ الکترونی روبشی^[28] مجهز به طیف‌سنج پراش انرژی پرتو ایکس (TESCAN Mira 3-LMu ساخت کشور چک) و همچنین دستگاه طیف‌سنجی پراش اشعه ایکس^[29] (Philips X'Pert-MPD ساخت کشور هلند) بررسی شدند. با هدف تعیین طیف جذبی اسپکتروفتومتری محلول رویی به‌دست‌آمده از سانتریفیوژ، نمونه‌ها با سرعت g×10000 به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شدند و سپس جذب نمونه‌ها در طول موج 200 تا 800 نانومتر بررسی شد. به‌منظور استخراج نانوذرات مگنتیت تشکیل‌شده در مخلوط واکنش زیست تبدیلی، ابتدا عصارة عاری از تودة زیستی باکتری از فیلترهای سرنگی 22/0 میکرونی عبور داده و بعد از آن با هدف رسوب نانو‌ذرات، از سانتریفیوژ با 14000 دور در دقیقه به مدت 30 دقیقه استفاده شد. در آخر، بعد از چند بار شستشوی نانوذرات با استفاده از آب دیونیزه‌شدة سترون، نمونه نانوذره در دستگاه خشک‌کن انجمادی^[30] (Alpha 1-2Dplus ساخت کشور آلمان) به مدت 24 ساعت، خشک و آنالیزهای ذکرشده روی آنها انجام شد (27). از آنالیز SEM-EDX به‌منظور بررسی شکل، اندازه ذرات و عناصر تشکیل‌دهندة ترکیب نانوذرات استفاده شد. از نرم‌افزار ImageJ ورژن a 52/1 و با شمارش حداقل 120 ذره برای بررسی توزیع نانوذرات و تعیین میانگین قطر نانوذرات استفاده شد. از آنالیز FTIR به‌منظور شناخت گروه‌های عاملی دخیل در ماکروملکول‌های احتمالی درگیر در سنتز و پایداری نانوذرات استفاده شد. الگوی طیف‌سنج پراش اشعه ایکس با لامپی از جنس آند مس با طول موجKα  حدود 54/1 آنگستروم در 40 کیلوولت و 40 میلی‌آمپر با هدف تعیین ساختار کریستالی نانوذرات تشکیل‌شده در واکنش زیست تبدیلی استفاده شد.

نتایج

.غربالگری سویه‌های باکتری با قابلیت سنتز برون‌سلولی نانوذرات مگنتیت: 22 جدایة باکتری اندوفیت در آزمایشات سنتز برون‌سلولی نانوذرات مگنتیت (Fe₃O₄) تحت استراتژی عصارة عاری از سلول بررسی شدند. براساس نتایج به‌دست‌آمده تنها جدایة باکتری BR06 (جداشده از ریشه گیاه توت‌فرنگی مزارع توت‌فرنگی مریوان) قادر به تبدیل زیستی پیش‌ساز Fe₂O₃ به نانومگنتیت (Fe₃O₄ NP) در غلظت 5/2 میلی‌مولار بود که با استفاده از تغییر رنگ و طیف‌سنجی جذبی اسپکتروفتومتری مشخص شد. Fe₂O₃ تیمارنشده با عصارة عاری از سلول (محیط کنترل) دارای رنگ قرمز آجری است؛ درحالی‌که در نمونة تیمارشده با عصارة عاری از سلول، رنگ محلول واکنش به‌دلیل تشکیل نانوذرات مگنتیت به رنگ قهوه‌ای تیره تغییر رنگ داده بود. آنالیز نمونه‌ها با اسپکتروفتومتری مرئی ماورای بنفش یک پیک جذبی را در طول موج 252 نانومتر نشان داد که براساس منابع معتبر بیشینة پیک جذبی نانوذرات مگنتیت در طول موج‌های بین 250 تا 350 است (22). در محلول تیمار‌نشده (عاری از عصارة عاری از سلول)، در طول موج‌های بین 250 تا 400 نانومتر، هیچ پیک جذبی مرتبط با رزونانس پلاسمون سطحی مشاهده نشده است (شکل 1).

شکل 1- آنالیزهای اسپکتروفتومتری محلول Fe₂O₃ (در غلظت 5/2 میلی‌مولار) تیمارنشده (a) و Fe₂O₃ تیمارشده (b) با عصارة عاری از سلول جدایة باکتری BR06 در شرایط دمایی 25 درجه سانتی‌گراد و دور شیکر rpm 200 پس از 48 ساعت گرمخانه‌گذاری

..شناسایی فنوتیپی و مولکولی جدایة منتخب BR06: جدایة باکتری اندوفیت باکتری BR06 انتخاب شد که براساس طیف‌سنجی توانایی احیای زیستی Fe₂O₃ به نانوذرات Fe₃O₄ را داشت و براساس خصوصیات مورفولوژیک، فیزیولوژیک، انجام تست‌های بیوشیمیایی و آنالیزهای مولکولی و فیلوژنتیکی شناسایی شد. با توجه به شکل 2، جدایة باکتری منتخب به‌صورت میله‌ای شکل با میانگین ابعاد 7/0 تا 6/1 میکرون ازنظر طول، 4/0 تا 85/0 از نظر عرض و دارای کلنی‌های موکوئیدی به رنگ سفید کرمی شکل است.

شکل 2- ویژگی‌های ریخت‌شناسی جدایة باکتری منتخب BR06. (a) کلنی باکتری در محیط کشت نوترینت آگار پس از 24 ساعت گرماگذاری در دمای 30 درجه سانتی‌گراد و (b) تصویر میکروسکوپ الکترونی SEM جدایة باکتری

در ادامه و با انجام تست‌های بیوشیمیایی متداول در تشخیص باکتری‌ها مشخص شد جدایة مذکور باکتری گرم مثبت اسپوردار بوده است که ازنظر تست‌های بیوشیمیایی کاتالاز، تست احیای نیترات، هیدرولیز ژلاتین و هیدرولیز نشاسته، مثبت و در مقابل ازنظر تست‌های اکسیداز و مصرف سیترات منفی بود. باکتری مذکور قابلیت رشد در دماهای 4 تا 55 درجه سانتی‌گراد، رشد در pHهای 4 تا 10 و همچنین رشد در شرایط بدون حضور نمک و درصدهای مختلف نمک کلرید سدیم تا 14 درصد را داشت. همچنین ازنظر تولید اسید از منابع کربوهیدراتی، تولید اسید از گلوکز، فروکتوز، سوکروز، گالاکتوز و لاکتوز، مثبت و ازنظر تست تخمیر آرابینوز و تری‌هالوز منفی بود. براساس نتایج ویژگی‌های فنوتیپی و تست‌های بیوشیمیایی، کتاب‌های مرجع و مقالات منتشرشده در این ارتباط، جدایة باکتری BR06 به‌طور موقت به‌عنوان باسیلوس سیامنسیس^[31] تشخیص داده شد (28). به دنبال آن و به‌منظور تعیین هویت دقیق جدایة باکتری منتخب، ژن 16S rDNA ازطریق آغازگرهای همگانی و به روش PCR تکثیر شد. نتایج حاصل از بلاست‌کردن در سایت NCBI نشان داد جدایة مذکور مشابهت بیش از 99 درصدی با سویه‌های متعلق به گونة باکتری باسیلوس سیامنسیس دارد. تجزیه و تحلیل‌های فیلوژنیک تأید کرد جدایة باکتری مذکور متعلق به جنس باسیلوس است و ازنظر قرابت ژنتیکی بیشترین نزدیکی را با گونة باکتری باسیلوس سیامنسیس دارد. در ادامه نتایج ترسیم درخت فیلوژنتیک به روشNeighbor-Joining تأیید کرد جدایة باکتری BR06 را می‌توان ازنظر تاکسونومی به‌عنوان سویه‌ای از جنس باسیلوس طبقه‌بندی کرد (شکل 3).

شکل 3- درخت فیلوژنی رسم‌شده براساس توالی ژنی 16S rDNA که وابستگی جدایة باکتری BR06 را با جدایه‌های باکتری متعلق به گونه‌های مختلف جنس باسیلوس نشان می‌دهد. درخت مذکور براساس الگوریتم neighbor-joining و به کمک نرم‌افزار MEGA. 7 ترسیم شد. اعداد داخل پرانتز نشان‌دهندة شماره دسترسی سویه‌های باکتری ثبت‌شده در بانک ژنی است.

اثر غلظت‌های مختلف :Fe₂O₃ همان‌گونه که در شکل 4 نشان داده شده است، با افزایش غلظت اولیه Fe₂O₃ از 1 تا 5 میلی‌مولار، افزایش تدریجی در طیف جذبی در رابطه با تشکیل خارج سلولی نانوذرات مگنتیت در واکنش زیست تبدیلی تحت استراتژی عصارة عاری از سلول، پس از 48 ساعت گرماگذاری، در شرایط دمایی 25 درجه سانتی‌گراد، pH برابر 7 و دور شیکر rpm 200 مشاهده می‌شود. بیشینة سنتز در غلظت 5 میلی‌مولار وجود دارد. در غلظت‌های بالاتر از 5 میلی‌مولار سنتز برون‌سلولی نانوذرات مگنتیت احتمالاً به‌دلیل سمیت Fe₂O₃ کاهش یافته است. با توجه به نتایج به‌دست‌آمده از غلظت بهینه 5 میلی‌مولار برای آزمایشات بعدی استفاده شد.

شکل 4- نتایج طیف‌های جذبی اسپکتروفتومتری مرتبط با تأثیر غلظت‌های مختلف Fe₂O₃ بر سنتز برون‌سلولی نانوذرات مگنتیت در مخلوط واکنش حاوی عصارة عاری از سلول B. siamensis strain BR06 تیمارشده با Fe₂O₃. نتایج ارائه‌شده میانگین سه بار آزمایش بوده و بار 1± معرف انحراف معیار است.

اثر دورة انکوباسیون: به‌منظور بهبود احیای زیستی Fe₂O₃ به نانوذرات مگنتیت در شرایط بهینه به‌دست‌آمده در مراحل قبل واکنش (غلظت بهینه 5 میلی‌مولار)، اثر زمان انکوباسیون (6، 12، 18، 24، 36 و 48 ساعت) سنجش شد (شکل 5). براساس نتایج به‌دست‌آمده، سنتز نانوذرات مگنتیت پس از 6 ساعت واکنش در حضور عصارة عاری از سلول آغاز شده و پس از 24 ساعت به بیشینة مقدار خود رسیده است. به عبارت دیگر بیشترین طیف جذبی نانوذرات تشکیل‌شده در مخلوط واکنش زیست تبدیلی پس از 24 ساعت مشاهده شده است. در فاصله زمانی 24 تا 36 ساعت، یک کاهش تدریجی در طیف جذبی نانوذرات مگنتیت مشاهده شده است؛ درحالی‌که در بازه‌های زمانی 36 تا 48 ساعت، طیف نسبتاً ثابت مانده که نشان‌دهندة پایداری نانوذرات خارج سلولی تشکیل‌شده در مخلوط واکنش است.

شکل 5- نتایج طیف‌های جذبی اسپکتروفتومتری مرتبط با تأثیر زمان انکوباسیون بر سنتز برون‌سلولی نانوذرات مگنتیت در مخلوط واکنش حاوی عصارة عاری از سلول B. siamensis strain BR06 تیمارشده با Fe₂O₃ در غلظت بهینه 5 میلی‌مولار. نتایج ارائه‌شده میانگین سه بار آزمایش بوده و بار 1± معرف انحراف معیار است.

نتایج آنالیزهای مرتبط با میکروسکوپ الکترونی و طیف‌سنجی نانوذرات مگنتیت تولیدشده ازطریق استراتژی عصارة عاری از سلول: نانوذرات مگنتیت تولیدی به‌وسیلة عصارة عاری از سلول در شرایط بهینه (غلظت بهینه 5 میلی‌مولار و دورة انکوباسیون 24 ساعت)، پس از استخراج و خشک‌کردن با دستگاه فریز درایر، به‌منظور تعیین مورفولوژی و دامنة پراکنش ذرات توسط میکروسکوپ الکترونی SEM بررسی شدند که نتایج در شکل 6 نشان داده شده‌اند.

شکل 6- (a) تصاویر حاصل از FESEM نانوذرات برون سلولی مگنتیت تولیدی تحت استراتژی CFE و (b) هیستوگرام توزیع اندازه نانوذرات مگنتیت

با توجه به شکل 6، بررسی ساختار سطحی نانوذرات تولیدی توسط میکروسکوپ الکترونی FESEM، سنتز نانوذرات مگنتیت کروی به‌صورت گل کلمی با میانگین اندازه ذرات 34 نانومتری را نشان می‌دهد. در ادامه، طیف EDS که با هدف تجزیه و تحلیل ساختاری نانوذرات مگنتیت سنتزی صورت گرفت، حضور پیک‌های مربوط به عناصر آهن و اکسیژن را در نانوذرات سنتزی نشان داد (شکل 7).

شکل 7- طیف EDS نانوذرات برون‌سلولی مگنتیت تولیدی تحت استراتژی CFE

برای مشخص‌کردن ساختار کریستالی نانوذرات برون‌سلولی مگنتیت سنتزشده توسط باکتری اندوفیت B.siamensis strain BR06 آزمون پراش اشعه ایکس (XRD) انجام شد. الگوی XRD نانوذرات تهیه‌شده در شکل 8 آورده شده است. پیک‌های قابل رؤیت به‌ترتیب مربوط به صفحات بلوری (220)، (311)، (400)، (422)، (511) و (440) است که با تطابق پیک‌های این صفحات و زوایای پرش آنها با نمونة استاندارد نانوذرات مگنتیت، مگنتیت‌بودن نانوذرات اکسید آهن تولیدشده در این مطالعه تأیید شد (29).

در ادامه و به‌منظور بررسی گروه‌های عاملی پوشانندة دخیل در سنتز و پایداری نانوذرات مگنتیت سنتزی، آنالیز FTIR انجام شد. برای این منظور پودر خشک‌شدة نانوذرات مگنتیت در دمای 800 درجه سانتی‌گراد توسط FTIR آنالیز شد (شکل 9).

شکل 8- الگوی پراش پرتو ایکس (XRD) نانوذرات برون‌سلولی مگنتیت تولیدی تحت استراتژی CFE

شکل 9- طیف جذب FTIR نانوذرات برون‌سلولی مگنتیت سنتزشده تحت استراتژی CFE

براساس مشخصه‌یابی طیف‌سنجی مادون قرمز تبدیل فوریه، پیک نسبتاً پهن در ناحیه cm^-1 3446 متعلق به گروه هیدروکسیل (-OH) است. پیک ظاهرشده در محدودة 2916 مربوط به گروه C-H کششی موجود در ترکیبات آلی است. پیک ظاهرشده در ناحیه 2360 متعلق به گروه کربونیل (C=O)، پیک در ناحیه 1384 متعلق به گروه C-H و پیک در ناحیه 1116 مربوط به گروه C-O کششی است. همچنین نمایان‌شدن پیک در نواحی 447 و 559 مربوط به تشکیل پیوندهای فلزی و نشان‌دهندة باندهای Fe-O مربوط به نانوذرات مگنتیت است. در مجموع به نظر می‌رسد گروه‌های عاملی -OH، C-O، C=O و C-H مرتبط با ترکیبات آلی موجود در عصارة عاری از سلول باکتری مذکور به‌عنوان عامل پوشاننده^[xxxii] در سنتز زیستی نانوذرات مگنتیت نقش داشته‌اند (30).

بحث و نتیجه‌گیری

سنتز و کاربردهای نانومواد از دهه گذشته تاکنون بخش جالبی از فناوری نانو بوده است. چندین روش فیزیکی و شیمیایی برای سنتز نانوذرات عنصری، اکسید فلزی و سولفید فلزی استفاده شده است. روش‌های فیزیکی کار بسیار دشواری است؛ درحالی‌که روش‌های شیمیایی معمولاً شامل استفاده از مواد کاهش‌دهندة مختلف، فرایند رادیولیز و تکنیک‌های الکتروشیمیایی‌اند. با این حال، به‌دلیل تولید پسماندهای خطرناک و مقرون به صرفه نبودن، روش‌های فیزیکوشیمیایی ارجحیت کمتری دارند (1 و 4). استفاده از مواد شیمیایی سمی نیز کاربردهای پزشکی نانوذرات را در زمینه‌های بالینی محدود می‌کند. مسیرهای زیستی سنتز نانوذرات فلزی ازطریق میکروب‌ها به‌دلیل سمیت کم، زیست‌سازگاری و دوست‌دار محیط زیست بودن شایان توجه بسیاری قرار می‌گیرند. توسعة فرایندهای مبتنی بر شیمی سبز برای سنتز نانوذرات با اشکال، اندازه و پراکندگی دقیق، یک منطقة قابل رشد از نانوزیست فناوری است (4 و 5). سنتز برون‌سلولی و درون‌سلولی نانوذرات مگنتیت توسط میکروارگانیسم‌های مختلف گزارش شده است. بهاراد^[xxxiii] و همکاران با استفاده از سویة باکتری Acientobacter sp. در مخلوط واکنش حاوی فروسیانید پتاسیم / فریک سیانید پتاسیم موفق به سنتز نانوذرات مکعبی مگنتیت با ابعاد 10 تا 40 نانومتر پس از 24 ساعت گرماگذاری شدند (12). در تحقیق مشابهی بهاراد و همکاران با استفاده از سویه‌های قارچی .Verticillium sp و Fusarium oxysporum موفق به سنتز برون‌سلولی نانوذرات کروی مگنتیت با پراکنش اندازة ذرات 20 تا 50 نانومتری شدند (13). مون^[xxxiv] و همکاران با استفاده از سویة باکتری Thermoanaerobacter sp. TOR-39 و طی یک واکنش تخمیری موفق به سنتز نانوذرات مغناطیسی مگنتیت با میانگین اندازة 13 نانومتری شدند (14). ساندارام^[xxxv] و همکاران به کمک سویة باکتری Bacillus subtilis جداشده از خاک ریزوسفری موفق به سنتز برون‌سلولی نانوذرات مغناطیسی مگنتیت با پراکنش اندازة ذرات 60 تا 80 نانومتری شدند (15). السی^[xxxvi] و همکاران موفق به سنتز نانوذرات مغناطیسی مگننیت توسط باکتری احیاکنندة آهن با نام Thiobacillus thioparus (جداشده از خاک اطراف معادن آهن) شدند (16). قانی^[xxxvii] و همکاران با استفاده از باکتریBacillus megaterium (PTCC1656)  نانوذرات مگنتیت با شکل مکعبی و اندازة 40 تا 60 نانومتری تولید کردند (17). از میان روش‌های سنتز سبز با توجه به تنوع و سازگاری زیاد باکتری‌‌ها در شرایط شدیداً سخت، ابزارهای مهمی برای به دست آوردن نانوذرات در نظر گرفته می‌شوند. سنتز باکتریایی نانوذرات به‌دلیل مصرف کم انرژی و قابلیت کنترل فرایند بسیار امیدوارکننده است. مشخص شده است سنتز خارج سلولی برای استخراج نانوذرات کارآمدتر و آسان‌تر است؛ در این حالت، بیوسنتز نانوذرات فلزی در برابر اکسیداسیون مقاومت بیشتری دارند و استفاده از آنها در زمینه‌های مختلف امکان‌پذیر می‌شود (21 و 32). در این پژوهش، شناسایی جدایة باکتری اندوفیت با قابلیت تولید برون‌سلولی نانوذرات مگنتیت مطالعه و بررسی شد. میکروب‌های اندوفیت به‌صورت رابطة همزیستی با گیاهانی زندگی می‌کنند که دارای مخزن منحصربه‌فرد و همه‌جانبه از متابولیت‌های ثانویة بالقوه درمانی‌اند و به کاهش (احیا) یون‌های فلزی به نانوذرات تمایل دارند (18 و 19). به همین منظور، 22 جدایة باکتری اندوفیت جداشده از قسمت‌های مختلف گیاه توت‌فرنگی، جمع‌آوری و در آزمایشات تولید خارج سلولی نانوذرات مگنتیت (Fe₃O₄) و به‌وسیلة استراتژی عصارة عاری از سلول بررسی شدند. پس از انجام آزمایشات مشخص شد جدایة باکتری strain BR06 B. siamensis قادر به تبدیل زیستی پیش‌ساز F_e2O₃ به نانومگنتیت (Fe₃O₄NP) بود که با استفاده از طیف‌سنجی و میکروسکوپی مشخص شد. نانوذرات مگنتیت برون‌سلولی تولیدی به‌وسیلة عصارة عاری از سلول در شرایط بهینه (غلظت 5 میلی‌مولار اکسید آهن فریک و پس از 24 ساعت انکوباسیون)، کروی به ‌شکل گل کلمی با میانگین اندازة ذرات 34 نانومتری‌اند. سنتز برون‌سلولی شامل ترشح آنزیم‌های خارج سلولی، کاهش زیستی و کلاهک‌گذاری ذرات است که کاربردهای زیادی در زمینه‌های مختلف دارد (31). مزیت سنتز برون‌سلولی فرایندهای پایین‌دستی و تصفیه راحت‌تر از روش‌های داخل سلولی است (32). از دستاوردهای حاصل از این پژوهش می‌توان به معرفی جدایه‌های باکتری اندوفیت به‌عنوان یک منبع زیستی بالقوه به‌منظور تولید برون‌سلولی نانوذرات کوچک و با اندازة مطلوب مگنتیت تحت استراتژی عصارة عاری از سلول اشاره کرد. امید است با بهینه‌سازی شرایط واکنش زیست تبدیلی بتوان به سنتز برون‌سلولی نانوذرات با کفایت مگنتیت در مقیاس‌های وسیع^[xxxviii] با امکان استفاده در زمینه‌های مختلف صنعتی و دارویی دست یافت.

سپاسگزاری

این مقالة پژوهشی مستخرج از پایان‌نامه کارشناسی ارشد خانم یگانه مس‌چی (کد رهگیری در ایران داک: 1466381 تاریخ 12/10/1397) با راهنمایی دکتر مراحم آشنگرف و با حمایت مالی و معنوی دانشگاه کردستان اجرا شده است که بدینوسیله نویسندگان این مقاله مراتب تشکر و قدردانی خود را اعلام می‌‌دارد.

[1]- Hyperthermia

[2]- Hydrothermal method

[3]- Sol-gel

[4]- Acientobacter sp.

[5]- Verticillium sp.

[6]- Fusarium sp.

[7]- Thermoanaerobacter sp.

[8]- Bacillus subtilis

[9]- Thiobacillus thioparus

[10]- Bacillus megaterium

[11]- Sigma-Aldrich, St. Louis, MO

[12]- HiMedia

[13]- E. Merck, Darmstadt, Germany

[14]- Mi-bacterial Genomic DNA Isolation Kit mi-BD 100

[15]- Polymerase chain reaction (PCR)

[16]- Master mix

[17]- Universal primers

[18]- Cell Free Extract= CFE

[19]- UV-Vis spectrophotometer

[20]- Bergey

[21]- Forward primer

[22]- Reverse primer

[23]- Denaturation

[24]- BLAST

[25]- Bootstrap

[26]- UV-vis spectrophotometer

[27]- Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR)

[28]- Field emission scanning electron microscopy equipped with energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDX)

[29]- X-ray diffractometer (XRD)

[30]- Freeze Dryer

[31]- Bacillus siamensis

[xxxii]- Capping agent

[xxxiii]- Bharde

[xxxiv]- Moon

[xxxv]- Sundaram

[xxxvi]- Elcey

[xxxvii]- Ghani

[xxxviii]- Scale-up