بهینه‌کردن تولید شکل محلول آنزیم ال-آسپاراژیناز باکتری نمک‌دوست به‌طور نوترکیب در اشریشیا کلی

مقدمه

آنزیم ال-آسپاراژیناز (ال-آسپاراژین‌آمیدوهیدرولاز، EC 3.5.1.1) هیدرولیز ال-آسپاراژین به ال-آسپارتیک‌اسید و آمونیاک را کاتالیز می‌کند. رده‌های خاصی از سلول‌های سرطانی به‌علت رشد غیرعادی خود و همچنین بیان‌نشدن آنزیم آسپاراژین‌سنتتاز (1 و 2) به دریافت ال-آسپاراژین از منبع خارج‌سلولی (خون) نیاز دارند؛ درحالی‌که سلول‌های سالم به‌تنهایی ال-آسپاراژین لازم را برای خود تأمین می‌کنند (3)؛ بنابراین، آنزیم ال-آسپاراژیناز می‌تواند با حذف منبع خارج‌سلولی ال-آسپاراژین، سلول‌های سرطانی خون را به‌طور اختصاصی از بین ببرد و درنتیجه، این آنزیم به‌طور گسترده در درمان لوسمی حاد لنفوئیدی استفاده می‌شود (4). کاربرد آنزیم ال-آسپاراژیناز به مصرف‌های پزشکی محدود نمی‌شود و این آنزیم به‌علت قابلیت کاهش میزان اکریل‌آمید تا 90 درصد بدون ایجاد تغییر در طعم غذا، در تولید غذاهای سرخ‌شده در صنایع غذایی به کار ‌می‌رود (5)؛ ‌علاوه‌براین، گزارش‌هایی از عملکرد آنتی‌اکسیدانی ال-آسپاراژیناز وجود دارند (6).

تاکنون آنزیم ال-آسپاراژیناز با منشأ سویه‌های باکتریایی مختلف جداسازی و تولید شده است؛ اما در حال حاضر، ال-آسپاراژینازهای مشتق‌شده از اشریشیا کلی^[i] و اروینیا کریزانتمی^[ii] به‌شکل داروهای شیمی‌درمانی مؤثر در درمان لوسمی حاد لنفوئیدی در بازار وجود دارند. استفاده از آنزیم‌های یادشده با مشکلاتی همراه است؛ ازجمله اینکه این دو آنزیم در محلول نمکی با اسمولاریتۀ شبیه به خون (9/0 درصد) به‌ترتیب 40 و 80 درصد فعالیت خود را از دست می‌دهند (7)؛ این امر سبب افزایش دوز لازم دارو و بروز حساسیت‌های شدید در برخی بیماران می‌شود (8-10) و از‌این‌رو، جستجو برای یافتن ال-آسپاراژینازهای جایگزین ادامه دارد (6 و 11-16).

پیش‌ازاین، گروه پژوهشی مقالۀ حاضر آنزیم ال-آسپاراژیناز جداشده از هالوموناس الانگاتا^[iii] را در اشریشیا کلی BL21 کلون و بیان کردند و نتیجه گرفتند پایداری آن در سرم خونی سه برابر بیشتر از آسپاراژیناز اشریشیا کلی است (17)؛ این پایداری زیاد در سرم خون نشان می‌دهد ال-آسپاراژیناز هالوموناس الانگاتا می‌تواند نامزد مناسبی برای پروتئین دارویی باشد و با تزریق دوز کمتر دارو، ایمنی‌زایی کمتری در بیماران داشته باشد. اگرچه فعالیت ویژۀ زیادی برای این آنزیم گزارش شده است، نتایج نشان می‌دهند بخش درخور توجهی از این آنزیم هنگام تولید در اشریشیا کلی به‌شکل نامحلول و اینکلوژن بادی^[iv] باقی می‌ماند. به‌طور‌کلی، ایجاد شکل‌های نامحلول پروتئین ازجمله عوامل کاهش‌دهندۀ بهره‌وری بیان پروتئین در اشریشیا کلی است (18)؛ معمولاً این مشکل به‌علت سرعت زیاد تولید پروتئین به‌واسطۀ پروموتورهای قوی ازجمله پروموتورهای ویروسی و اشباع‌شدن سیستم چپرونی میزبان اتفاق می‌افتد؛ با افزایش غلظت موضعی پروتئین‌ها در میزبان، برهم‌کنش‌های هیدروفوب سبب مجتع‌شدن^[v] پروتئین‌ها و تجمع آنها به‌شکل اینکلوژن بادی می‌شود. راهکارهای بسیاری ازجمله بهینه‌کردن کدونی، اتصال پروتئین هدف به پروتئینی با حلالیت بیشتر، تغییر شرایط فیزیکوشیمیایی محیط مانند استفاده از انواع محیط‌کشت، تغییر غلظت القاکننده، شرایط القا و ... برای حل مشکل یادشده پیشنهاد شده‌اند (18)؛ باوجوداین، راهبرد مشخص و مناسبی برای همۀ پروتئین‌های نوترکیب وجود ندارد و ازاین‌رو، مطالعۀ مجزایی باید برای بهینه‌کردن بیان هر پروتئین انجام شود (19). عوامل بسیاری بر میزان بیان پروتئین محلول اثر می‌گذارند و معمولاً از روش‌های آماری طراحی آزمایش در بهینه‌کردن استفاده می‌شود تا مقدار بهینه سریع‌تر و آسان‌‌تر محاسبه شود (20)؛ در این بین، روش یک فاکتور در زمان^[vi] که در آن، اثر تنها یک متغیر با ثابت نگه‌داشتن سایر متغیرها در هر آزمایش بررسی می‌شود و از تأثیر متقابل عوامل مختلف بر یکدیگر صرف‌نظر می‌کند، همچنان روشی ساده‌ایست که برای دریافت اطلاعات کلی از عوامل مؤثر بر میزان بیان پروتئین محلول استفاده می‌شود و می‌تواند پایه‌ای برای مطالعه‌های آماری دقیق‌تر همچون روش سطح پاسخ^[vii] باشد (21).

هدف پژوهش حاضر، افزایش تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز نوترکیب جداشده از هالوموناس الانگاتا به‌طور محلول در میزبان اشریشیا کلی است؛به این منظور، بیان پروتئین در میزبان اشریشیا کلی ArcticExpress علاوه‌بر اشریشیا کلی BL21 بررسی شد؛ همچنین ترکیب محیط‌کشت، دمای بیان، غلظت القاکننده، مدت زمان القا، سرعت برهم‌زدن و اثر برخی افزودنی‌ها ازجمله اتانول و آرژینین در محیط‌کشت به روش یک فاکتور در زمان بهینه شد.

مواد و روش‌ها

سویه‌های باکتری، محیط‌های کشت و مواد شیمیایی: در پژوهش حاضر، ژن کد‌کنندۀ ال-آسپاراژیناز سویۀ هالوموناس الانگاتا (کد Genbank: FN869568.1) که بین دو سایت برش NdeI و HindIII در ناقل بیانی pET21a کلون شده بود، به کار گرفته شد. دو سویۀ مختلف اشریشیا کلی BL21 (DE3) و ArcticExpress (DE3) برای بیان استفاده شدند. مواد شیمیایی از شرکت مرک خریداری شدند.

گزینش سویۀ مناسب برای تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز:ناقل pET21a که پیش‌تر ژن در آن کلون شده بود، به روش شوک حرارتی به سلول‌های مستعد BL21 (DE3) و ArcticExpress (DE3) منتقل^[viii] شد. کلون‌های حاصل از انتقال روی پلیت‌های حاوی محیط LB (Luria-Bertani) جامد همراه با 100 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر آمپی‌سیلین ظاهر شدند و پس‌از تأیید با توالی‌یابی و به‌منظور مطالعه‌های بعدی، از آنها استوک تهیه شد. کلون‌های منتخب از هر دو سویه در محیط‌کشت LB (اسیدیتۀ 4/7) دارای آمپی‌سیلین (100 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر) همراه با 1 درصد حجمی مایۀ تلقیح (کشت شبانه از هر کلون) و در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد کشت شدند. پس‌از رسیدن کدورت سلولی (جذب در 600 نانومتر) به 4/0 تا 6/0، بیان ال-آسپاراژیناز در اشریشیا کلی BL21 با 5/0 میلی‌مولار IPTG برای مدت 3 ساعت در 37 درجۀ سانتی‌گراد و سرعت برهم‌زدن 150 دوربردقیقه القا شد. القای بیان در اشریشیا کلی ArcticExpress با 1 میلی‌مولار IPTG برای مدت 24 ساعت در 12 درجۀ سانتی‌گراد و سرعت برهم‌زدن 230 دوربردقیقه انجام شد. سنجش فعالیت آنزیمی و تعیین فعالیت ویژه در سوپ رویی حاصل از لیز سلولی به‌منظور مقایسۀ کمّی میزان پروتئین تولید‌شده به‌شکل محلول استفاده شد.

استخراج پروتئین: پس‌از القای بیان، سلول‌ها با سانتریفیوژ در سرعت 9000 دوردردقیقه به‌مدت 10 دقیقه و در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد رسوب داده شدند و در 1 میلی‌لیتر بافر لیز (50 میلی‌مولار سدیم‌فسفات، 150 میلی‌مولار سدیم‌کلرید، اسیدیتۀ 6/7) مخلوط شدند؛ سپس سلول‌ها به‌مدت 5 دقیقه (10 ثانیه پالس و 5 ثانیه استراحت) روی یخ با دستگاه SYCLON Ultra SonicCell sonicator (SKL950-IIDN) لیز شدند. لاشۀ سلولی با سانتریفیوژ در سرعت 9000 دوردردقیقه به‌مدت 30 دقیقه و در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد از محلول پروتئینی جدا شد. محلول رویی برای ادامۀ بررسی‌ها جمع‌آوری و نگهداری شد.

.سنجش فعالیت آنزیمی و به‌دست‌آوردن فعالیت ویژه: به‌منظور سنجش فعالیت آنزیمی، 50 میکرولیتر از محلول پروتئینی به 1 میلی‌لیتر بافر سنجش (50 میلی‌مولار سدیم‌فسفات و 12 میلی‌مولار ال- آسپاراژین) افزوده و به‌مدت 2 دقیقه در دمای 25 درجۀ سانتی‌گراد انکوبه شد؛ سپس، تغییرات جذب با استفاده از شناساگر نسلر (22) در طول موج 490 نانومتر با دستگاه Perkin Elmer Lambda 25 اندازه‌گیری شد. سنجش غلظت محلول پروتئینی به روش برادفورد^[ix] انجام شد (23). منحنی‌های استاندارد با محلول‌های آمونیوم و سرم آلبومین گاوی رسم شدند تا غلظت آمونیوم تولیدشده و پروتئین موجود در محلول اندازه‌گیری شود. واحد فعالیت آسپاراژیناز عبارتست از: تبدیل 1 میکرومول آمونیاک در یک دقیقه در دمای محیط. تمام سنجش‌ها در سه تکرار انجام شدند.

.بهینه‌کردن شرایط کشت و بیان ال-آسپاراژیناز: به‌منظور بهینه‌کردن تولید پروتئین به‌شکل محلول، هر بار یکی از عوامل موجود ازجمله نوع محیط‌کشت شامل محیط LB (10 گرم‌بر‌لیتر تریپتون، 5 گرم‌بر‌لیتر عصارۀ مخمر، 10 گرم‌بر‌لیتر سدیم‌کلرید، اسیدیتۀ 2/7)، محیط TB (Terrific Broth) (12 گرم‌بر‌لیتر تریپتون، 24 گرم‌بر‌لیتر عصارۀ مخمر، 5 گرم‌بر‌لیتر گلیسرول و بافر فسفات) و محیط 2xYT (2x Yeast Extract Tryptone) (16 گرم‌بر‌لیتر تریپتون، 10 گرم‌بر‌لیتر عصارۀ مخمر، 5 گرم‌بر‌لیتر سدیم‌کلرید، اسیدیتۀ 2/7)، میزان مایۀ تلقیح (5/0، 0/1 و 0/2 درصد حجمی)، کدورت لحظۀ القای بیان (4/0، 5/0 و 6/0)، غلظت‌ IPTG (2/0، 5/0 و 8/0 میلی‌مولار)، دمای بیان (25، 30 و 37 درجۀ سانتی‌گراد)، سرعت برهم‌زدن (100، 150 و 200 دوربردقیقه)، مدت زمان القا (3، 6 و 9 ساعت) و درنهایت، اثر حضور افزودنی‌ها در محیط بیان شامل اتانول (صفر، 1 و 2 درصد) و آرژینین (صفر، 100 و 200 میلی‌مولار) با ثابت نگه‌داشتن سایر شرایط تغییر داده شد و مقدار فعالیت ویژه در هر حالت تعیین شد؛ از‌این‌رو، بیان ال-آسپاراژیناز محلول در میزبان اشریشیا کلی به روش یک فاکتور در زمان با درنظرگرفتن شرایط یادشده بهینه شد.

محاسبه‌های آماری: تمام آزمایش‌ها در سه تکرار انجام شدند. تجزیه‌وتحلیل آماری با آزمون آنالیز واریانس (ANOVA) و نرم‌افزار MINITAB انجام شد. P valueکمتر از 05/0، سطح معناداری در نظر گرفته شد.

نتایج.

در پژوهش حاضر به مطالعۀ افزایش تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز به‌شکل محلول در میزبان  اشریشیا کلی پرداخته شد؛ به این منظور، دو میزبان بیانی و شرایط مختلف کشت و القا بررسی شدند. ابتدا پلازمید حاوی ژن به دو سویۀ بیانی اشریشیا کلی BL21 (DE3) و ArcticExpress (DE3) منتقل شد و کلنی‌های رشدکرده روی محیط حاوی آمپی‌سیلین تعیین توالی شدند. یک کلنی از هر میزبان برای مقایسۀ بیان انتخاب شد. نتایج مقایسۀ بیان نشان دادند فعالیت ویژۀ آنزیم محلول در سویۀ اشریشیا کلی BL21 (DE3) برابر 55±1089 واحدبرمیلی‌گرم و در سویۀ اشریشیا کلی ArcticExpress (DE3) برابر 94±850 واحدبرمیلی‌گرم است؛ بنابراین، در ادامۀ بررسی‌ها از اشریشیا کلی BL21 (DE3) برای بیان استفاده شد. مقدار بیان آنزیم در سه محیط‌کشت LB، TB و 2xYT بررسی شد و باوجود اینکه تفاوت زیادی در مقدار بیان در سه محیط یادشده مشاهده نشد (شکل 1)، بیشترین فعالیت ویژه در محیط‌کشت LB (38±1057 واحدبرمیلی‌گرم) و کمترین بیان در محیط 2xYT (35±825 واحدبرمیلی‌گرم) حاصل شد؛ ازاین‌رو، محیط‌کشت LB به‌علت فعالیت ویژۀ بیشتر، قیمت ارزان‌تر و دسترسی بهتر برای ادامۀ کار استفاده شد.

اثر مقدار هوادهی با تغییر سرعت برهم‌زدن (100، 150 و 200 دوربردقیقه)، عامل دیگری بود که اثر آن بر بیان ال-آسپاراژیناز بررسی شد و سرعت برهم‌زدن 150 دوربردقیقه بیشترین تولید آنزیم (35±1295) را به همراه داشت (بیش از دو برابر نسبت به دو حالت دیگر). اثر غلظت‌های متفاوت IPTG (2/0، 5/0 و 8/0 میلی‌مولار) به‌عنوان القاکننده مطالعه و مشاهده شد افزودن 5/0 میلی‌مولار IPTG سبب تولید آنزیم محلول و فعال بیشتری (317±1473) می‌شود (شکل 2).

اثر کدورت لحظۀ القای بیان (4/0، 5/0 و 6/0)، عامل دیگری بود که بررسی شد. بر اساس شکل 3 و باتوجه‌به اینکه مقدار فعالیت ویژه در کدورت 5/0 تقریباً سه برابر دو حالت دیگر (148±1664) بود، این مقدار کدورت برای ادامۀ آزمایش‌ها مدنظر قرار گرفت. تغییر درصد مایۀ تلقیح اثر معناداری در مقدار ال-آسپاراژیناز محلول نداشت؛ باوجوداین، 1 درصد مایۀ تلقیح (با تفاوت اندک) بیشترین فعالیت ویژۀ آنزیم (168±1678) را موجب و برای آزمایش‌های بعدی استفاده شد.

شکل 1- اثر سه محیط‌کشت LB (Luria-Bertani)، TB (Terrific Broth) و 2xYT (2x Yeast Extract Tryptone) بر فعالیت ویژۀ آنزیم؛ آزمایش‌ها در سه تکرار انجام شدند و P valueبرابر0001/0 محاسبه شد.

شکل 2- اثر غلظت القاکننده بر فعالیت ویژۀ آنزیم؛ آزمایش‌ها در سه تکرار انجام شدند و P valueبرابر004/0 محاسبه شد.

شکل 3- اثر کدورت لحظۀ القای بیان بر فعالیت ویژۀ آنزیم؛ آزمایش‌ها در سه تکرار انجام شدند و P valueبرابر0001/0 محاسبه شد.

میزان بیان ال-آسپاراژیناز در سه دمای 25، 30 و 37 درجۀ سانتی‌گراد بررسی و بیشترین مقدار آسپاراژیناز محلول در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد حاصل شد (شکل 4)، اما تحلیل آماری داده‌ها نشان داد این تفاوت معنادار نیست؛ باوجوداین، دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد که برای رشد و افزایش جمعیت سلولی میزبان استفاده شد، به‌منظور سهولت کار برای بیان نیز مدنظر قرار گرفت.

میزان تولید آنزیم در زمان‌های مختلف پس‌از القا (3، 6 و 9 ساعت) بررسی شد و بر اساس شکل 5، بیشترین تولید ال-آسپاراژیناز پس‌از 9 ساعت از زمان القا حاصل شد و فعالیت ویژه‌ای معادل 82±1858 واحدبرمیلی‌گرم را به همراه داشت. حضور افزودنی‌هایی مانند اتانول (صفر، 1 و 2 درصد) و آرژینین (صفر، 100 و 200 میلی‌مولار) به‌طور مجزا در محیط بیان بررسی شد. شکل‌ 6، الف و ب نشان می‌دهد افزودن 2 درصد اتانول و 200 میلی‌مولار آرژینین به محیط بیان به‌ترتیب سبب افزایش فعالیت ویژۀ آنزیم تا 35±2725 و 71±3450 واحدبرمیلی‌گرم می‌شود.

شکل 4- اثر دما بر فعالیت ویژۀ آنزیم؛ آزمایش‌ها در سه تکرار انجام شدند و P valueبرابر439/0 محاسبه شد.

شکل 5- اثر مدت زمان القا بر فعالیت ویژۀ آنزیم؛ آزمایش‌ها در سه تکرار انجام شدند و P valueبرابر0001/0 محاسبه شد.

شکل 6- اثر افزودنی‌های اتانول و آرژینین به محیط بیان بر فعالیت ویژۀ آنزیم؛ آزمایش‌ها در سه تکرار انجام شدند و P valueبرابر 0001/0 محاسبه شد.

بحث و نتیجه‌گیری

اگرچه آنزیم ال-آسپاراژیناز تأثیر درخور توجهی در درمان سرطان‌های لنفوئیدی دارد، باتوجه‌به داشتن منشأ باکتریایی می‌تواند پاسخ‌های ایمنی شدیدی را در بسیاری از بیماران سبب ‌شود؛ یکی از راه‌های مقابله با این عارضه، کاهش دوز آنزیم و افزایش پایداری آن است. اگرچه جداسازی ال-آسپاراژیناز از باکتری نمک‌دوست هالوموناس الانگاتا توانسته است پایداری این آنزیم در سرم فیزیولوژیک را تا 3 برابر افزایش دهد، تشکیل اینکلوژن بادی‌ معضل بزرگی در مسیر تولید و تخلیص این آنزیم در مقیاس وسیع است. در پژوهش حاضر، ابتدا تغییر میزبان راه حل اولیه در نظر گرفته و بررسی شد. باتوجه‌به اهمیت کاهش دما در کاهش سرعت تولید پروتئین و بهبود تاخوردگی پروتئین‌ها (24)، کیفیت بیان پروتئین در میزبان اشریشیا کلی ArcticExpress بررسی شد. سویۀ یادشده دو چپرون Cpn60 و Cpn10 را بیان می‌کند که هر دو توانایی زیادی در بهبود تاخوردگی پروتئین‌ها در دمای 4 تا 12 درجۀ سانتی‌گراد دارند؛ باوجوداین، سویۀ بیانی اولیۀ BL21 پروتئین فعال بیشتری تولید می‌کند. به نظر می‌رسد بیان در ArcticExpress سبب بهبود تاخوردگی پروتئین‌ها می‌شود، اما به‌علت فعالیت در دمای کم، میزان کل بیان پروتئین در آن کمتر از حدی است که با BL21 رقابت کند؛ به عبارت بهتر، اگرچه بخش زیادی از آنزیم در سویۀ BL21 مجتمع می‌شود، میزان بیان آن به حدی زیاد است که همان درصد کم پروتئین‌های فعال بیشتر از کل پروتئین‌هایی است که ArcticExpress تولید می‌کند؛ در مطالعه‌های دیگر نیز به بیان کم این سویه اشاره شده است (25). باتوجه‌به مطالب یادشده، مطالعه با سویۀ BL21 دنبال شد.

معمولاً نخستین عاملی که برای بهینه‌کردن بیان پروتئین آزمایش می‌شود، محیط‌کشت است؛ زیرا علاوه‌بر اینکه تغییر آن ارزان‌قیمت و آسان است، آثار درخور توجهی در بهبود بیان پروتئین دارد (26). در مطالعۀ حاضر، ابتدا از محیط‌های معمول کشت باکتری شامل LB، TB و 2xYT استفاده شد. محیط LB معمول‌ترین محیط‌کشت برای باکتری است؛ اما به‌علت مقدار کمتر کربوهیدرات‌ها در این محیط، محیط‌های کشت جایگزین مانند TB و 2xYT تودۀ سلولی بیشتری تولید می‌کنند و به تولید آنزیم بیشتر منجر می‌شوند (27)؛ باوجوداین، تفاوتی در فعالیت آنزیم تولید‌شده در این محیط‌ها مشاهده نشد و همچنان فعالیت پروتئین در محیط LB بیش از دو محیط دیگر بود؛ دلیل پدیدۀ یادشده می‌تواند غلظت نمک بیشتر در این محیط باشد که موجب می‌شود پروتئینی با منشأ نمک‌دوست بتواند فعالیت بیشتری در آن داشته باشد. مطالعه‌های دیگر نشان داده‌اند افزایش میزان نمک در محیط‌کشت می‌تواند مقدار بیان پروتئین‌های درون‌سلولی با منشأ نمک‌دوست را افزایش دهد (28). باتوجه‌به فعالیت بیشتر آنزیم و دسترسی راحت‌تر، محیط‌کشت LB در ادامۀ فرایند استفاده شد.

علاوه‌بر ترکیب محیط‌کشت، شرایط دیگر کشت به‌ویژه وجود اکسیژن در محیط نیز اهمیت بسزایی دارد؛ زیرا محدودیت اکسیژن سبب بیان بیش از 200 ژن مؤثر در افزایش قابلیت متابولیکی باکتری در کمبود اکسیژن می‌شود که بیان آنها بخش درخور توجهی از انرژی سلول را مصرف می‌کند و رشد سلولی را کاهش می‌دهد (29). آسان‌ترین راه برای افزایش اکسیژن موجود در محیط، افزایش سرعت به‌هم‌خوردگی محیط است؛ اما مقادیر زیاد آن می‌تواند باعث ایجاد کف شود و درنهایت، میزان اکسیژن دریافتی را کاهش دهد. در مطالعۀ حاضر، بهترین سرعت برهم‌زدن برابر 150 دوربردقیقه تعیین شد و مبنای کار قرار گرفت.

غلظت IPTG (القاکنندۀ بیان) تأثیر چشمگیری در تولید اینکلوژن بادی دارد. افزایش مقدار IPTG سبب ایجاد سمیت برای سلول می‌شود (30) یا با تولید بیش از حد پروتئین، مجتمع‌شدن آنها در اثر اشباع سیستم فولدینگ‌ پروتئین‌ها را در پی دارد (31)؛ از سوی دیگر، کاهش غلظت IPTG سبب القای ناکافی و کاهش تولید پروتئین می‌شود (32). در مطالعۀ حاضر، غلظت 5/0 میلی‌مولار IPTG بیشترین مقدار تولید آنزیم فعال را در پی داشت.

زمان القای بیان، اهمیت ویژه‌ای دارد. شرایط رشد سلولی به‌محض القای بیان تغییر می‌کند و سلول‌ها رشد بسیار کمتری نسبت به قبل خواهند داشت که سبب کاهش زیست‌توده، کاهش بیان پروتئین و کم‌شدن پایداری پلازمید می‌شود (33). در مطالعۀ حاضر، اِعمال تغییرات در لحظۀ القای بیان تأثیر چشمگیری بر فعالیت ویژۀ آسپاراژیناز داشت و کدورت 5/0 که تقریباً در اواسط فاز نمایی منحنی رشد اشریشیا کلی است (34)، بهترین لحظه برای القای بیان در نظر گرفته شد.

مقدار و عمر مایۀ تلقیح ازجمله عواملی هستند که در بیان و فعالیت آنزیم آسپاراژیناز تأثیر دارند (12، 15 و 35). افزایش میزان مایۀ تلقیح سبب تخریب ساختار آنزیم به‌علت برهم‌کنش آن با سایر اجزای محیط می‌شود (36). باوجود گزارش‌های موجود مبنی بر بیان آسپاراژیناز با تلقیح 2 (14) یا حتی 10 درصد (35)، تغییر میزان تلقیح در مطالعۀ حاضر تأثیر معناداری بر مقدار تولید آنزیم فعال نداشت؛ هرچند به‌علت مشاهدۀ بیشترین فعالیت ویژه با 1 درصد تلقیح، این مقدار برای ادامۀ کار انتخاب شد.

همان‌طور که گفته شد، دما نقش مؤثری در بهبود تاخوردگی پروتئین‌ها و افزایش فعالیت آنها دارد. احتمال برهم‌کنش‌های هیدروفوبی در دماهای بیشتر افزایش می‌یابد و فرایند مجتمع‌شدن پروتئین‌ها راحت‌تر اتفاق می‌افتد (37)؛ بنابراین، کاهش دمای بیان یکی از راه‌های متداول برای افزایش دستیابی به پروتئین فعال است؛ هرچند در مطالعۀ حاضر، کاهش دما تأثیری در افزایش فعالیت ویژۀ آسپاراژیناز نداشت. مطالعه‌های مشابهی روی سایر آسپاراژینازهای نوترکیب انجام شده‌اند که در آنها، بیشترین فعالیت آنزیمی با القای بیان در دماهای کمتر از 30 درجۀ سانتی‌گراد حاصل شده است (11 و 38). باتوجه به نتایج این بخش و به‌منظور سهولت کار، دمای بیان مشابه با دمای مناسب کشت و برابر 37 درجۀ سانتی‌گراد در نظر گرفته شد. علاوه‌بر محیط‌های معمول کشت باکتری، حضور برخی افزودنی‌ها در محیط‌کشت می‌تواند مقدار تولید پروتئین محلول را بهبود بخشد؛ به این منظور، ابتدا از آرژینین استفاده شد که یکی از معمول‌ترین و تأثیرگذارترین افزودنی‌های محیط بیان است (39 و 40) و توانست فعالیت ویژه را تا تقریباً دو برابر افزایش دهد. آرژینین از مجتمع‌شدن پروتئین‌های دخیل در فرایند تاخوردگی جلوگیری می‌کند (41) و به‌علت برهم‌کنش‌ با آمینواسیدهای دارای گروه‌های جانبی آروماتیک مانند تریپتوفان سبب پایدارشدن ساختار پروتئین می‌شود (39).

اتانول از دیگر افزودنی‌های محیط‌کشت است که در مطالعه‌های پیشین استفاده و گزارش شده است می‌تواند رفتاری همانند پاسخ سلول در برابر شوک حرارتی^[x] را القا کند و افزایش پایداری پروتئین‌ها را در پی داشته باشد (42). اتانول عملکرد بهتری نسبت به اسمولیت‌هایی همچون سوربیتول و سوکروز نشان می‌دهد (43). در مطالعۀ حاضر، افزودن اتانول 2 درصد توانست مقدار فعالیت ویژه را به‌طور معناداری افزایش دهد.

بهینه‌کردن تولید و شرایط کشت و بیان به‌منظور افزایش بهره‌وری تولید از مراحل مهم در تولید پروتئین‌های نوترکیب است. در مطالعۀ حاضر، تغییر شرایط محیطی و فیزیکوشیمیایی سبب بیش از سه برابر افزایش در تولید پروتئین محلول شد (فعالیت ویژۀ حالت پایه در E. coli سویۀ Bl21 از حدود 1000 واحدبرمیلی‌گرم به مقدار تقریبی 3500 واحد‌بر‌میلی‌گرم افزایش یافت). بیشترین تأثیر به عواملی مانند کدورت لحظۀ القای بیان، مدت زمان القا و افزودن اتانول و آرژینین به محیط کشت مربوط بود.

نتایج مطالعۀ حاضر نشان دادند بهینه‌کردن فیزیکوشیمیایی محیط‌کشت و بیان نقش مهمی در افزایش شکل محلول ال-آسپاراژیناز نوترکیب مشتق‌شده از هالوموناس الانگاتا و جلوگیری از ایجاد اینکلوژن بادی دارد؛ ازاین‌رو، پیشنهاد می‌شود در مطالعه‌های آینده به بررسی بیشتر اثر عوامل مؤثر شناخته‌شده در پژوهش حاضر با استفاده از روش‌های آماری و طراحی آزمایش ازجمله تاگوچی^[xi] و روش سطح پاسخ پرداخته شود.