تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشد بر کالوس‌زایی، باززایی و تولید سوخ در گیاه والک (Allium akaka subsp. akaka)

جنس آلیوم (Allium) از خانوادة Amaryllidaceae، یکی از بزرگ‌ترین جنس‌های گیاهان تک‌لپه‌ای با حدود 900 گونه در جهان است (Akhavan et al., 2014). 126 گونه و زیرگونه از این جنس در ایران گزارش شده‌اند (Memariani et al., 2012). گیاه دارویی والک (Allium akaka) گونه‌ای از گیاهان زیرجنس Melanocrommyum استو از لحاظ گیاه‌شناسی و خواص دارویی شباهت بسیاری با دیگر گیاهان جنس آلیوم دارد (Fritsch and Abbasi, 2013).

محل رویش Allium akaka در منطقة شمال غربی ایران، غرب دریای خزر، خارج از ناحیة هیرکانی و کوه‌های تالش است (Fritsch and Abbasi, 2013). از برگ و پیاز والک استفادة خوراکی می‌شود. این گیاه علاوه‌بر ارزش غذایی، خواص دارویی‌ مانند کاهندگی چربی خون، تنظیم‌کنندگی قند خون و آثار ضدباکتری، ضد ویروس و ضدتومور دارد (Vazquez-Prieto and Miatello, 2010). مهم‌ترین مواد مؤثرة موجود در این گیاه، آلین، آلیسین و آجوان هستند که در درمان سلول‌های سرطانی، فشار خون و تقویت سیستم ایمنی بدن نقش مهمی دارند و با خاصیت آنتی‌اکسیدانی بر حفاظت از کبد و کاهش خطر بیماری‌های قلبی و عروقی مؤثر هستند (Kamenetsky and Rabinowitch, 2006).

والک، گیاهی چند ساله است که در ماه‌های اردیبهشت و خرداد ظاهر و از طبیعت برداشت می‌شود. برداشت‌های بی‌رویه و ناصحیح این گیاه باعث شده است این گیاه ارزشمند در فهرست گیاهان در معرض انقراض قرار گیرد. با توجه به ارزشمندی ذخایر ژنتیکی هر کشور، توجه به حفظ ژرم‌پلاسم این گیاه ضروری است. با توجه به اینکه بذر این گیاه خواب دارد، بهینه‌کردن کشت بافت و تکثیر این گیاه به حفظ ژرم پلاسم و تولید انبوه آن کمک و نیز مسیر را برای تولید متابولیت‌های ثانویة این گیاه در شرایط درون شیشه هموار می‌کند.

بررسی‌های مختلفی بر تکثیر گیاهان جنس آلیوم با کشت بافت انجام شده‌اند و از این روش برای تکثیر کلونال و حفظ درون‌شیشه‌ای بسیاری از گونه‌های جنس آلیوم استفاده شده است (Myers and Simon, 1999; Toaima et al., 2003; Luciani et al., 2006; Banarus, 2014; Hassan et al., 2014)؛ اما تاکنون تکثیر کشت بافتی گیاه والک بررسی‌ نشده است. استفاده از تنظیم‌کننده‌های رشد از عوامل بسیار مؤثر در کشت بافت است. بررسی‌ها نشان داده‌اند نسبت حدواسط اکسین به سیتوکینین، کالوس‌زایی را القا می‌کند و نسبت زیاد اکسین به سیتوکینین و سیتوکینین به اکسین به‌ترتیب به باززایی ریشه و ساقه منجر می‌شوند (Ikeuchi et al., 2013). کربوهیدرات از دیگر عواملی است که برای حفظ پتانسیل اسمزی و به‌عنوان منبع انرژی و کربن در کشت بافت استفاده می‌شود و ساکارز متداول‌ترین شکل استفاده از آن است (Yaseen et al., 2013). در پژوهشی بر ریزنمونة مریستم ریشة سیر (Allium sativum)، تیمار 3 میلی‌گرم در لیتر 6-بنزیل آدنین (6-Benzyladenine)، 03/0 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) با 2 میلی‌گرم در لیتر 1- نفتالن استیک اسید (NAA) در محیط‌کشت B5 (Gamborg et al., 1976)، 4/93 درصد کالوس‌دهی و تیمار 3 میلی‌گرم در لیتر بنزیل آدنین با 6 میلی‌گرم در لیتر 1- نفتالن استیک اسید، 5/62 درصد باززایی را موجب شدند (Barandiaran et al., 1999). استفاده از 2,4-D با غلظت 5/0 میلی‌گرم در لیتر در محیط‌کشت B5 نیز به 93 درصد کالوس‌زایی در سیر منجر شده است (Fereol et al., 2002). در بررسی دیگر بر سیر، در محیط‌کشت MS (Murashige and Skoog, 1962) دارای 2,4-D با غلظت 5/1 میلی‌گرم در لیتر و کینتین (Kinetin) با غلظت 5 میلی‌گرم در لیتر85 درصد کالوس‌دهی و در غلظت 10 میلی‌گرم در لیتر بنزیل آدنین، 54 درصد باززایی به دست آمد (Khan et al., 2004). در گیاه A. chinenes استفاده از 2,4-D با غلظت 1 میلی‌گرم در لیتر و بنزیل آدنین با غلظت 1/0 میلی‌گرم در لیتر در محیط‌کشت B5، 2/65 درصد کالوس‌زایی و تیمار 1/0 میلی‌گرم در لیتر بنزیل آدنین و 1 میلی‌گرم در لیتر 1- نفتالن استیک اسید، 8/58 درصد باززایی را موجب شدند (Yan et al., 2009). در موسیر (A. hirtifolium) نیز بیشترین درصد کالوس‌زایی در 5/1 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D و 5/0 میلی‌گرم در لیتر بنزیل آدنین و بیشترین باززایی در 5/0 میلی‌گرم در لیتر 1- نفتالن استیک اسید با 1 میلی‌گرم در لیتر تیدیازورون (TDZ) مشاهده شدند (Farhadi et al., 2017).

به‌دلیل اهمیت تنظیم‌کننده‌های رشد در بهینه‌کردن شرایط کشت بافت یک گیاه، در پژوهش حاضر، اثر تنظیم‌کننده‌های رشد بر کالوس‌دهی، باززایی و تولید برگساره و همچنین تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشد با درصد ساکارز بر تولید سوخ در برگساره‌های باززا شدة والک بررسی شدند. پژوهش حاضر، نخستین بررسی در زمینة کشت بافت این گیاه دارویی ارزشمند و مواجه با خطر انقراض است.

مواد و روش‌ها

برای کالوس‌دهی، باززایی و تولید سوخ در والک (A. akaka)، سوخ‌های این گیاه از منطقة زنجان (48 درجه و 51 دقیقة طول شرقی و 36 درجه و 46 دقیقة عرض شمالی) جمع‌آوری و استفاده شدند. برای انجام آزمایش، ابتدا پوشش سوخ‌ها و ریشه‌های آنها حذف شدند و سوخ‌های آماده‌شده به‌مدت 60 دقیقه با آب شستشو داده شدند؛ سپس پنج دقیقه در الکل 70 درصد و 15 دقیقه در سدیم هیپوکلریت 10 درصد با تویین 20 (یک قطره برای هر 50 میلی‌لیتر) ضدعفونی شدند. سوخ‌ها پس از هر مرحله 3 بار با آب‌مقطر استریل شستشو شدند.

برای تعیین بهترین ترکیب از تنظیم‌کننده‌های رشد برای کالوس‌دهی با بررسی منابع، آزمایشی در قالب طرح کاملاً تصادفی با چهار تکرار طراحی شد. تیمارها شامل ترکیبی از غلظت‌های 1/0، 5/0 و 1 میلی‌گرم در لیتر 1- نفتالن استیک اسید با غلظت‌های 5/0 یا 1 میلی‌گرم در لیتر بنزیل آدنین یا تیدیازورون بودند. در این آزمایش از ریزنمونة صفحة پایگاهی (Stem-disc) و محیط‌کشت B5 (Gamborg et al., 1976) استفاده شد. نمونه‌ها در اتاقک رشد با دمای 25 درجة سانتی‌گراد و در شرایط تاریکی نگهداری شدند. پس از 8 هفته، درصد کالوس‌زایی در هر تکرار براساس تعداد ریزنمونه‌های کالوس‌داده به تعداد کل ریزنمونه‌ها ضرب در 100 محاسبه شد. نمونه‌ها هر چهار هفته یک‌بار واکشت شدند.

برای تعیین بهترین ترکیب تنظیم‌کننده‌های رشد برای باززایی، آزمایشی در قالب طرح کاملاً تصادفی با چهار تکرار بر کالوس‌های به‌دست‌آمده انجام شد. تیمارهای آزمایش شامل ترکیبی از غلظت‌های 5/0 و 1 میلی‌گرم در لیتر 1- نفتالن استیک اسید یا ایندول -3- بوتیریک اسید (IBA) با غلظت‌های 5/0و 1 میلی‌گرم در لیتر تیدیازورون بودند. از کالوس‌های ‌هم‌اندازة به‌دست‌آمده از آزمایش قبل و محیط‌کشت B5 برای انجام این آزمایش استفاده شد. نمونه‌ها در دمای 25 درجة سانتی‌گراد و در شرایط 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی نگهداری شدند. پس از هشت هفته، درصد باززایی براساس تعداد کالوس‌های باززاشده به تعداد کل کالوس‌ها محاسبه و تعداد برگساره‌های تشکیل‌شده در هر کشت نیز ثبت شد. نمونه‌ها هر چهار هفته یک‌بار واکشت شدند.

برای تولید سوخ از برگساره‌های باززایی‌شده، آزمایشی به‌صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار طراحی شد. تیمارهای آزمایش شامل محیط‌های کشت B5 حاوی ساکارز در دو غلظت 6 و 12 درصد، بدون تنظیم‌کنندة رشد یا حاوی آبسزیک اسید (ABA) با غلظت 1 میلی‌گرم در لیتر بودند. نمونه‌ها در اتاقک رشد با دمای 25 درجة سانتی‌گراد و در شرایط 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار گرفتند. پس از شش هفته، درصد تولید سوخ در هر تکرار براساس تعداد ریزنمونه‌های سوخ‌داده به تعداد کل ریزنمونه‌ها ضرب در 100 محاسبه شد. نمونه‌ها هر 4 هفته یک‌بار واکشت شدند.

تحلیل آماری: تحلیل داده‌ها با نرم‌افزار SAS، نسخه‌های 3، 1 و 9 انجام و برای مقایسة میانگین داده‌ها از آزمون چنددامنه‌ای دانکن در سطح 1 درصد استفاده شد.

نتایج و بحث

تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشد بر کالوس‌دهی والک:نتایج تجزیة واریانس داده‌های به‌دست‌آمده از تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشد بر کالوس‌زایی والک نشان دادند بین تیمارهای مختلف در کالوس‌زایی تفاوت معنی‌داری در سطح 1 درصد وجود دارد (شکل 1). مقایسة میانگین داده‌ها نشان داد بیشترین درصد کالوس‌زایی به تیمار 1/0 میلی‌گرم بر لیتر 1- نفتالن استیک اسید با 5/0 میلی‌گرم بر لیتر تیدیازورون (7/93 درصد) تعلق داشت و درصد کالوس‌زایی در این تیمار با تیمارهایی که در آنها از غلظت‌های 1/0 و 5/0 میلی‌گرم بر لیتر 1- نفتالن استیک اسید با 5/0 میلی‌گرم بر لیتر بنزیل آدنین یا تیدیازورون یا 1 میلی‌گرم بر لیتر تیدیازورون استفاده شده بود تفاوت معنی‌داری نداشت. کمترین درصد کالوس‌زایی به تیمار 1 میلی‌گرم بر لیتر 1- نفتالن استیک اسید با 5/0 میلی‌گرم بر لیتر تیدیازورون (25 درصد) تعلق داشت که با تیمارهایی که در آنها از غلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر بنزیل آدنین استفاده شده بود تفاوت معنی‌داری نداشت. در همة تیمارهای اعمال‌ شده کالوس تشکیل شد و شروع کالوس‌دهی از انتهای هفتة دوم بود.

شکل 1- مقایسة درصد کالوس‌زایی در ریزنمونه‌های صفحة پایگاهی سوخ والک در غلظت‌های مختلف تنظیم‌کنندة رشد نفتالن 3- استیک اسید (N) با 6-بنزیل آدنین (B) و تیدیازورون (T)- N1 تا N3 به‌ترتیب نشان‌دهندة غلظت‌های 1/0، 5/0 و 1 میلی‌گرم در لیتر نفتالن 3- استیک اسید، B1 و B2 به‌ترتیب نشان‌دهندة غلظت‌های 5/0 و 1 میلی‌گرم در لیتر بنزیل آدنین و T1 و T2 به‌ترتیب نشان‌دهندة غلظت‌های 5/0 و 1 میلی‌گرم در لیتر تیدیازورون هستند. مقادیر، میانگین چهار تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة معنی‌داربودن میانگین‌ها در سطح 01/0P≤ براساس آزمون دانکن هستند.

از اکسین‌ها در کنار سیتوکینین‌ها برای کالوس‌زایی در آلیوم‌ها استفاده می‌شود. در سیر، ترکیب 2 میلی‌گرم در لیتر IAA و 4 میلی‌گرم در لیتر کینتین به کالوس‌زایی منجر شد (El-Nil, 1977). مقایسة تأثیر دو تنظیم‌کنندة رشد 1- نفتالن استیک اسید و 2,4-D در کالوس‌زایی در سیر نشان داد کالوس‌دهی در تیمارهای 1 میلی‌گرم در لیتر 1- نفتالن استیک اسید و 1/0 میلی‌گرم در لیتر بنزیل آدنین 37 درصد و در 1 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D و 1/0 میلی‌گرم در لیتر بنزیل آدنین، 65 درصد بود (Yan et al., 2009). با آنکه استفاده از 2,4-D به کالوس‌دهی بیشتری در آلیوم‌ها منجر می‌شود؛ اما به‌دلیل ایجاد جهش به‌دنبال کاربرد آن، استفاده از تنظیم‌کننده‌های رشد جایگزین، مناسب‌تر است. در پژوهش حاضر، در تیمار 5/0 میلی‌گرم بر لیتر تیدیازورون، افزایش غلظت اکسین به 1 میلی‌گرم بر لیتر به کاهش کالوس‌دهی منجر شد. نتایج پژوهشی بر سیر نیز نشان دادند غلظت زیاد 1-نفتالن استیک اسید به کاهش تشکیل کالوس در این گیاه منجر شد (Kapoor et al., 2011). در پژوهش حاضر، در همة غلظت‌های 1- نفتالن استیک اسید افزایش سطح کاربرد بنزیل آدنین به کاهش کالوس‌زایی منجر شد؛ اما در تیدیازورون این اتفاق رخ نداد. نتایج بررسی انجام‌شده بر سیر نشان دادند غلظت‌های زیاد بنزیل آدنین به کاهش تشکیل کالوس منجر شدند (Barandiaran et al., 1999) که منطبق با نتایج بررسی حاضر بودند. بررسی‌ها همچنین نشان دادند غلظت‌های زیاد اکسین‌ها و سیتوکینین‌ها از تقسیم سلو‌ل‌های مریستمی و کالوس‌زایی ممانعت کردند (Can et al., 2008).

تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشد بر باززایی والک: نتایج تجزیة واریانس داده‌های به‌دست‌آمده از به‌کارگیری ترکیبات مختلفی از اکسین‌ها و سیتوکینین‌ بر باززایی والک نشان دادند تفاوت معنی‌داری میان تیمارهای مختلف در سطح 1 درصد در باززایی غیرمستقیم از والک و میزان تولید برگساره وجود دارد. نتایج مقایسة میانگین داده‌ها (شکل 2- A) نشان دادند بیشترین درصد باززایی، بین تیمارهای اعمال‌شده (6/91 درصد)، متعلق به تیمار 1 میلی‌گرم بر لیتر 1- نفتالن استیک اسید یا 1 میلی‌گرم بر لیتر ایندول -3- بوتیریک اسید با 1 میلی‌گرم بر لیتر تیدیازورون بود که میزان آن با تیمارهای 5/0 میلی‌گرم بر لیتر 1- نفتالن استیک اسید یا 1 میلی‌گرم بر لیتر ایندول -3- بوتیریک اسید با 5/0 میلی‌گرم بر لیتر تیدیازورون و نیز تیمار 5/0 میلی‌گرم بر لیتر ایندول -3- بوتیریک اسید با 1 میلی‌گرم بر لیتر تیدیازورون تفاوت معنی داری نداشت. کمترین درصد باززایی (50 درصد) به ایندول -3- بوتیریک اسید با غلظت 5/0 میلی‌گرم بر لیتر با تیدیازورون با غلظت 5/0 میلی‌گرم بر لیتر تعلق داشت که تفاوت معنی‌داری در درصد باززایی با تیمارهای 5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر 1- نفتالن استیک اسید به‌ترتیب با 1 و 5/0 میلی‌گرم بر لیتر تیدیازورون نشان نداد.

بیشترین میزان تولید برگساره بین تیمارهای اعمال‌شده (7/9 برگ)، مربوط به تیمار 5/0 میلی‌گرم بر لیتر 1- نفتالن استیک اسید با 5/0 میلی‌گرم بر لیتر تیدیازورن بود که تنها با تیمارهای 1 میلی‌گرم بر لیتر 1- نفتالن استیک اسید یا 5/0 میلی‌گرم بر لیتر ایندول -3- بوتیریک اسید با 5/0 میلی‌گرم بر لیتر تیدیازورون و نیز 5/0 میلی‌گرم بر لیتر 1- نفتالن استیک اسید با 1 میلی‌گرم بر لیتر تیدیازورون که کمترین درصد تولید برگساره را تفاوت معنی‌دار نشان داد؛ اما با سایرین تفاوت معنی‌داری نداشت (شکل 2- B).

باززایی، یکی از پدیده‌های تنظیم‌شونده با برهم‌کنش اکسین‌ها و سیتوکینین‌ها است. غلظت مناسب هریک از این تنظیم‌کننده‌های رشد بسته به گیاه، شرایط کشت و نوع تنظیم‌کننده رشد متفاوت است (Gaspar et al., 1996; Haghighat Hour et al., 2012; Safarnejad et al., 2016). در بررسی حاضر، در تیمارهای حاوی مقادیر مساوی 1- نفتالن استیک اسید و تیدیازورون، بیشترین درصد باززایی و تولید برگساره مشاهده شد و در ترکیب ایندول 3- استیک اسید و تیدیازورون بجز زمانی که از کمترین غلظت هردو تنظیم‌کنندة‌ رشد استفاده شده بود، بیشترین درصد باززایی و تولید برگساره به دست آمدند. در پژوهشی که بر اکوتیپ‌های مختلف موسیر انجام شده بود، بیشترین باززایی در محیط حاوی 1 میلی‌گرم در لیتر تیدیازورون با 5/0 میلی‌گرم در لیتر 1- نفتالن استیک اسید مشاهده شد (Farhadi et al., 2017). همچنین بیشترین مقدار تولید برگساره در بیشتر اکوتیپ‌های بررسی‌شده در تیمار 5/0 میلی‌گرم در لیتر 1- نفتالن استیک اسید با 5/0 و 1 میلی‌گرم در لیتر تیدیازورون به دست آمد .(Farhadi et al., 2017) در بررسی باززایی A. karataviense مشاهده شد ترکیب سیتوکینین‌ها با 1- نفتالن استیک اسید به افزایش میزان باززایی در این گیاه منجر شد (Kozak and Stelmaszczuk, 2013).

بین تیمارهای بررسی‌شده در پژوهش حاضر، تیمار 5/0 میلی‌گرم بر لیتر 1- نفتالن استیک اسید با 5/0 میلی‌گرم بر لیتر تیدیازورون به‌دلیل استفادة

شکل 2- مقایسة درصد باززایی (A) و تولید برگساره (B) از کالوس والک در غلظت‌های مختلف تنظیم‌کنندة رشد نفتالن 3- استیک اسید (N) و ایندول 3- بوتیریک اسید (I) با تیدیازورون (T)- N1 و N2 به‌ترتیب نشان‌دهندة غلظت‌های 5/0 و 1 میلی‌گرم در لیتر نفتالن 3- استیک اسید، T1 و T2 به‌ترتیب نشان‌دهندة غلظت‌های 5/0 و 1 میلی‌گرم در لیتر تیدیازورون و I1 و I2 به‌ترتیب نشان‌دهندة غلظت‌های 5/0 و 1 میلی‌گرم در لیتر ایندول 3- بوتیریک اسید هستند. مقادیر، میانگین چهار تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة معنی‌داربودن میانگین‌ها در سطح 01/0P≤ براساس آزمون دانکن هستند.

کمتر از تنظیم‌کننده‌های رشد تیماری مناسب برای باززایی و تولید برگساره در والک است.

تأثیر تنظیم‌کنندة رشد و درصد ساکارز بر تولید سوخ در والک: نتایج تجزیة واریانس داده‌ها نشان دادند اثر متقابل ساکارز و تنظیم‌کنندة‌ رشد بر تولید سوخ در سطح 1 درصد معنی‌دار بود. نتایج مقایسة میانگین داده‌ها (شکل 3) نشان دادند بیشترین درصد تولید سوخ (100 درصد) متعلق به

شکل 3- مقایسة اثر متقابل ساکارز و تنظیم‌کنندة رشد آبسزیک اسید (ABA) بر تولید سوخ در والک- S1 و S2 به‌ترتیب نشان‌دهندة غلظت‌های 6 و 10 درصد ساکارز و A1 و A2 به‌ترتیب نشان‌دهندة به کار نبردن ABA و کاربرد آن هستند. مقادیر، میانگین چهار تکرار ± انحراف معیار هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة معنی‌داربودن میانگین‌ها در سطح 01/0P≤ براساس آزمون دانکن هستند.

محیط‌کشت حاوی 6 درصد ساکارز 6 درصد با 1 میلی‌گرم در لیتر آبسزیک اسید بود و کمترین آن (8/48 درصد) به محیط‌کشت حاوی 12 درصد ساکارز با 1 میلی‌گرم در لیتر آبسزیک اسید و نیز محیط‌کشت دارای 12 درصد ساکارز و بدون آبسزیک اسید تعلق داشت.

بررسی‌ها نشان داده‌اند ساکارز یکی از عوامل مؤثر بر تشکیل سوخ در شرایط درون شیشه است؛ به‌دلیل‌اینکه سوخ، اندامی ذخیره‌ای است. در موسیر گزارش شد افزایش غلظت ساکارز تا 60 گرم در لیتر، تولید سوخ را افزایش داد (Ghahremani et al., 2010). در آزمایش حاضر، تأثیر تنظیم‌کنندة رشد آبسزیک اسید در کنار استفاده از دو غلظت مختلف ساکارز بر والک بررسی شد. از آنجا که آبسزیک اسید، عامل ایجاد رکود در گیاه شناخته شده است و با کاهش رشد گیاه، امکان ذخیرة مواد غذایی و تولید سوخ افزایش می‌یابد، به‌کارگیری این تنظیم‌کنندة رشد در کنار 6 درصد ساکارز بیشترین تولید سوخ را سبب شد. در پژوهش‌های قبلی، رابطة سطح آبسزیک اسید با رکود و خواب گیاهان مختلف و تولید سوخ بررسی شده است (Djilianov et al., 1994; Kim et al., 1994; Lukaszewska et al., 1998). برای نمونه، نتایج پژوهشی بر لیلیوم نشان دادند استفاده از آبسزیک اسید افزایش تولید غده را در این گیاه باعث شد (Kim et al., 1994). در پژوهش حاضر نیز محیط‌کشت حاوی 60 گرم در لیتر ساکارز و یک میلی‌گرم بر لیتر آبسزیک اسید به بیشترین میزان تولید سوخ در والک منجر شد.

در‌نهایت، پس از کالوس‌زایی، باززایی، تولید برگساره و القای سوخ در برگساره‌ها، گیاهچه‌های سوخ‌دار والک تولید‌شده به گلدان منتقل و مراحل سازگارکردن بر آنها انجام شدند (شکل 4).

شکل 4-استفاده از تنظیم‌کننده‌های رشد برای کالوس‌زایی، باززایی، تولید برگساره و تولید سوخ در والک: کالوس‌زایی در محیط‌کشت حاوی 1/0 میلی‌گرم بر لیتر 1- نفتالن استیک اسید با 5/0 میلی‌گرم بر لیتر تیدیازورون (A)، باززایی گیاه در محیط‌کشت حاوی 1 میلی‌گرم بر لیتر 1- نفتالن استیک اسید با 1 میلی‌گرم بر لیتر تیدیازورون (B)، تولید برگساره در محیط‌کشت حاوی 5/0 میلی‌گرم بر لیتر 1- نفتالن استیک اسید با 5/0 میلی‌گرم بر لیتر تیدیازورون (C)، القای سوخ در محیط‌کشت حاوی ساکارز 6 درصد با 1 میلی‌گرم در لیتر آبسزیک اسید (D) و انتقال گیاهچه‌های تولید‌شده به گلدان برای سازگاری (E)