مقدمه

باسیلوس‌ها، باکتری‌های گرم مثبت، هوازی اجباری یا بی‌هوازی اختیاری، کاتالاز مثبت و میله‌ای‌شکلند که در شرایط خاصی اسپور تولید می‌کنند. این موجودات معمولاً به‌شکل ساپروفیت در آب و خاک دیده می‌شوند و امروزه به‌علت داشتن توان تولید پروتئین‌ها، ویتامین‌ها و آنزیم‌های مختلف اهمیت دارند؛ به‌طوری‌که ارزش تولید این محصولات به‌واسطۀ باکتری‌ها به میلیاردها دلار می‌رسد. باکتری‌های یادشده منبع تولید آنتی‌بیوتیک‌ها، طعم‌دهنده‌ها (مانند نوکلئوزیدهای پورینی) و سورفکتانت‌ها نیز به شمار می‌آیند (1-3).

فولیک‌اسید که با عنوان ویتامین B9 شناخته می‌شود، از مهم‌ترین ویتامین‌های ضروری بدن است که نقشی اساسی در انتقال گروه‌های یک‌کربنه و بسیاری از مسیرهای بیوشیمیایی ایفا می‌کند. مطالعه‌های مختلف نقش فولات را در فرایند سوخت‌وساز، تولید نوکلئیک‌اسیدها، خون‌سازی و تکوین اعصاب محیطی اثبات کرده‌اند (4-6). کمبود فولات در کشورهای درحال توسعه و مناطق مشخصی از کشورهای توسعه‌یافته مسئلۀ مهمی است که ممکن است پیامدهای درخور توجهی برای سلامتی به همراه داشته باشد. فولات در کارایی همانندسازی، ترمیم و متیلاسیون DNA مؤثر است و به‌همین‌علت، مقادیر بسیار کم فولات با افزایش خطر بروز حمله‌های قلبی و سکته‌های مغزی پیوند خورده است و موجب اختلال رشد، کم‌خونی ماکروسیتیک، اسهال، نوروپاتی محیطی و نقص‌های لولۀ عصبی در جنین می‌شود (7 و 8)؛ همچنین ممکن است سبب ایجاد بسیاری از بیماری‌ها و اختلال‌ها ازجمله نقص‌های لولۀ عصبی و کم‌خونی مگالوبلاستیک شود. در پژوهش‌های اخیر، ارتباط بین وضعیت فقر فولات و اختلال‌های پیش‌روندۀ عصبی ازجمله بیماری آلزایمر، سکتۀ مغزی و چندین نوع سرطان (سرطان خون، رودۀ بزرگ، پستان، لوزالمعده، دهانۀ رحم و نایژه) و خطر زیاد ابتلا به بیماری‌های قلبی و عروقی گزارش شده است؛ همچنین پژوهش‌های اپیدمیولوژیک اثبات کرده‌‌اند افزایش مصرف مکمل‌های حاوی فولات احتمال بروز سکتۀ قلبی، سرطان، کم‌خونی و آلزایمر را به‌طور درخور توجهی کاهش می‌دهد (9 و 10).

ازآنجاکه تنها گیاهان و ریزموجودات می‌توانند فولات تولید کنند، رژیم غذایی تنها منبع این ویتامین برای انسان است. سبزی‌های برگ‌سبز، میوه‌های خاص ازجمله مرکبات و توت‌فرنگی، جگر، تخم‌مرغ، مخمر و همچنین آبجو، ماست و سایر فراورده‌های تخمیری سرشار از فولاتهستند؛ همچنین ریزموجودات اصلاح‌شده ازنظر ژنتیکی می‌توانند برای زیست‌غنی‌سازی فراورده‌های تخمیری استفاده شوند (11).

در مطالعه‌های مختلف، ریزموجودات بسیاری ازجمله باسیلوس سوبتیلیس^[1] (12)، لاکتوباسیل کازئی^[2] (13)، دروزوفیلا ملانوگاستر^[3] (14)، کلورلا ولگاریس^[4] (15)، لاکتوکوکوس^[5] (16) و لاکتوباسیلوس^[6] (17) معرفی شده‌اند که توانایی تولید فولیک‌اسید را دارند. در باسیلوس‌ها و در اوپرون اصلی فولیک، سه ژن FOLK، FOLAو sulبه‌ترتیب آنزیم‌‌های پیروفسفوکیناز، دی‌هیدرونئوپترین‌آلدولاز و دی‌هیدروپتروئات‌سنتاز را کد می‌کنند که مهم‌ترین آنزیم‌ها در مسیر تولید پیش‌سازهای مسیر سنتر فولات هستند. در باسیلوس‌ها، ژن FOLA آنزیم 21 آمینواسیدی دی‌هیدرونئوپترین‌آلدولاز را کد می‌کند و وجودنداشتن آن در ژنوم باکتری موجب ناتوانی ریزموجود در تولید فولات می‌شود (18).

امروزه، غنی‌سازی مواد غذایی از طریق افزودن مواد ریزمغذی مانند روی، ویتامین D، کلسیم و سایر ویتامین‌ها به غذاها و شیر ازجمله روش‌های تأییدشدۀ سازمان بهداشت جهانی برای جبران کمبود این مواد در افراد است(19 و 20). کشک یکی از فراورده‌های فرعی شیر است که به روش سنتی از جوشاندن، تغلیظ یا خشک‌کردن دوغی که پس‌از کره‌گیری باقی می‌ماند یا از ماست بدون چربی تهیه می‌شود و تمام خواص شیر کامل را دارد و حاوی کلسیم، چربی، پتاسیم، پروتئین و ویتامین نیاسین است. پیشگیری از بروز یا پیشرفت بیماری پوکی استخوان مهم‌ترین مصرف درمانی کشک است(21-23). ازآنجاکه لبنیات و شیر منبع اصلی ویتامین‌های گروه B به شمار می‌آیند، مطالعۀ حاضر به جداسازی ژن تولید فولیک‌اسید از باسیل‌های خاک، توالی‌یابی آن و درنهایت، همسانه‌سازی این ژن در باکتری اشریشیا کلی^[7]می‌پردازد تا گامی برای افزودن سویه‌های بومی پروبیوتیک تولیدکنندۀ فولات به این مواد غذایی بردارد.

مواد و روش‌ها

جداسازی باکتری‌ها: در پژوهش حاضر، تعداد 40 نمونه از عمق 10 تا 15 سانتی‌متری خاک مناطق مختلف حاشیۀ شهر سیرجان (کرمان) و باغ‌های اطراف جمع‌آوری و در شرایط استریل به آزمایشگاه منتقل شدند. به‌منظور جداسازی باکتری‌های دارای فعالیت پروتئولیتیک، رقت سریالی ^1-10 تا ^6-10 از نمونه‌های خاک تهیه شد. در زمینۀ کشت نمونه‌های خاک، به‌منظور کاهش تعداد شکل‌های رویشی و با هدف جداسازی سویه‌های باسیلوس از خاک هواخشک استفاده شد.

مقدار 2/0 میلی‌لیتر از تمام رقت‌های تهیه‌شده برای هر نمونۀ خاک در سطح محیط تریپتیک‌سوی‌آگار ریخته شد و با پخش‌کنندۀ شیشه‌ای به‌طور یکنواخت در تمام سطح محیط پخش شد؛ سپس نمونه‌ها به‌مدت 72 ساعت در شرایط هوازی و دمای 30 درجۀ سانتی‌گراد گرمخانه‌گذاری و درنهایت، ازنظر رشدکردن یا رشدنکردن و کلنی‌های مشکوک به باسیلوس بررسی شدند.

از محتویات لوله‌ها به‌طور جداگانه در محیط‌کشت اختصاصی skim milk (Merck, Germany) حاوی 50گرم شیرخشک بدون چربی، 5 گرم کازئین، 5/2 گرم عصارۀ مخمر، 1 گرم گلوکز و 5/12 گرم آگار در هر لیتر کشت داده شد و به‌مدت 48 ساعت در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد گرمخانه‌گذاری شد؛ سپس شناسایی دقیق‌تر باکتری‌های باسیلوس دارای فعالیت پروتئولیتیک به روش‌های بیوشیمیایی ازجمله آزمون‌های اوره، کاتالاز، حرکت، MR-VP و رنگ‌آمیزی گرم ادامه یافت و درنهایت پس‌از تأیید باکتری باسیلوس بر اساس ویژگی‌های ظاهری کلنی، ویژگی‌های میکروسکوپی و آزمون‌های بیوشیمیایی، شناسایی مولکولی بر اساس بررسی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) توالی 16S rDNA برای تأیید نهایی گونۀ باسیلوس انجام شد.

شناسایی مولکولی: روش‌های مولکولی برای تمایز باسیلوس‌های دارای ژن رمزکنندۀ فولات (FOLA) استفاده شدند. استخراج DNA با استفاده از کیت اختصاصی (Cinna Gen, Iran) و با‌توجه‌به دستورعمل سازنده انجام شد. پس‌از تأیید کیفیت به روش الکتروفورز و با دستگاه نانودراپ (Eppendorf, Germany)، آغازگرهای اختصاصی ژن FOLA با نرم‌افزار Gene runner طراحی و در سایت NCBI بلاست شدند تا اختصاصیت آنها تأیید شود. جدول 1، آغازگرهای استفاده‌شده در مطالعۀ حاضر را نشان می‌دهد. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) برای هر واکنش شامل 10 میکرولیتر PCR Master Mix 2x  (Cinna Gen, Iran)، 1 میکرولیتر از هرکدام از آغازگرها با غلظت 10 پیکومول‌بر‌میکرولیتر، 4 میکرولیتر از DNA الگو (150 نانوگرم) و 4 میکرولیتر آب مقطر در حجم نهایی 20 میکرولیتر بود. مراحل دمایی واکنش PCR به شرح زیر انجام شد: ابتدا مرحلۀ دناتوراسیون اولیه در دمای 95 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 5 دقیقه، 35 چرخه شامل دناتوراسیون در 95 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 30 ثانیه، مرحلۀ اتصال آغازگر در دمای 56 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 30 ثانیه و مرحلۀ تکثیر در دمای 72 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 1 دقیقه و پس‌از 35 چرخه، مرحلۀ تکثیر نهایی در دمای 72 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 10 دقیقه. محصولات PCR در حضور شاهد مثبت و منفی در ژل آگارز 5/1 درصد الکتروفورز و پس‌از رنگ‌آمیزی با اریتروژل به کمک دستگاه ژل‌داک، عکس‌برداری شدند.

همسانه‌سازی ژن فولات: روش Cloning TA، روش نسبتاً جدیدی است که بسیار ساده‌تر و مطمئن‌تر از روش‌های قدیمی همسانه‌سازی ژن در باکتری یا پلاسمید عمل می‌کند و نیازی به استفاده از آنزیم‌های محدوداثر وجود ندارد. در مطالعۀ حاضر، کیت PCR TA-Cloning (Cinna Gen, Iran) برای همسانه‌سازی سریع‌تر و مؤثرتر محصول PCR استفاده شد. با‌توجه‌به دستورعمل کیت همسانه‌سازی، محصول PCR به‌دست‌آمده با 1 میکرولیتر آنزیم T4 Ligase، 1 میکرولیتر بافر، 2 میکرولیتر وکتور خطی pTG19-T، 5/1 میکرولیتر محصول PCR و 5/4 میکرولیتر آب مقطر استریل مخلوط شد و سپس به‌مدت یک ساعت در 22 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شد تا ژن هدف به وکتور متصل شود. در مرحلۀ بعد، وکتور به میزبانEscherichia coli XL-1 blue (تهیه‌شده از دانشگاه تهران) منتقل و در محیط‌کشت LB مایع بدون آنتی‌بیوتیک به‌مدت 1 ساعت در 37 درجۀ سانتی‌گراد کشت داده شد. باکتری منتقل‌شده در پلیت حاوی LBآگار حاوی 100 میلی‌گرم‌بر‌میلی‌لیتر آمپی‌سیلین، 200 میلی‌گرم‌بر‌میلی‌لیتر IPTG (Isopropylthio-β-D-galactoside) و 20 میلی‌گرم‌بر‌میلی‌لیتر X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-a-D-galactoside). کشت و به‌مدت 12 ساعت در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد گرمخانه‌گذاری شد. همسانه‌سازی ژنی با غربال‌گری کلنی‌های سفید (حاوی ژن نوترکیب) و کلنی‌های آبی با لیگاسیون ناموفق و ژن غیرنوترکیب تأیید و توالی یادشده برای توالی‌یابی به آزمایشگاه پاسارگاد فرستاده شد تا با ارسال به شرکت Bioneer کرۀ جنوبی تعیین توالی شود.

جدول 1- آغازگرهای استفاده‌شده در مطالعۀ حاضر

.تعیین میزان بیان ژن FOLA در باکتری میزبان: به‌منظور بررسی میزان بیان ژن FOLA به روش Real-time PCR، باکتری نوترکیب گرمخانه‌گذاری شد تا روند بیان ژن طی شود؛ پس‌از 15 ساعت گرمخانه‌گذاری، استخراج RNA با استفاده از کیت اختصاصی (Cinna Gen, Iran) و باتوجه‌‌به دستورعمل آن انجام شد و پس‌از تأیید کیفیت RNA استخراج‌شده با دستگاه نانودراپ، سنتز cDNA با استفاده از آنزیم Reverse AMV (غلظتµl/unit  25) و کیت اختصاصی آن (Roche, Germany) انجام شد. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در حجم 20 میکرولیتر با استفاده از کیت شرکت Genet bio CAT. NO: Q1469، کرۀ جنوبی به شرح زیر انجام و 10 میکرولیتر Prime Qmaster mix (2x) with syber green، 5 میکرولیتر Depc water، 1 میکرولیتر آغازگر رفت، 1 میکرولیتر آغازگر برگشت، 1 میکرولیتر Rox dyeو2 میکرولیتر cDNA استفاده شد. تکثیر قطعه‌های مدنظر در دستگاه Corbet (Corbet, Australia) با برنامۀ دناتوراسیون اولیه در 95 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 1 دقیقه، تکثیر در 95 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 30 ثانیه، 59 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 40 ثانیه و 72 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 60 ثانیه در 35 چرخه انجام شد. ژن خانگی بتااکتین برای شاهد درونی آزمون استفاده شد.

رسم درخت فیلوژنتیکی: نتایج توالی‌یابی توالی‌های به‌دست‌آمده با نرم‌افزار Bio Edit بررسی شدند و پس‌از اطمینان‌ از درستی توالی‌هـای بـه‌دسـت‌آمـده، رشتة واحدی (از'5 به '3) از دو رشتۀ توالی‌یابی‌شدة مسـتقیم و معکـوس با نـرم‌فـزارDNA Baser  مرتب شد. تـوالی‌‌هـای حاصـل بـا جدایه‌های ثبت‌شده در NCBI مقایسه شـدند، هـر تـوالی بـه‌طـور جداگانـه با نـرم‌افـزار Blast n در بانـک ژن جسـتجو شـد و توالی‌های حاصل از  Blastبا نرم‌‌افزار Clustal W هم‌ردیـف شدند. تجزیه‌و‌تحلیل فیلوژنتیکی با برنامۀ MEGA7 انجام شد.

نتایج

نتایج جداسازی باکتری: درنتیجۀ غربال‌گری 40 نمونه خاک ارسال‌شده به آزمایشگاه، درمجموع تعداد 12 کلنی مشکوک به باسیل‌های گرم مثبت جداسازی شد که بر اساس ویژگی‌های ریخت‌شناختی، میکروسکوپی و آزمون‌های بیوشیمیایی با عنوان باسیلوس شناسایی شدند. در مطالعۀ حاضر بر اساس روش‌های تشخیصی عنوان‌شده در کتاب Bergey، باسیل‌های گرم مثبت که آزمون‌های MR-VP، سیمون‌سیترات، کاتالاز و TSI آنها مثبت و آزمون‌های احیای نیترات، ایندول، اوره‌آز و اکسیداز منفی آنها منفی بود، برای تمایز مولکولی انتخاب شدند.

.نتیجۀ آزمون PCR به‌منظور شناسایی باکتری‌های دارای ژن هدف: واکنش PCR برای ژن FOLA با آغازگرهای یادشده در جدول 1 انجام شد و نتایج در شکل 1 دیده می‌شوند. تمام 12 سویه باسیلوس جداشده ژن FOLA را داشتند (شکل 1). به‌منظور شناسایی مولکولی جنسباسیلوس حامل ژن FOLA از آغازگرهای عمومی 16S استفاده شد (شکل 2).

شکل 1- نتیجۀ آزمون PCR به‌منظور شناسایی ژن فولات

شکل 2- نتیجۀ آزمون PCR با آغازگرهای عمومی 16S rDNA به‌منظور تعیین هویت مولکولی جنس باسیلوس

نتایج همسانه‌سازی ژن فولات: پس‌از همسانه‌سازی سویۀ حامل ژن فولات در فرایند انتخاب کلنی (آبی/سفید)، سویه‌های همسانه‌سازی‌‌شده جداسازی شدند. طبق اصول کیت، چنانچه ژن هدف وارد وکتور شده باشد، ژن Lac z تخریب می‌شود، باکتری نمی‌تواند از X-gal استفاده کند و کلنی‌های سفید در محیط‌کشت تشکیل می‌شوند؛ بنابراین کلنی‌‌های سفید، باکتری‌های با DNA نوترکیب و کلنی‌های آبی، همسانه‌سازی ناموفق در نظر گرفته می‌شوند.

به‌منظور تأیید نتایج همسانه‌سازی، DNA از کلنی‌های مشکوک استخراج و ورود ژن‌هایفولات به باکتری Escherichia coliXL-1 blueبا آزمون PCRو توالی‌یابی محصول PCR تأیید شد (شکل 3) و درنهایت، محصول PCR برای توالی‌یابی به شرکت Bioneer ارسال و BLAST شد (شکل 4)؛ همچنین بیان ژن یادشده به‌طور موفقیت‌آمیز با Real-time PCR سنجش و مشخص شد فولات در باکتری میزبان بیان شده است (شکل 5).

شکل 3- تأیید همسانه‌سازی به کمک PCR با آغازگرهای M13 وکتور

شکل 4- نتایج توالی‌یابی ژن فولات

شکل 5- نتایج بیان ژن فولات در باکتری هدف؛ بیان ژن 16S rDNA شاهد در نظر گرفته شده است. رنگ‌های فیروزه‌ای و آبی نشان‌دهندۀ بیان ژن شاهد به‌ترتیب در باکتری‌های E. Coliهمسانه‌سازی‌نشده و همسانه‌سازی‌شده‌اند، رنگ سبز نشان‌دهندۀ بیان ژن هدف همسانه‌سازی‌شده در E. Coli و رنگ زرد نشان‌دهندۀ بیان ژن هدف در E. Coli بدون همسانه‌سازی‌شدن است. no template control=NTC

نتایج درخت فیلوژنتیکی: پس‌از توالی‌یابی، بررسی ارتباط فیلوژنتیکی به روش پیوند هم‌جوار (NJ) انجام شد و نتایج آن نشـان دادند گونه‌های باسیلوس سابتیلیس و باسیلوس هالوتولرانس^[8] در یک خوشه قرار می‌گیرند که بیان‌کنندۀ رابطۀ خویشاوندی نزدیک آنها با یکدیگر است (شکل 6). داده‌ها نشان دادند باکتری دارای ژن هدف در مطالعۀ حاضر، باسیلوس هالوتولرانس AH38 است.

شکل 6- درخت فیلوژنی رسم‌شده بر اساس توالی ژن 16S rDNA؛ علامت Sample1 در ابتدای درخت نشان‌دهندۀ نزدیکی باکتری جداسازی‌شده به باسیلوس هالوتولرانس است.