مقایسه و آنالیز بیوانفورماتیکی ژنوم کامل کلروپلاستی سه رقم توت فرنگی F.vesca, F.virginiana, F.chiloensis

با پیشرفت علم ژنتیک، ژن، عامل اصلی در برنامه‌ریزی عملکرد سلول و به‌دنبال آن تنظیم ویژگی‌های موجود‌زنده شناخته شد. به این ترتیب، تمایل برای شناخت هرچه بیشتر ژن‌ها برای توجیه پدیده‌های زیستی و بهبود زندگی انسان که پیچیده‌ترین موجود است، به‌ظور چشمگیری افزایش یافت؛ به طوری که در چند دهة اخیر، تجهیرات مورد نیاز در تحقیقات مولکولی به‌طور گسترده‌ای افزایش یافته‌اند و در حال حاضر، پژوهش‌های مولکولی، جزء بررسی‌های رایج آزمایشگاه‌های زیستی هستند. پروژه‌های تعیین توالی ژنوم موجودات مختلف از پروژه‌های بسیار رایج به شمار می‌روند (Khrustalev and Barkovsky, 2009; Saski et al., 2011). بیوانفورماتیک، شاخه‌ای از علم است که از علوم محاسباتی بهره می‌برد تا اطلاعات زیست‌شناسی - مولکولی، توالی‌های DNA یا پروتئین‌ها را در رایانه ذخیره و با ابزارهای محاسباتی و الگوریتم‌های قدرتمند ریاضی تحلیل کند. توالی‌های DNA مربوط به موجودات‌زندة مختلف برای دسترسی سریع و مقایسة آنها با یکدیگر در پایگاه‌های داده ذخیره می‌شوند. برای بهینه‌کردن تولید پروتئین در سیستم‌های بیانی، تحلیل الگوی کدون‌های مترادف و تعیین کدون‌های بهینه بسیار مهم هستند. در این راستا، کلروپلاست به‌دلیل اندازة ژنوم کوچک و تعداد کپی‌برداری زیاد اهمیت ویژه‌ای دارد؛ از این رو به تحلیل الگوی کدون‌های مترادف و تعیین کدون‌های بهینه در کلروپلاست گیاهان با روش‌‌های بیوانفورماتیک پرداخته می‌شود (Persson, 2000; Hirao et al., 2008; Perrow, 2011). توت‌فرنگی از خانوادة Rosaceae و جنس Fragaria است و گونه‌های متعددی دارد. تعدادکروموزوم پایه در این گیاه 7=X و تنوع در سطح پلوئیدی در آن زیاد است. در پژوهش حاضر، ژنوم کامل کلروپلاستی F. virginiana , F. chiloensis و مشهورترین گونة این جنس، F. vesca، بررسی شدند. پژوهش حاضر، با هدف بررسی و مقایسة توالی کامل کلروپلاست F. vesca، F. chiloensis و F.virginiana میوة توت‌فرنگی، تحلیل ساختار ژنوم، محتوای ژنوم‌و توالی‌های تکراری، کاربرد کدون و مقایسةبین ژنوم‌های موجود انجام شد. فرضیه‌های بررسی حاضر، شامل ژنوم کلروپلاست یعنی هدف اصلی در پژوهش‌های بیوتکنولوژی گیاهان، شناسایی ژن‌های دخیل در این ژنوم و نقش آنها در سیستم ژنتیکی گیاه است که کمک مؤثری به بهبود تولیدات مرتبط با سیستم فتوسنتزی گیاه خواهد کرد. همچنین شناسایی نقش ژن‌های موجود در ژنوم کلروپلاست و توانایی این ژن‌ها در بیان بیشینه از اهداف بررسی حاضر است که تولید واکسن‌های گیاهی را ممکن خواهد کرد. در چند دهة گذشته، پیشرفت در زیست‌شناسی مولکولی و تجهیزات لازم برای بررسی‌ها در این زمینه، افزایش سریع تعیین توالی ژنوم بسیاری از گونه‌های موجودات را باعث شد. در حال حاضر، توالی ژنوم بسیاری از موجودات ساده مانند باکتری‌ها تا موجودات بسیار پیشرفته مانند یوکاریوت‌های پیچیده شناسایی شده ‌است. پروژة شناسایی ژنوم انسان در سال ۱۹۹۰ آغاز شد و در سال ۲۰۰۳ پایان یافت و اکنون اطلاعات کامل مربوط به توالی هر 24 کروموزوم انسان موجود است (Cordenunsi et al., 2003; Debnath and Teixeira da Silva, 2007; Diekmann et al., 2009). گسترش روزافزون حجم زیاد داده‌های ژنومی و نیاز به ذخیره، بازیابی و تحیل مناسب این داده‌ها پیدایش علم بیوانفورماتیک را موجب شد. این دانش نوظهور به‌‌صورت دانشی بین‌رشته‌ای تلاش می‌کند با روش‌های موجود در علوم رایانه‌ای، ریاضیات، ژنتیک، شیمی، فیزیک و علوم مرتبط دیگر، مسائل مختلف زیست‌شناختی را که معمولاً در سطح مولکولی هستند حل کند. تلاش‌های پژوهشی اصلی در این رشته عبارتند از: تطابق توالی، کشف ژن، گردآوری ژنوم، تنظیم ساختار پروتئینی، پیش‌بینی ساختارهای دوم و سوم پروتئین، پیش‌بینی بیان ژن و تعاملات پروتئین - پروتئین و مدل‌سازی (Kim et al., 2009). Talat و Wang (2015) تحلیل بیوانفورماتیک ژنوم کلروپلاست پنبة دیپلوئید وحشی و دو گونة آلوتتراپلوئید را انجام دادند. نتایج بررسی آنها نشان دادند ژنوم کلروپلاست G. thurberi، 160264 جفت‌باز طول دارد و با ساختاری چهارگانه، محافظت شده است. ناحیه‌ای از نسخة تکی ژنوم کلروپلاستی از دو رشتة معکوس جدا شده است. قطعة بزرگ‌تر، 88737 جفت‌باز و قطعة کوچک‌تر 20271 جفت‌باز دارد؛ در حالی که نواحی تکرار معکوس هرکدام 25628 جفت‌باز طول داشتند.

مواد و روش‌ها

توالی‌یابی: ژنوم کامل کلروپلاست سه رقم توت‌فرنگی F.chiloensis، F.vesca و F.virginiana به‌ترتیب با شماره دسترسی‌های NC_019601.2، NC_019601.1 و NC_015206.1 از پایگاه NCBI با فرمت FASTA دانلود شدند.

تفسیر ژن: تفسیر ژن به‌طور سنتی بسیار خسته‌کننده و مستعد خطا است. همچنین، تفسیر ژن در بانک ژنی ازنظر نام ژن سازگار نیست و معمولاً خواندن‌ها (ycfs یا ORF) به‌روز نیستند. در گذشته، بسیاری از توالی‌های ژنوم کلروپلاستی با انجام BLAST N و BLAST X در بانک ژنی مشروح می‌شدند؛ اما در حال حاضر، با نرم‌افزار DOGMA بسیاری از این مشکلات، کاهش یافته و به پایان رسیده‌اند؛ بنابراین در پژوهش حاضر از نرم‌افزار DOGMA سال 2017 استفاده شد.

نقشه و ساختار ژنوم:نقشة دایره‌ای‌شکل ژنوم کامل کلروپلاستی برای مشاهدة ساختار و توزیع ژن هر سه رقم بررسی‌شده با ارجاع به تفسیرهای گذشته و دادن شمارة دسترسی موجود هر ژنوم با نرم‌افزار ‌OGDRAW سال 2017 ایجاد شد.

ساختار ژنوم کلروپلاستی و تحلیل توالی:Codon Usage اشاره به تفاوت در تعداد تکرار کدون مترادف در برنامه‌نویسی DNA دارد. کدون، متشکل از سه نوکلئوتید است که آمینواسید ویژه‌ای در زنجیرة پلی‌پپتید یا را رمز می‌کند یا کدون خاتمة ترجمه است که هیچ آمینواسیدی رمز نمی‌کند.  نسبت کدون‌های مترادف به کدون‌های مختلف در هر نمونة ژن (RSCU) با نرم‌افزار Codon W سال 2018 به‌صورت برنامة آنلاین محاسبه شد. Codon W برنامة طراحی‌شدة ساده‌ای برای تحلیل چند‌متغیرة کدون و آمینواسید است که برای محاسبة شاخص استاندارد کدون استفاده می‌شود.

محتوای GC:محتوای GC عاملی بسیار مهم در ژنوم کلروپلاستی است که بر ثبات ژنوم تأثیر می‌گذارد. محتوا و درصد GC موجود در سه رقم یادشده با داشتن توالی ژن‌های مربوطه از پایگاه NCBI و فایل بانک ژنی استخراج شد و با قراردادن توالی مربوطه در نرم‌افزار Visual Bioinformatics سال 2017، درصد مربوط به هر منطقه به دست آمد.

اینترون ها:اینترون‌ها بخش‌هایی از ژنوم هستند که رونویسی از روی آنها انجام می‌شود؛ اما ترجمه نمی‌شوند. برای مقایسة مقدار اینترون‌ها در ژنوم سه گونة بررسی‌شده از نرم‌افزار آنلاین DOGMA سال 2017 استفاده شد.

نتایج

ساختار و تفسیر ژنوم کلروپلاستی:ساختار ژنوم کلروپلاستی سه گونه در شکل 1 آورده شده است و نشان می‌دهد مجموع ژنوم کامل دایره‌ای‌شکل F. vesca، F. chiloensis و F. virginiana به‌ترتیب، طول‌هایی معادل 155691، 155603 و 155621 جفت‌باز دارند که شامل مناطق تکرار بزرگ (LSC)، مناطق تکرارکوچک (SSC)، دو منطقة تکرار معکوس (IR) و ساختار چهارجزئی هستند.

شکل 1- نقشة دایره‌ای‌شکل ساختار ژنوم کلروپلاستی 3 گونة F. vesca ssp. vesca (A)، F. chiloensis (B) و F. virginiana (C) و 130 ژن شناسایی‌شده در ژنوم کلروپلاست- ژن‌هایی که در خارج از حلقه نشان داده شده‌اند، در خلاف جهت حرکت عقربه‌های ساعت و ژن‌هایی که در داخل حلقه هستند، در جهت حرکت عقربه‌های ساعت رونویسی می‌شوند.

محتوای GC:محتوای GC عاملی بسیار مهم در ژنوم کلروپلاستی است که بر ثبات ژنوم اثر می‌گذارد. در زیست‌شناسی مولکولی و ژنتیک، محتوای GC یا گوانین - سیتوزین، درصدی از پایگاه‌های نیتروژنی در مولکول DNA است که در مقابل آدنین و تیمین قرار دارد که ممکن است به قطعه‌ای از DNA یا RNA یا کل ژنوم مربوط باشد. تنوع در محتوای GC، میان چهار منطقة مختلف در ژنوم کلروپلاستی سه رقم بررسی‌شده در شکل 2 نشان داده شده است. مقدار محتوای GC برحسب درصد در هریک از مناطق برنامه‌نویسی‌شده که شامل پروتئین‌ها و ژن‌های tRNA و rRNA هستند، مناطق غیر‌رمزگذاری‌شده که شامل مناطق بین‌ژنی و اینترون‌ها، کل توالی ژنوم کلروپلاستی و مناطق تک‌نسخه‌ای و تکرار معکوس هستند که توالی هرکدام به‌صورت دستی از پایگاه NCBI دانلود شد و همچنین با برنامة آنلاین CP Gavas توالی‌های دردسترس rRNA، tRNA و پروتئین به دست آمدند. در هر سه رقم بررسی‌شده، نتایج مشابه به دست آمدند و داده‌های به‌دست‌آمده، با CG view روی یک نقشة ژنومی دایره‌ای‌شکل برای هر سه رقم نمایش داده شدند. علاوه‌بر محتوای GC و انحراف GC، ژن‌های CDS، ORF، rRNA و tRNAها و کدون‌های شروع و پایان بر نقشه نمایان شدند. با توجه به نتایج، در منطقة رمزگذاری‌شده، ژن‌های rRNA بیشترین و ژن‌های پروتئینی، کمترین مقدار GC را داشتند. مناطق غیرکدکننده، تحول سریع تجربه می‌کنند؛ درنتیجه، این مناطق نسبت به مناطق دیگر، GC و Coding غنی‌تری دارند.

شکل 2- نقشة دایره‌ای نشان‌دهندة مقدار GC، جایگاه و فراوانی ژن‌های tRNA و rRNA در 3 گونة F. vesca ssp. vesca (A)، F. chiloensis (B) و F. virginiana (C)

نمودار توزیع NC:نمودار توزیعNC که شاخص‌های ENC و GC3S در آن دخیل هستند برای هر سه ژنوم کلروپلاست بررسی‌شده در شکل 3 نشان داده شده است. از آنجا که نتایج مربوط به این تحلیل برای هرسه ژنوم، تقریباً یکسان به دست آمدند، ژنوم کلروپلاست Fragaria vescaمرجع قرار داده شد و توضیحات، براساس آن ارائه می‌شوند. مقادیر ENC از 72/38 تا 72/61 متغیر هستند که میانگین 22/50 و انحراف استاندارد 56/5 دارند. ناهمگونی کاربرد کدون، بیشتر به‌دلیل تنوع مقادیر GC3 است که از 17 تا 58 درصد متغیر است و میانگین 41 درصد و انحراف استاندارد 10 درصد دارد. اگر GC3 به‌طور کامل بر انحراف کاربرد کدون تأثیر بگذارد، مقادیر NC روی نمودار، بین GC3S وNC پیش‌بینی می‌شود. تعداد درخورتوجهی از نقاط، روی نمودار قرار گرفته‌اند و به‌سمت ناحیه‌ای هستند که ازنظرGC فقیر است که این از ترکیب نوکلئوتیدی شدید منشاء می‌گیرد؛ اما موضوع جالب توجه این است که بیشتر نقاط با مقادیر NC کم در زیر نمودار پیش‌بینی‌شده قرار گرفته‌اند. این نتایج نشان می‌دهند برخی ژن‌ها در Fragaria vesca کاربرد کدونی مستقل از ترکیب نوکلوتیدی مشتق از فشار جهشی و متأثر از عوامل دیگر دارند که مستقل از محدودیت‌های ترکیبی هستند.

اینترون:اینترون‌ها بخش‌هایی از ژنوم هستندکه در فرایند رونویسی رمزهایDNA، رونویسی از روی آنها انجام می‌شود؛ ولی در فرایند پیرایش برداشته می‌شوند؛ از این رو در فرایند رمزخوانی، پروتئین‌ها از روی آنها ساخته نمی‌شوند. به همین دلیل، به آنها اینترون گفته می‌شود. اینترون‌ها در چیدمان DNA در میان رمزهای ژن و در چیدمان RNA پس از رونویسی رمزهای DNA دیده می‌شوند. این بخش‌ها در بسیاری از موجودات و حتی در برخی ویروس‌ها نیز دیده می‌شوند. اندازة آنها ممکن است بسیار بزرگ باشد.

فراوانی ژن‌ها در مناطق تک‌نسخه‌ای وتکرار معکوس:در تحول کلروپلاست پیدا‌کردن مناطق مناسب بین‌‌ژنی برای یکپارچه‌کردن کارآمد ترانس‌ژن‌ها بسیار مهم است. در گوجه‌فرنگی و سیب‌زمینی، پژوهشگران از rps 12، trnV، accD، rpcL، trnG، trnfM و مناطق بین‌ژنی rRNA16s-ORF 70B برای ادغام مناطق بین‌ژنی تنباکو استفاده کرده‌اند (Kim et al., 2009)؛ بنابراین، یک نسخة کامل از کپی دوم ژن rps 19 و یک کپی ناقص از rpl 22 در مجاورت trnH وجود دارد. این تکراری است که به احتمال زیاد با توجه به گسترش IR B در محل اتصال LSC، فرایندی مشترک در ژنوم کلروپلاست است (Talat and Wang, 2015). در پژوهش حاضر، مطابق با شکل 4، روش قرارگیری و طول مربوط به هر ژن در محل اتصال LSC/IR, SSC/IR با سه گونة مرجع نشان داده شده‌اند.

شکل 3- مقادیر GC3S در مقابل NC در ژنوم کلروپلاستی 3 گونة F. vesca ssp. vesca (A)، F. virginiana (B) و F. chiloensis (C)

جدول 1- تفاوت در طول و جایگاه اینترون‌ها در سه رقم بررسی‌شده

شکل4- نقشة تعیین محل قرارگیری ژن‌ها بر مناطق تک‌نسخه‌ای و تکرار معکوس از سه گونة مرجع با ژنوم‌های بررسی‌شده- ردیف‌های 4، 5 و 6 از منبع Talat و Wang (2015) اقتباس شده‌اند.

بحث

براساس نتایج به‌دست‌آمده، ژنوم کلروپلاستی F. chiloensis، F. virginiana و F. vesca ساختار چهاروجهی دارد. مجموع ژنوم کامل دایره‌ای‌شکل F.chiloensis با طولی برابر 155603 جفت باز کوتاه‌تر از دو رقم F. virginiana (155621) و F. vesva (155691) است. در هرسه رقم، همة مناطق تکرار کپی کوچک با دو منطقة تکرار معکوس از هم جدا شده‌اند که با توجه به تنوع ژنوم کلروپلاستی بین این ارقام، بسیار شبیه به یکدیگر بودند. هنوز اطلاعات بسیار اندکی دربارة میزان تنوع بین مناطق رمزگذاری‌نشدة ژنوم کلروپلاستی وجود دارد و در بررسی حاضر، در ارزیابی نسبی سطح تنوع بین همة مناطق غیررمزگذار منطقة کوچک کپی ژنوم کلروپلاستی به‌طور مستقیم چند مورد استثناء دیده شد که ژنوم کلروپلاستی، دو تکرار معکوس دارد که هرکدام به‌طور تقریبی 25 کیلو باز دارد و تصویر آینه‌ای از یکدیگر به‌صورت مکمل ژن هستند. با توجه به تحلیل کل ژنوم در رقم‌های F. chiloensis، F. virginiana و F. vesca،‌ طول مناطق تکرار بزرگ آنها به‌ترتیب، 85561، 85539، 85520 جفت‌باز، طول منطقة تکرار کپی کوچک آنها به‌ترتیب، 20204، 20300 و20300 جفت‌باز و طول مناطق تکرار معکوس آنها به‌ترتیب 24963، 24891 و 24891 جفت‌باز بود که نشان‌دهندة شباهت توالی بسیار زیاد بین این ارقام است. همچنین برای رقم‌های یادشده، طول منطقة برنامه‌نویسی‌شده به‌ترتیب 83925، 83795 و 83795 جفت‌باز و طول منطقة برنامه‌نویسی‌نشده به‌ترتیب 66044، 65784 و 65789 جفت‌باز به دست آمدکه نشان‌دهندة تفاوت بسیار جزئی در توالی است و دو رقم شیلنسیس و ویرجینیانا طولی مشابه درمنطقة برنامه‌نویسی دارند. ژنوم کلروپلاستی سه رقم، 7/44 درصد از پروتئین را رمزگذاری می‌کند. همچنین نسبت میان مناطق بین‌ژنی و اینترون‌ها مشاهده شد؛ بدین ترتیب که در F. vesca طول منطقة بین‌ژنی و اینترون به‌ترتیب 53/30 و 07/12 درصد، در F. virginiana به‌ترتیب 52/30 و 07/12 درصد و برای F. chiloensis به‌ترتیب 51/30 و 07/12 درصد به دست آمد. محتوای GC در رقم‌های ویرجینیانا و شیلنسیس، 45/36 درصد و در رقم F. vesca، 21/37 درصد بود که بسیار نزدیک به مقدار جهانی آن (73/36 درصد) است. در رقم‌های F. chiloensis، F. virginiana و F. vesca،محتوای GC در منطقة برنامه‌نویسی‌شده، به‌ترتیب برابر با 02/37، 02/37 و 09/36 درصد و در منطقة برنامه‌نویسی‌نشده به‌ترتیب برابر با 97/31، 95/31 و 93/31 درصد بود که نشان می‌دهد هردو منطقه مقدار اندکی GC دارند. دلیل این مسئله، وجود ژن‌های ریبوزومی و مناطق رمزگذاری‌شده در منطقة IR برای داشتن مقدار زیاد GC است. مناطق غیررمزگذار، تحولی سریع را تجربه می‌کنند؛ درنتیجه، این مناطق نسبت به مناطق رمزگذار، GC غنی‌تری دارند. محتوای GC یکی از ویژگی‌های مهم ژنوم است که با تعدادی از جایگاه‌های اتصال micro RNA همبسته است. محتوای GC در سمت 5'UTR و 3'UTR متفاوت است. همچنین محتوایGC اثری بر RNAi دارد که دلیل آن همبستگی زیاد بین جایگاه دسترسی زیاد RNAi و همبستگی منفی با فعالیت RNAi است. با تفسیر ژنوم کلروپلاستی سه رقم بحث‌شده، درمجموع برای هریک از رقم‌‌ها 130 ژن کلروپلاستی یافت شدند که مطابق با عمل ژن آنها به چهار گروه طبقه‌بندی می‌شوند که عبارتند از: ژن‌های مرتبط با خود جایگزینی، ژن‌های مرتبط با فتوسنتز، ژن‌های مرتبط با اعمال دیگر و ژن‌های با اعمال ناشناخته. میان این ژن‌ها، هشت ژن rRNA، 37 ژن tRNA و 85 ژن کدکنندة پروتئین در هرسه رقم هستند.که بین اینها هفت ژن tRNA و چهار ژن rRNA در منطقة تکرار معکوس نمایان شدند. ژن rRNA به‌طور مرتب در 5، 4، 23، 16 و 5 و srRNA در هردو طرف IR تنظیم شده است. ycf 1 تقریباً در همة توالی‌های پلاستیدی تا به امروز وجود داشته است و پیش‌بینی می‌شود در برخی از مسیرهای اساسی در متابولیسم سلولی یا در خدمت برخی از اعمال ساختمانی برای محافظت پلاستید باشد. همچنین فرض شده است ycf 1 مسئولیت کدگذاری غشای درونی کلروپلاست را بر عهده دارد؛ با این حال عمل ycf 1 به‌طور دقیق مشخص نشده است؛ ولی به نظر می‌رسد برای بقای گیاه ضروری باشد. در توالی ژنوم کلروپلاستی، این ژن معمولاً در دهانة مرز مناطق IR و SSC قرار دارد. با توجه به جایگاه مشترک ژن ycf 1 در ژنوم کلروپلاستی یک کپی از آن در مرز بین IRA/SSC و یک کپی کوتاه از شبه‌ژن ycf 1 در مرز بین IR b/SSC در رقم F. vesca و در رقم‌های شیلنسیس و ویرجینیانا به‌ترتیب با 1103 و 5647 جفت‌باز به دست آمد. در این ارقام، جایگاه شبه‌ژن‌ها در محل اتصال LSC/SSC و IR قرار دارد.

جمع‌بندی

بررسی حاضر، زمینه‌ای برای پژوهش‌های پروتئومیکس است. پروتئومیکس، علم بررسی گستردة پروتئوم شامل مطالعة بیان، تغییرات پس از ترجمه و بررسی برهم‌کنش پروتئین‌ها با سایر مولکول‌ها است. تحلیل جامع پروتئین‌ها با هدف بررسی تنوع ژنتیکی، بررسی تفاوت‌ها و پاسخ به تنش‌ها موضوع اصلی علم بین‌رشته‌ای پروتئومیکس است. پروتئومیکس با بهره‌گیری از علوم شیمی پروتئین‌ها، بیوانفورماتیک و زیست‌شناسی به شناسایی، کمیت‌سنجی، بررسی تغییرات پس از ترجمه و برهم‌کنش‌های پروتئین‌ها می‌پردازد. هدف پروتئومیکس، شناسایی پروتئین‌های جدید براساس نقش، وظیفه و بررسی روش بیان آنها در سیستم‌های تنظیمی است. در حال حاضر، بخش اصلی فعالیت‌های پروتئومیکس، جداکردن پروتئین‌های بافت‌ها با الکتروفورز دوبعدی و شناسایی متعاقب آنها با طیف‌سنجی جرمی است. نتایج حاصل از پژوهش حاضر و بررسی‌های مشابه، با در اختیار قرار دادن اطلاعات تکمیلی از توالی‌یابی‌های ژنی و متابولیت‌های سلولی، زمینة بهره‌برداری را از این داده‌ها در تحلیل پروتئین‌های سنتز‌شده فراهم خواهند کرد. پژوهش حاضر، آغاز پروژة ترانسکریپتومیکس و پروتئومیکس در گونه‌های بررسی‌شدة دانش‌پژوهان در زمینة علوم ژنومیکس است.

سپاسگزاری

نگارندگان مقاله از مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی استان آذربایجان غربی و گروه علوم باغبانی دانشکدة کشاورزی مؤسسة آموزش عالی صبا به‌دلیل حمایت از انجام پژوهش حاضر سپاسگزاری می‌کنند.