بررسی تاثیر کاربرد کودهای زیستی قارچ میکوریزا و ازتوباکتر بر خصوصیات فیزیولوژیکی گیاه دارویی شنبلیله (Trigonella foenum-graecum L.) در شرایط تنش کم‌آبی

شنبلیله با نام علمی Trigonella foenum-graecum L.، گیاهی نهان‌دانه از دولپه‌ای‌های جداگلبرگ است که جزو راستۀ گل سرخ (Rosales)، تیرۀ نخود Fabaceae))، زیرتیرۀ پروانه‌داران (Papilionaceae) و جنس (Trigonela L.) از گروه Trifolia قرار دارد. نام این گیاه از کلمۀ یونانی به معنای مثلث (به‌علت مثلثی‌بودن برگچه‌ها) و foenum-graecum به معنای Greek hay یا علف یونانی (به‌علت کاربردهای فراوان در یونان باستان) گرفته شده است. شنبلیله علاوه‌بر مصرف به‌شکل سبزی، گیاهی است که مصرف ادویه‌ای، دارویی (ضدفشار خون، دیابت و ...) و آرایشی دارد و به‌عنوان کود سبز استفاده می‌شود (Bairwa and Kaushik, 2010). باتوجه‌به گستردگی کشت شنبلیله در جهان، این گیاه با تنش‌های غیرزندۀ محیطی مختلف ازجمله تنش خشکی در طول فصل رشد مواجه می‌شود .(Dadrasan et al., 2015; Bairwa and Kaushik, 2010).

تنش خشکی ازجمله تنش‌های محیطی است که علاوه‌بر کاهش رشد رویشی و تغییر ساختارهای آناتومیکی گیاه، از طریق ایجاد تنش ثانویه نظیر تنش اکسیداتیو سبب تغییر در مسیرهای سنتز ترکیبات و متابولیت‌های ثانویه می‌شود (Sharma et al., 2012; Rajaeian et al., 2015). مطالعه‌های بسیاری در زمینۀ افزایش تجمع گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) طی تنش خشکی گزارش شده‌اند. گیاهان از طریق سازوکارهای آنتی‌اکسیدانی آنزیمی و غیرآنزیمی گونه‌های فعال اکسیژنی ایجادشده را کاهش می‌دهند (Hasanuzzaman et al., 2013)؛ تجمع گونه‌های فعال اکسیژن در سلول موجب آسیب‌رسیدن به لیپیدهای غشا، پروتئین‌ها و نوکلئیک‌اسید می‌شود. طی فتوسنتز در وضعیت کم‌آبی، نشت زیاد الکترون به‌سمت O₂ اتفاق می‌افتد و انواع مختلف ROS نظیر سوپراکسید، پراکسیدهیدروژن، رادیکال هیدروکسیل و رادیکال اکسیژن تولید می‌کند. گیاهان دارای سازوکارهای آنتی‌اکسیدان آنزیمی و غیرآنزیمی برای مقابله با تنش اکسیداتیو ناشی از گونه‌های فعال اکسیژن هستند. رادیکال سوپراکسید ممکن است به‌وسیلۀ آنزیم سوپراکسیددیسموتاز به H₂O₂ و سپس در کلروپلاست به‌وسیلۀ آسکوربات‌پراکسیداز به آب تبدیل شود؛ همچنین H₂O₂ منتشر‌شده به بخش بیرونی کلروپلاست به‌وسیلۀ آنزیم کاتالاز در سلول‌های برگ پاک‌سازی می‌شود. در وضعیت خشکی، تنفس نوری به‌علت محدود‌شدن جذب و تثبیت CO₂ و افزایش فعالیت اکسیژنازی آنزیم روبیسکو افزایش می‌یابد که این امر افزایش تولید H₂O₂ را در پی دارد (Miller et al., 2010).

آنزیم‌های کاتالاز (CAT) و آسکوربات‌پراکسیداز (APX) نقش مهمی در حذف H₂O₂ ایفا می‌کنند و هرکدام میل ترکیبی متفاوتی با این نوع ROS دارند. کاتالاز برای عمل به نیروی احیایی نیاز ندارد، ولی آسکوربات‌پراکسیداز برای فعالیت به عامل احیایی نیاز دارد. سطح تمایل کاتالاز به H₂O₂ کمتر از آسکوربات‌پراکسیداز است. آسکوربات‌پراکسیداز در بیشتر اندامک‌های سلولی وجود دارد؛ درحالی‌که کاتالاز فقط در پراکسی‌زوم یافت می‌شود. پیشنهاد شده است آسکوربات‌پراکسیداز ممکن است تنظیم‌کننده و کنترل‌کنندۀ درون‌سلولی مناسبی برای حفظ تعادل ROS باشد (Mittler, 2002).

تنظیم اسمزی ازجمله سازوکارهای پاسخ به تنش‌های محیطی است. تنظیم اسمزی نوعی سازگاری به تنش کمبود آب است که می‌تواند از طریق تجمع مواد محلول در سلول‌ها به حفظ تورژسانس سلول‌ها و فرایندهای وابسته به آن در پتانسیل‌های کم آب منجر شود. در زمان تنش‌های غیرزیستی مانند خشکی، مولکول‌های آلی دارای وزن مولکولی کمتر مانند قندهای محلول، پرولین، پروتئین و بتائین در ریشه‌ها و اندام‌های هوایی گیاهان به‌منزلۀ تنظیم‌کننده‌های اسمزی عمل می‌کنند (Lokhande et al., 2010). قندهای محلول به‌عنوان تنظیم‌کنندۀ اسمزی، ثبات‌دهندۀ غشاهای سلولی و حفظ‌کنندۀ تورژسانس سلول‌ها عمل می‌کنند و در گیاهانی که قندهای محلول در پاسخ به تنش خشکی تجمع می‌یابند، تنظیم اسمزی بهتر انجام می‌شود (Slama et al., 2007).

کودهای زیستی نظیر قارچ‌های میکوریزا و ازتوباکتر نقش مهمی در کشاورزی پایدار دارند؛ درحقیقت، قارچ‌های میکوریزا و همزیستی آنها با گیاهان سبب تغییراتی در روابط آبی گیاه و درنتیجه، بهبود مقاومت به خشکی یا تحمل در گیاه میزبان می‌شود (Habibzadeh et al., 2015). قارچ‌های میکوریزا با جذب عناصر غذایی مانند فسفر و همچنین تعدیل اثر تنش‌های محیطی، افزایش مقاومت نسبت به عوامل بیماری‌زا، کاهش آسیب‌های ریشه‌ای و تشدید فعالیت تثبیت زیستی نیتروژن سبب بهبود رشد گیاهان و افزایش عملکرد آنها می‌شوند (Baum et al., 2015). گزارش شده است قارچ میکوریزا از طریق کاهش پراکسیداسیون لیپیدها و نفوذپذیری غشا و افزایش تجمع ترکیبات تنظیم‌کنندۀ اسمزی و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان قادر به کاهش خسارت ناشی از تنش خشکی است (Zhu et al., 2010). باکتری‌های تثبیت‌کنندۀ نیتروژن مانند ازتوباکتر در محیط ریشۀ گیاه توانایی ساخت و ترشح مواد زیستی فعال را دارند که تأثیر مثبت و مفیدی در توسعۀ سیستم ریشه‌ای دارد و عملکرد گیاهان زراعی و ویژگی‌های خاک را با بهبود جذب آب و عناصر غذایی و تثبیت زیستی نیتروژن تحت‌تأثیر قرار می‌دهد (Mirzakhani et al., 2014)؛ به‌این‌ترتیب، آزمایش حاضر با هدف بررسی اثر کودهای زیستی قارچ میکوریزا و ازتوباکتر بر ویژگی‌های فیزیولوژیکی گیاه دارویی شنبلیله در شرایط تنش کم‌آبی انجام شد.

مواد و روش‌ها.

پژوهش حاضر به‌شکل آزمایش فاکتوریل در قالب طرح پایۀ بلوک‌های کامل تصادفی با 12 تیمار و 3 تکرار طی سال زراعی 94-1393 و در مزرعۀ تحقیقاتی دانشکدۀ کشاورزی دانشگاه ارومیه انجام شد. برخی ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی خاک موردمطالعه به روش‌های استاندارد اندازه‌گیری شدند. آبیارى در سه سطح آبیاری پس‌از 50 (شاهد)، 100 (تنش متوسط) و 150 (تنش شدید) میلی‌متر تبخیر از تشتک تبخیر کلاس A به‌عنوان فاکتور اول و کاربرد کودهای زیستی هنگام کاشت در چهار سطح شاهد (بدون کاربرد کود زیستی)، قارچ میکوریزا، ازتوباکتر وترکیب ازتوباکتر+قارچ میکوریزا به‌عنوان فاکتور دوم انجام شد. کود زیستی ازتوباکتر به میزان 2 لیتر در هکتار در سایه با بذر آغشته شد. به‌منظور تلقیح بذرهای شنبلیله با میکوریزا، 1 گرم از خاکی که حاوی حدود 1000 اسپور بود، زیر بذر قرار داده شد. در نیمۀ اردیبهشت، بذرهای شنبلیله در ردیف‌هایی با فاصلۀ 25 سانتی‌متر و با تراکم زیاد (70 بذر در مترمربع) در عمق 3 تا 5 سانتی‌متری کشت شدند و سپس در مرحلۀ 4 تا 6 برگی برای رسیدن به تراکم مناسب (40 بوته در مترمربع) تنک شدند. به‌منظور جلوگیری از نشت آب به کرت‌های مجاور، فاصلۀ کرت‌های اصلی از یکدیگر برابر 5/1 متر و فاصلۀ بین دو بلوک برابر 3 متر در نظر گرفته شد. تمام مراقبت‌های زراعی برای تمام تیمارها به‌شکل یکنواخت انجام شدند. مقدار آب آبیاری بر اساس درصد رطوبت خاک و رساندن آن به ظرفیت زراعی با استفاده از رابطۀ زیر محاسبه و به خاک مزرعه اضافه شد (Benami and Ofen, 1984). در اوایل مرحلۀ زایشی، تعدادی بوته به‌طور تصادفی از هر کرت آزمایشی نمونه‌برداری و برگ‌های بخش بالایی بوته‌ها در فویل آلومینیومی بسته‌بندی و درون نیتروژن مایع فریز شده و تا زمان اندازه‌گیری شاخص‌های فیزیولوژیک در فریزر با دمای منفی 80 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شدند.

ویژگی‌های اندازه‌گیری‌شده.

فعالیت آنزیم: به‌منظور سنجش فعالیت آنزیم، 25/0 گرم برگ تازه در 4 میلی‌لیتر بافر فسفات‌پتاسیم 05/0 مولار (اسیدیتۀ 5/7) حاوی پلی‌وینیل‌پیرولیدین (PVP) 1 درصد و EDTE 2/0 میلی‌مولار ساییده شد. تمام مراحل استخراج در یخ انجام شدند؛ سپس عصاره‌ها به‌مدت 20 دقیقه در 15000 دوردردقیقه و دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد سانتریفیوژ شدند و از محلول شفاف رویی برای سنجش فعالیت آنزیم‌ها استفاده شد.

فعالیت کاتالاز باتوجه‌به تغییرات غلظت H₂O₂ در طول موج 240 نانومتر ارزیابی شد. در این روش، آنزیم کاتالاز موجود در نمونه با تجزیۀ پراکسید‌هیدروژن سبب کاهش جذب این ماده در طول موج 240 نانومتر می‌شود. مخلوط واکنش شامل 5/2 میلی‌لیتر بافر فسفات 50 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 5/7)، 1/0 میلی‌لیتر پراکسیدهیدروژن 1 درصد و 50 میلی‌لیتر عصارۀ آنزیمی بود. فعالیت آنزیمی بر اساس تغییرات جذب در 60 ثانیه به‌ازای هر میلی‌گرم پروتئین خوانده شد (Maehly and Chance, 1959)..

مخلوط واکنش برای اندازه‌گیری فعالیت آسکوربات‌پراکسیداز شامل 2 میلی‌لیتر بافر فسفات‌پتاسیم 50 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 7)، 1/0 میلی‌مولار EDTA، 2/0 میلی‌لیتر آسکوربات 5/0 میلی‌مولار، 2/0 میلی‌لیتر پراکسیدهیدروژن 5/1 میلی‌مولار و 50 میلی‌لیتر عصارۀ آنزیمی بود. اکسیداسیون آسکوربات توسط کاهش میزان جذب در 240 نانومتر تعیین شد (Chen and Asada, 1989).

اندازه‌گیری فعالیت آنزیم گلوتاتیون‌ردوکتاز بر اساس احیای گلوتاتیون اکسید‌شده (GSSG) توسط آنزیم گلوتاتیون‌ردوکتار با مصرف NADPH انجام شد (Sgherri et al., 1994). مخلوط واکنش شامل 100 میلی‌مولار بافر فسفات‌پتاسیم (اسیدیتۀ 7)، 5/0 میلی‌مولار گلوتاتیون اکسید‌شده (GSSG)، 50 میکرومولار NADPH، 5/1 میلی‌مولار MgCl₂، 2/0 میلی‌مولار Na₂EDTA و عصارۀ آنزیمی بود. میزان جذب نوری با اسپکترومتر در طول موج 340 نانومتر انجام شد.

محتوای آسکوربیک‌اسید: به‌منظور سنجش محتوای آسکوربیک‌اسید برگ، 1/0 گرم بافت گیاهی در 3 میلی‌لیتر سولفوسالیسیلیک‌اسید 5 درصد عصاره‌گیری شد و پس‌از سانتریفیوژ و جدا‌کردن محلول رویی، اسیدیته در محدودۀ 5/5 تا 5/6 تنظیم شد. محلول واکنش شامل تری‌کلرواستیک‌اسید 10 درصد، متافسفریک‌اسید، بی‌پیریدیل 4 درصد (حل‌شده در اتانول 70 درصد) و FeCl₃ 3 درصد بود. پس‌از گذشت 30 دقیقه، جذب نمونه‌ها با اسپکتروفتومتر در طول موج 525 نانومتر خوانده شد (Law et al., 1983).

به‌منظور اندازه‌گیری گلوتاتیون، 5/0 گرم برگ همراه با 5 میلی‌لیتر سولفوسالسیلیک‌اسید 5 درصد در هاون سرد هموژن شد و عصارۀ حاصل پس‌از صاف‌کردن، به‌مدت 10 دقیقه در 1000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شد. مقدار 1 میلی‌لیتر از بخش رویی آن برداشته و اسیدیتۀ آن با 5/1 میلی‌لیتر بافر فسفات‌پتاسیم 5/0 میلی‌مولار روی 5/7 تنظیم شد. محلول واکنش شامل 5/0 میلی‌‌لیتر بافر سدیم‌فسفات 1/0 مولار، 5 میلی‌مولار EDTA، 2/0 میلی‌لیتر 5، 5- دی‌تیوبیس (2-نیتروبنزوئیک‌اسید) 6 میلی‌مولار، 1/0 میلی‌لیتر NADPH 2 میلی‌مولار و 1/0 میلی‌لیتر گلوتاتیون‌ردوکتاز بود. واکنش با اضافه‌کردن 1/0 میلی‌لیتر عصاره آغاز شد. تغییرات جذب با اسپکتروفتومتر در 412 نانومتر ثبت شد (Smith, 1985).

به‌منظور اندازه‌گیری مالون‌دی‌آلدئید با‌توجه‌به واکنش تیوباربیتوریک‌اسید (TBA)، 5/0 گرم بافت برگی تازه در 1 میلی‌لیتر تری‌کلرواستیک‌اسید (TCA) 5 درصد ساییده شد. عصارۀ حاصل به لوله‌های سانتریفیوژ منتقل و به‌مدت 10 دقیقه در 4000 دوردردقیقه و دمای اتاق سانتریفیوژ شد. مقدار 2 میلی‌لیتر از عصاره به 2 میلی‌لیتر تیوباربیتوریک‌اسید 6/0 درصد اضافه و به‌مدت 10 دقیقه در حمام آب جوش قرار داده شد. جذب محلول رویی در طول موج‌های 532، 600 و 450 نانومتر خوانده و میزان مالون‌دی‌آلدئید بر اساس رابطۀ زیر محاسبه شد (Zhang and Qu, 2004):  MDA=645×(A532–A600)–0.56×A450.

به‌منظور اندازه‌گیری پراکسیدهیدروژن، 5/0 گرم نمونۀ برگ در 5 میلی‌لیتر تری‌کلرواستیک‌اسید (TCA) 1/0 درصد هموژن شد؛ سپس نمونه‌ها به لوله‌های سانتریفیوژ منتقل و به‌مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد با سرعت 15000 دور‌در‌دقیقه سانتریفوژ شدند و پس‌از‌آن، مقدار 5/0 میلی‌لیتر بافر فسفات‌پتاسیم 10 میلی‌مولار با اسیدیتۀ 7 و 1 میلی‌لیتر یدید‌پتاسیم 1 مولار به 5/0 میلی‌لیتر از محلول رویی اضافه شد. غلظت پراکسیدهیدروژن به‌وسیلۀ اسپکتوفتومتر در طول موج 390 نانومتر محاسبه شد (Velikova et al., 2000).

به‌منظور اندازه‌گیری گلایسین‌بتائین، 5/0 گرم بافت گیاهی با 20 میلی‌لیتر آب مقطر به‌مدت 48 ساعت در 25 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شد و پس‌از صاف‌کردن، عصاره به نسبت 1:1 با سولفوریک‌اسید 2 نرمال رقیق شد. نمونه‌ها به‌مدت 1 ساعت در لولۀ سانتریفیوژ و در آب یخ نگه داشته شدند؛ سپس معرف 2/0 میلی‌لیتر یدید- یدین‌پتاسیم سرد اضافه شد و نمونه‌ها به‌آهستگی با ورتکس مخلوط شدند. نمونه‌ها به‌مدت 16 ساعت در صفر تا 4 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند و سپس به‌مدت 15 دقیقه در 10000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شدند و 1 میلی‌لیتر از فاز رویی با میکروپیپت جدا و در 9 میلی‌لیتر 1، 2- دی کلرواتان (به‌عنوان معرف) حل شد. پس‌از 2 ساعت، جذب در 365 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد (Grieve and Grattan, 1983).

اندازه‌گیری قندهای محلول کل برگ بر اساس روش فنل‌سولفوریک‌اسید تعیین شد؛ این روش مبتنی بر هیدرولیز اسیدی قندهای محلول و ایجاد ترکیب فورفورال است که با فنل تولید کمپلکس رنگی می‌کند. در این روش، 5/0 گرم برگ با اتانول 70 درصد هموژن شد. عصارۀ حاصل صاف و به‌خوبی با فنل 5 درصد مخلوط شد؛ سپس 5 میلی‌لیتر سولفوریک‌اسید غلیظ 98 درصد به آن افزوده و یک ساعت بعد، جذب محلول‌ها با اسپکتروفتومتر در طول موج 485 نانومتر خوانده شد (Dubois et al., 1956).

به‌منظور اندازه‌گیری پرولین برگ، 5/0 گرم بافت برگی در هاون ساییده و با 10 میلی‌لیتر سولفوسالسیلیک‌اسید 3 درصد هموژن و عصارۀ حاصل برای حذف بافت برگی صاف شد. به‌منظور استخراج پرولین، 1 میلی‌لیتر از محلول در لولۀ آزمایش ریخته و 1 میلی‌لیتر معرف نین‌هیدرین و 1 میلی‌لیتر استیک‌اسید گلی‌سیال به آن اضافه شد و به‌مدت 1 ساعت در 100 درجۀ سانتی‌گراد انکوباته شد؛ سپس بی‌درنگ واکنش‌ها در حمام یخ متوقف شدند. مقدار 4 میلی‌لیتر تولوئن به هر لوله افزوده و محتویات آنها به‌خوبی مخلوط شد. هر لوله از دو فاز تشکیل شده بود که محلول قرمز بخش رویی نمونه‌برداری و جذب آن در طول موج 520 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر تعیین شد (Bates et al., 1973). تجزیه‌و‌تحلیل داده‌ها پس‌از اطمینان‌یافتن از نرمال‌بودن آنها با نرم‌افزار SAS 9.1 انجام و برای مقایسۀ میانگین‌ها از روش چنددامنه‌ای دانکن در سطح احتمال 1 درصد استفاده شد.

محاسبۀ درصد کلونیزاسیون: حدود 1 گرم از ریشه‌های شـنبلیله رنـگ‌آمیـزی و تعـداد 50 قطعـۀ یـک سانتی‌متری برای ارزیـابی درصـد کلونیزاسیون ریشه بـه‌شکل تصادفی انتخاب شدند. قطعه‌های ریشه روی لام و درون محلول لاکتوفنل زیر میکروسکوپ بررسی شدند. میزان کلونیزاسیون با برآورد طولی ریشه‌ای که به سـاختمان قارچی آلوده بود، محاسـبه شـد (Garcia et al., 2012).

نتایج و بحث.

نتایج برخی از ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی خاک موردمطالعه در جدول 1 نشان داده شده‌اند.

نتایج جدول تجزیه واریانس نشان دادند فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، آسکوربات‌پراکسیداز، گلوتاتیون‌ردوکتاز، محتوای آسکوربیک‌اسید، گلوتاتیون، مالون‌دی‌آلدئید، پراکسید‌هیدروژن، گلایسین‌بتائین و پرولین تحت‌تأثیر اثر متقابل سطوح آبیاری و کود زیستی قرار گرفتند؛ در‌حالی‌که قندهای محلول تحت‌تأثیر اثر سادۀ تیمارهای آزمایشی قرار گرفتند (جدول 2).

جدول 1- برخی ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی خاک منطقۀ موردمطالعه

جدول 2- تجزیه واریانس برخی ویژگی‌های فیزیولوژیکی شنبلیله تحت‌تأثیر رژیم‌های آبیاری و کودهای زیستی

ns، * و ** به‌ترتیب نشان‌دهندۀ عدم‌معنا‌داری و معنا‌داری در سطح احتمال پنج و یک درصد است.

فعالیت آنزیم کاتالاز: نتایج مقایسه میانگین داده‌ها نشان دادند با تأخیر در آبیاری، فعالیت آنزیم کاتالاز به‌طور معناداری کاهش می‌یابد؛ در‌حالی‌که کاربرد ترکیبی ریزموجودات در مقایسه با شاهد (بدون کاربرد کود زیستی) تأثیر معنا‌داری در افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز در هریک از سطوح آبیاری (50، 100 و 150 میلی‌متر تبخیر) نشان می‌دهد؛ به‌طوری‌که کاربرد ترکیبی قارچ میکوریزا و ازتوباکتر بیشترین تأثیر را در افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز دارد (جدول 3). کاهش فعالیت آنزیم کاتالاز به‌عنوان پاسخ کلی به تنش آبی (Pan et al., 2006; Liu et al., 2008) نتیجه‌ای از مهار سنتز آنزیم یا تغییر در جمع‌آوری آنزیم‌های زیرواحد در شرایط تنش است (Fazeli et al., 2018)؛ همچنین ممکن است با تخریب ناشی از پروتئازهای پراکسی‌زومی القا‌شده مرتبط باشد یا ممکن است پیامد غیرفعال‌شدن نوری آنزیم باشد (Liu et al., 2008). در شرایط تنش، افزایش متوسط فعالیت کاتالاز برگ در گیاهان تلقیح‌شده با ازتوباکتر و گیاهان میکوریزایی نشان می‌دهد تلقیح در این گیاهان قادر به افزایش فعالیت این آنزیم برای مقابله با خسارت اکسیداتیو ناشی از کمبود آب است؛ ازاین‌رو، مایه‌های تلقیح قادر به تنظیم واکنش‌های اکسیداتیو و دفاع آنتی‌اکسیدانی هستند (Ortiz et al., 2015).

فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز: میزان فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیدازدر گیاه شنبلیله با افزایش تنش خشکی کاهش یافت و حداکثر میزان فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز در گیاهان تلقیح‌شده با میکوریزا+ازتوباکتر با تیمار آبیاری در سطح 50 میلی‌متر تبخیر از تشتک به‌ دست آمد و میزان فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیدازدر تیمار ترکیبی قارچ میکوریزا و ازتوباکتر نسبت به شرایط کاربرد جداگانۀ قارچ میکوریزا و ازتوباکتر بیشتر بود (جدول 3).آسکوربات‌پراکسیداز، آنزیمی کلیدی در سامانۀ مهار آنزیمی ROS است که می‌تواند H₂O₂ تولید‌شده در کلروپلاست‌ها را از بین ببرد (Miller et al., 2010). با‌توجه‌به کاهش فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز در گیاهان شنبلیلۀ در معرض تنش کم‌آبی، گزارش شده است سطوح بالای H₂O₂ در شرایط تنش شدید آب می‌تواند آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی را مهار کند یا کاهش دهد (Fouad et al., 2014)؛به‌طوری‌که کاربرد تلفیقی قارچ میکـوریزا و باکتری‌های محرک رشد، تولیدات آنتی‌اکسیدانی را افزایش می‌دهند که این افزایش آنتی‌اکسیدانی موجب کم‌کردن گونـه‌هــای اکســیژن فعــال در برابــر تــنش و محافظــت ســلول‌ها در برابر تنش اکسیداتیو می‌شود. Andrade و همکاران (2010) در گزارش‌های خود، افزایش فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز را در گیاه لوبیا مایه‌زنی‌شده با کودهای زیستی عنوان کردند.

فعالیت آنزیم گلوتاتیون‌ردوکتاز: نتایج نشان دادند بیشترین فعالیت آنزیم گلوتاتیون‌ردوکتاز از تیمار ترکیبی قارچ میکوریزا و ازتوباکتر در سطح 50 میلی‌متر تبخیر از تشتک مشاهده می‌شود؛ به‌طوری‌که تیمار ترکیبی قارچ میکوریزا و ازتوباکتر در مقایسه با تیمار شاهد (بدون کاربرد کود زیستی)، میزان فعالیت آنزیم گلوتاتیون‌ردوکتاز را در هر سه رژیم آبیاری افزایش می‌دهد، همچنین میزان فعالیت آنزیم گلوتاتیون‌ردوکتاز در تیمار ترکیبی قارچ میکوریزا و ازتوباکتر نسبت به شرایط کاربرد جداگانۀ قارچ میکوریزا و ازتوباکتر بیشتر است (جدول 3). پژوهش حاضر نشان داد فعالیت آنزیم گلوتاتیون‌ردوکتاز در شرایط تنش کم‌آبی کاهش می‌یابد. افزایش فعالیت آنزیمی در گیاهان میکوریزایی، گیاهان تلقیح‌شده با باکتری ازتوباکتر و گیاهان با تلقیح دوگانه نشان داد ریزموجودات خسارت تنش اکسیداتیو ناشی از کمبود آب را کاهش می‌دهند. گزارش شده است همزیستی با قارچ میکوریزا به گیاهان کمک می‌کند با تنش خشکی مقابله کنند و احتمالاً با حفظ فرایندهای فتوسنتزی در اثر افزایش فعالیت‌های آنتی‌اکسیدانتی روبه‌رو ‌شوند (Mohammadi et al., 2019).

جدول 3- مقایسه میانگین برخی ویژگی‌های فیزیولوژیکی شنبلیله تحت‌تأثیر سطوح مختلف آبیاری و کود زیستی

میانگین‌های دارای حروف مشترک در هر ستون، اختلاف معنی‌داری بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال پنج درصد ندارند.