تأثیر سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات بر تولید رزمارینیک اسید و کافئیک اسید در کشت کالوس نوروزک (Salvia lerrifolia Benth.)

مقدمه

نوروزک (Salvia leriifolia Benth.) متعلق به خانوادة نعناعیان (Lamiaceae) و گیاهی چندساله، علفی است که برگ و گل‌های معطر دارد و ازجمله گیاهان باارزش مناطق کویری ایران ازجمله استان خراسان رضوی و سمنان است. این گیاه از جنس مریم گلی (Salvia) است که 900 گونة آن در سراسر جهان شناسایی شده‌اند و حدود 17 گونه از آنها بومی ایران هستند (Hedge, 1986). ترپنوئیدها، ساپونین‌ها، فلاونوئیدها، تانن‌ها و آلکالوئیدها از متابولیت‌های ثانویة باارزش موجود در گیاه نوروزک هستند (Tabatabai Yazdi, 1995) که از این مواد، کافئیک اسید و رزمارینیک اسید با خواص آنتی‌اکسیدانی در گروه فلاونوئیدها قرار دارند (Kahkonen et al., 1999). کافئیک اسید در گونه‌های مریم گلی، واحد سازندة انواع متابولیت‌های فنلی از مونومرهای ساده تا انواع فراورده‌های الیگومری است و رزمارینیک اسید فراوان‌ترین دایمرکافئیک اسید و مهم‌ترین ترکیب فنلی است که فعالیت آنتی‌اکسیدانی گونه‌های مریم‌گلی را بیشتر به‌علت وجود این ترکیب می‌دانند (Lu and Foo 2002; Kamatou et al., 2008). استفاده از کالوس‌های حاصل از کشت‌بافت گیاهی راهکاری مناسب برای تولید پایدار با کارایی زیاد و بدون وابستگی به فصول کشت گیاهی چنین متابولیت‌هایی است. تولید کالوس در شرایط درون‌شیشه‌ای متأثر از عواملی مانند ژنوتیپ، تنظیم‌کننده‌های رشد، محیط‌کشت، نوع کربوهیدرات، نوع جدا‌کشت و شرایط محیطی است (Han et al., 2011). Modarres و همکاران (2013، 2014) در گیاه نوروزک با جدا‌کشت برگ در محیط‌کشت MS حاوی 5 میلی‌گرم بر لیتر 6 - بنزیل آمینو پورین (BAP) با 5 میلی‌گرم بر لیتر 1 – نفتالن استیک اسید (NAA) و 1 میلی‌گرم بر لیتر Kin با 3 میلی‌گرم بر لیتر 2, 4-D و با جداکشت مریستم جوانة انتهایی حاوی 1 میلی‌گرم بر لیتر Kin با 2 میلی‌گرم بر لیتر 2, 4-D کالوس‌زایی مشاهده کردند. کاربرد الیسیتورهای غیرزیستی یکی از راهکارهای مهم برای القای متابولیسم ثانویه و افزایش تولید متابولیت‌های ارزشمند درمحیط‌های کشت‌بافت است.السیتورهای غیرزیستی با فعال‌کردن سازوکارهای دفاعی، تشکیل متابولیت‌های ثانویه و پاسخ‌های بیش حساس را القا می‌کنند. عوامل مختلفی مانند غلظت الیسیتور، سن محیط‌کشت، زمان افزودن الیسیتور به محیط‌کشت و مدتی که محیط یا جدا‌کشت در معرض الیسیتور قرار می‌گیرد بر افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه تأثیر می‌گذارد (Vasconsuelo and Boland, 2007). اﻟﻴﺴﻴﺘﻮرﻫﺎﻳﻲ مانند ﺳﺎﻟﻴﺴﻴﻠﻴﻚ اﺳﻴﺪ و ﻣﺘﻴﻞ ﺟﺎﺳﻤﻮﻧﺎت در افزایش تولید ﻣﺘﺎﺑﻮﻟﻴﺖﻫﺎی ﺛﺎﻧﻮیة دارای ارزش دارویی، نقش کلیدی دارند و با سرعت‌دادن به ﺗﺸﻜﻴﻞ ﻣﺘﺎﺑﻮﻟﻴﺖﻫﺎی ﺛﺎﻧﻮیه زﻣﺎن دست‌یابی را ﺑﻪ ﻣﻘﺎدﻳﺮ زیاد ﻣﺘﺎﺑﻮﻟﻴﺖ‌ها ﻛﺎﻫﺶ می‌دهند (Singh and Dwivedi, 2018). سالیسیلیک اسید در گیاه سیاه‌دانه فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمولیاز (PAL) و ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی (Kabiri et al., 2014)؛ در کشت سلولی پونه، مادة مؤثر بتاکاریوفیلن (Darvishi et al., 2017) و در گل همیشه‌بهار مقدار فلاونوئید را افزایش داد (Pacheco et al., 2013). Samadi و همکاران (2014) با کاربرد سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات به‌تنهایی و باهم در کالوس کنگرفرنگی مشاهده کردند متیل جاسمونات و سالیسیلیک اسید، افزایش فنیل پروپانوئید را سبب شد؛ ولی با افزایش غلظت الیسیتورها کاهش چشمگیری در مقدار فنل کل مشاهده شد. با‌توجه‌به‌اینکه گزارشی دربارة اثر اکسین 1 – نفتالن استیک اسید با سیتوکینین Kin در جدا‌کشت ساقه و برگ و 2, 4-D با سیتوکینین Kin در جدا‌کشت ساقه پس از بهینه‌کردن کالوس‌زایی وجود ندارد، اثر الیسیتورهای غیرزیستی سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات بر محتوای فنلی، فلاونوئیدی، رزمارینیک اسید و کافئیک اسید گیاه نوروزک بررسی شد.

مواد و روش‌ها

تهیة گیاهان استریل درون‌شیشه‌ای: این آزمایش در دانشکدة کشاورزی دانشگاه صنعتی شاهرود انجام شد. برای دست‌یابی به جداکشت‌های برگ و ساقة استریل، ابتدا بذرهای گیاه نوروزک از منطقة بجستان واقع در استان خراسان رضوی در خرداد‌ماه جمع‌آوری شدند. بذرها پس از انتقال به آزمایشگاه به‌مدت سه هفته در دمای 4 درجة سانتی‌گراد نگه‌داری شدند تا نیاز سرمایی برای جوانه‌زنی بذرها رفع شود. ضدعفونی‌کردن بذرها با روش Modarres و همکاران (2007) انجام شد. برای ضدعفونی‌کردن بذرهای نوروزک پس از جداکردن پوستة سخت آنها در زیر هود، ابتدا به‌مدت 30 ثانیه در الکل 70 درصد و سپس 3 دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم 3 درصد قرار داده شدند؛ سپس بذرها 3 بار با آب مقطر استریل آب‌شویی شدند و پوستة نازک بذرها با پنس و سوزن‌های استریل جدا شد. در این مرحله، رویان‌های چند‌میلی‌متری با پنس و سوزن‌های استریل، با دقت از داخل لپه‌ها جدا و در شیشه‌های کشت حاوی محیط‌کشت MS کشت داده شدند و به شرایط تاریکی به‌مدت یک هفته با دمای 2±25 درجة سانتی‌گراد انتقال داده شدند. پس از یک هفته جنین‌های با رشد اولیه به اتاق رشد با دورة نوری 16 ساعت روشنایی (40 میکرومول فوتون بر متر مربع بر ثانیه) و 8 ساعت تاریکی و دمای 2±25 درجة سانتی‌گراد انتقال یافتند و پس از 4 هفته گیاهان استریل نوروزک درون‌شیشه‌ای به دست آمدند.

تأثیر اکسین‌های 1 – نفتالن استیک اسید و 2, 4-D با Kin در کالوس‌زایی از جداکشت‌های ساقه و برگ: برای بهینه‌کردن کالوس‌زایی، چهار آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با پنج تکرار و در هر تکرار با پنج جدا‌کشت ساقه یا برگ در محیط‌کشت MS حاوی 30 گرم بر لیتر ساکارز انجام شدند. 1 – نفتالن استیک اسید با چهار غلظت (صفر، 1، 2 و 3 میلی‌گرم بر لیتر) و 2, 4-D با پنج غلظت (صفر، 1، 5/1، 2 و 5/2) با سه غلظت سیتوکینین Kin (صفر، 3/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) استفاده شد. از گیاهان نوروزک چهارهفته‌ای استریل، جدا‌کشت‌های ساقه و برگ 1 سانتی‌متری تهیه شدند. جدا‌کشت‌ها برای تولید کالوس در تاریکی با دمای 25±2 درجة سانتی‌گراد قرار داده شدند. پس از گذشت چهار هفته صفات مورفولوژیک کالوس‌ها اندازه‌گیری شدند.

اندازه‌گیری صفات مورفولوژیک کالوس‌ها: پس از گذشت 4 هفته (اوایل هفتة پنجم) ویژگی‌های ظاهری کالوس‌ها مانند درصد کالوس‌زایی، رنگ، شکل و نوع کالوس یادداشت‌‌برداری شدند. درصد کالوس‌زایی براساس نسبت تعداد جداکشت‌های دارای کالوس به تعداد کل جدا‌کشت‌های کشت‌شده در یک ظرف کشت به دست آمد. میانگین وزن آنها به‌صورت میانگین مجموع وزن تر بررسی شد. برای اندازه‌گیری وزن خشک، کالوس‌های مدنظر در ورق آلومینیومی بسته‌بندی شدند و به‌مدت 36 ساعت در آون با دمای 80 درجة سانتی‌گراد قرار داده شدند و درنهایت، وزن کالوس محاسبه شد.

القای الیسیتورهای سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات: پس از بهینه‌کردن کالوس‌زایی، برای بررسی اثر الیسیتورهای سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات (صفر، 50، 150 و 200 میکرومولار) آزمایشی به‌صورت طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار (هر تکرار با پنج جداکشت) انجام شد. با‌توجه‌به ناپایداری این دو ماده در دمای زیاد، پس از اتوکلاو‌کردن محیط‌کشت در زیر هود لامینار و در شرایط استریل، زمانی‌که دمای محیط‌کشت به حدود 45 درجة سانتی‌گراد رسید با فیلتر سلولزی 2/0 میکرون، استریل و به محیط‌کشت اضافه شدند. جدا‌کشت‌های تیمار‌شده به اتاقک رشد تاریک با همان شرایط نگهداری کالوس انتقال یافتند.

اندازه‌گیری فنل کل: سنجش فنل کل با روش فولین - سیوکالتیو انجام شد (Singleton and Rossi, 1965). ابتدا 5/0 گرم از کالوس‌های تازه در 3 میلی‌لیتر متانول 80 درصد همگن شد و به‌مدت 3 ساعت در بن ماری (مدلWNB 14، شرکت Memmert، آلمان) با دمای 70 درجة سانتی‌گراد قرار داده شد؛ سپس با سرعت 9000 دور در دقیقه به‌مدت 15 دقیقه (دو بار) سانتریفیوژ (مدل 5810R، شرکت Eppendorf، آلمان) و عصارة متانولی از رسوب جدا شد. این عصاره برای سنجش فنل کل و فلاونوئید استفاده شد. به 50 میکرولیتر عصارة متانولی، 500 میکرولیتر معرف فولین - سیوکالتیو اضافه شد. به مخلوط حاصل، پس از 5 دقیقه 500 میکرو‌لیتر محلول سدیم کربنات 7 درصد اضافه و جذب پس از 10 دقیقه با دستگاه اسپکتوفتومتر (مدل 2150، شرکت Unico، آمریکا) با طول‌موج 765 نانومتر خوانده شد . میزان ترکیبات فنلی برمبنای مقدار جذب ناشی از واکنش عصاره با معرف فولین - سیوکالتیو و براساس مقایسة آن با محلول‌های استاندارد گالیک اسید محاسبه شد. برای شاهد نیز به‌جای عصاره از متانول 80 درصد استفاده شد. آزمایش سه بار تکرار و میانگین آنها گزارش شد.

اندازه‌گیری فلاونوئید کل: سنجش فلاونوئید کل نیز براساس نمودار استاندارد Rutin سنجیده شد. به یک میلی‌لیتر از عصارة متانولی 251 میکرولیتر از محلول آلومینیوم کلرید 10 درصد و 250 میکرولیتر پتاسیم استات یک مولار اضافه و جذب نمونه‌ها در طول‌موج 415 نانومتر خوانده شد و مقدار فلاونوئید مطابق با رابطة به‌دست‌آمده از نمودار استاندارد محاسبه شد (Akkol et al., 2008).

اندازه‌گیری رزمارینیک اسید: عصاره‌گیری و سنجش رزمارینیک اسید با روش Tepe (2007) انجام شدند. در این روش 5/0 گرم کالوس تر پس از توزین، در 20 میلی‌لیتر اتانول 50 درصد به‌خوبی ساییده و به‌مدت یک ساعت در بن ماری 70 درجة سانتی‌گراد نگه‌داری شد. پس از آن با روتاری (شرکت دنا، ایران)، حلال اتانول از محلول حذف و باقی‌مانده‌های کالوس در 20 میلی‌لیتر اتانول 70 درصد حل شد. در این مرحله محلول به‌مدت 24 ساعت در فریزر 20- درجة سانتی‌گراد نگه‌داری شد. درنهایت، محلول برای فیلترشدن، دو مرتبه از کاغذ صافی واتمن شمارة 1 عبور داده شد و محلول صاف حاصل از آن تا زمان سنجش رزمارینیک اسید به یخچال با دمای 4 درجة سانتی‌گراد منتقل شد. برای سنجش، عصاره‌های گرفته‌شده درون سل‌های پلاستیکی سه میلی‌لیتری ریخته و جذب آنها در طول‌موج 327 نانومترخوانده شد. غلظت رزمارینیک اسید در هر نمونه با نمودار استاندارد رزمارینیک اسید برحسب میلی‌گرم بر گرم وزن تر محاسبه شد. برای شاهد از اتانول 70 درصد استفاده شد.

اندازه‌گیری کافئیک اسید: برای سنجش کافئیک اسید، روش Sauvestyو همکاران (1992) استفاده شد. نمونه‌ها روی یخ و با متانول 80 درصد با نسبت حجمی - وزنی 5/1 تا ایجاد یک محلول همگن ساییده شدند. همگنای حاصل به‌مدت سه ساعت در دمای 40 درجة سانتی‌گراد هم زده شد؛ سپس به‌مدت 45 دقیقه با سرعت 10000 دور در دقیقه سانتریفیوژ و از روشناور حاصل برای سنجش کافئیک اسید استفاده شد. 1 میلی‌لیتر از عصاره‌های متانولی 80 درصد برداشته و به آن 1 میلی‌لیتر معرف آرنو )سدیم مولیبدات 10 درصد و سدیم نیترات درصد)، 1 میلی‌لیتر سدیم هیدروکسید 1 مولار و 1 میلی‌لیتر هیدروکلریک اسید 1/0 مولار افزوده شد تا حجم نهایی به 10 میلی‌لیتر رسید؛ سپس نمونه‌ها ورتکس شدند و بلافاصله جذب آنها در 490 نانومتر خوانده شد. در نمونة شاهد به‌جای عصاره، 1 میلی‌لیتر متانول 80 درصد اضافه شد.

نتایج و بحث

اثر اکسین 1 – نفتالن استیک اسید با Kin در کالوس‌زایی با جداکشت ساقه و برگ: جدا‌کشت‌‌های ساقه و برگ گیاه نوروزک پس از چهار هفته در غلظت‌های مختلف 1 – نفتالن استیک اسید و Kin،کالوس‌زایی نشان ندادند. در گیاه S. nemoroza با جدا‌کشت برگ مطابق با نتایج این آزمایش کالوس‌زایی مشاهده نشد (Ewa and Halina, 2004)؛ درحالی‌که در S. canariensis با جداکشت ساقه در محیط حاوی 1 – نفتالن استیک اسید در ترکیب با 6 - بنزیل آمینو پورین کالوس‌زایی مشاهده شد (Mederos-Molin, 2004).

اثر اکسین  2, 4-Dبا Kin در کالوس‌زایی با جدا کشت‌های ساقه و برگ: نتایج محاسبة میزان کالوس‌زایی در ساقه در غلظت‌های مختلف Kin و 2, 4-D نشان دادند در غلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر 2, 4-D هیچ کالوس‌زایی مشاهده نشد؛ درحالی‌که بیشترین میزان کالوس‌زایی و وزن تر و خشک در تیمار 2 میلی‌گرم بر لیتر2, 4-D با 3/0 میلی‌گرم بر لیترKin به دست آمد. نتایج بافت کالوس‌ها هیچ تفاوتی بین تیمارها نشان ندادند و کالوس‌ها متراکم بودند؛ ولی رنگ کالوس‌ها در تیمار 1 و 3/0 میلی‌گرم بر لیتر Kin به‌ترتیب در غلظت‌های 5/1 و 2 میلی‌گرم بر لیتر 2, 4-D کرمی و در سایر تیمارها سفید بودند (جدول 1).

نتایج محاسبة میزان کالوس‌زایی در برگ در غلظت‌های مختلف Kin و 2, 4-D نشان دادند در غلظت 1 و 5/1 میلی‌گرم بر لیتر2, 4-D هیچ کالوس‌زایی مشاهده نشد. بیشترین میزان کالوس‌زایی و وزن تر و خشک در تیمار 2 میلی‌گرم بر لیتر2, 4-D با 1 میلی‌گرم بر لیترKin به دست آمد. در همة تیمارها کالوس‌های کرم‌رنگ و متراکم مشاهده شدند (جدول 2).

جدول1- مقایسة مقدار کالوس‌زایی و ویژگی‌های کالوس‌های حاصل از جداکشت‌های ساقه در محیط MS حاوی 2, 4-D و Kin

مقادیر، میانگین پنج تکرار (هر تکرار پنج جداکشت) ± SE هستند. حروف متفاوت بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار با آزمون LSD هستند.

در پژوهش حاضر، القای کالوس در ساقه و برگ گیاهان نوروزک 4 هفته‌ای (5 تا 6 برگی) حاصل از کشت رویان، انجام شد که با نتایج گزارش‌های قبلی در گونه‌های جنس Salvia هم‌راستا است (Kintzios et al., 1999; Mederos-Molina, 2004). در هر دو جدا‌کشت ساقه و برگ، القای کالوس در غلظت‌های زیاد 2, 4-D انجام شد و غلظت‌های کمتر از 2 میلی گرم بر لیتر در برگ تأثیری نداشتند؛ هرچند با جداکشت ساقه در غلظت 1 میلی‌گرم بر لیتر 2, 4-D کالوس‌زایی مشاهده شد. بیشترین میزان کالوس‌زایی در جدا‌کشت ساقه، 75 در صد و در برگ، 100 درصد بود که علاوه‌بر کالوس‌زایی فراوان در برگ، کالوس‌ها بزرگ‌تر و بهتر بودند. Mederos-Molina (2004) و Kintzios و همکاران (1999) نتایج مشابهی در گونة canariensis گزارش کردند. به‌طورکلی استفادة هم‌زمان از 2, 4-D و Kin با نسبت‌های زیاد 2, 4-D به Kin بر کالوس‌زایی در جداکشت های برگ گیاه نوروزک تأثیر بسزایی دارد پس نوع، غلظت اکسین و جداکشت بر کالوس‌زایی مؤثر هستند. به نظر می‌رسد شرایط محیطی انتخاب‌شده برای القا و رشد کالوس مناسب بوده‌اند؛ به‌طوری‌که کالوس‌ها بافت متراکم و رنگ سفید تا کرمی به

جدول 2- مقایسة مقدار کالوس‌زایی و ویژگی‌های کالوس‌های حاصل از جداکشت‌های ساقه در محیط MS حاوی 2, 4-D وKin

مقادیر، میانگین پنج تکرار (هر تکرار پنج جداکشت) ± SE هستند. حروف متفاوت بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار با آزمون LSD هستند.

دست آوردند. تفاوت در کارایی 2, 4-D نسبت به 1 – نفتالن استیک اسید در پژوهش حاضر ممکن است از یک‌سو به ساختار این ترکیبات و از سوی دیگر به تخصصی‌شدن گیرنده‌های اکسین در بافت‌‌های مختلف گیاهان برای نوع اکسین مربوط باشد که 2, 4-D ترکیبی فنوکسی است؛ درحالی‌که 1 – نفتالن استیک اسید ترکیبی نفتالینی است (Moore, 1989).

صفات مورفولوژیک کالوس‌های تیمارشده با الیسیتورها: نتایج به‌دست‌آمده از این آزمایش، نشان دادند الیسیتورهای سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات تأثیری بر میزان کالوس‌زایی نداشتند و در همة محیط‌ها 100 درصد کالوس‌زایی مشاهده شد. بررسی جداکشت‌ها نشان داد نخستین توده‌های کالوس، 10 روز پس از کشت ایجاد شدند و با روند افزایش دوره تا چهار هفته کالوس‌های بزرگ تشکیل شدند. رنگ کالوس‌ها با گذشت زمان از سبز به کرمی در حال تغییر بود که البته تغییر رنگ به کرمی در جدا‌کشت‌های تیمار‌شده با سالیسیلیک اسید کمتر و در تیمار متیل جاسمونات و شاهد بیشتر بودند. سالیسیلیک اسید از فعالیت آنزیم ACC سنتاز ممانعت می‌کند که به کاهش تولید اتیلن منجر می‌شود و به‌دنبال آن از تخریب کلروفیل در سلول‌ها جلوگیری می‌شود (Li et al., 1992). اثر کمتر متیل جاسمونات بر جلوگیری از تغییر رنگ کالوس نسبت به سالیسیلیک اسید ممکن است به‌علت محافظت‌کنندگی غیریکسان کلروفیل a و b و توانایی کمتر متیل جاسمونات در حفظ محتوای کلروفیل b باشد (Hanaka et al., 2015).

بیشترین وزن تر و خشک به‌ترتیب 167/4 و 2750/0 گرم در تیمار 100 میکرومولار متیل جاسمونات مشاهده شدند و کمترین وزن تر (83/1 گرم) در کالوس شاهد و کمترین وزن خشک (1643/0 گرم) در تیمار 50 میکرومولار متیل جاسمونات حاصل شد. وزن تر و خشک کالوس‌ها با افزایش غلظت سالیسیلیک اسید روند رو‌به‌افزایش داشتند (شکل 1). نتایج پژوهش حاضر با گزارش‌های قبلی مبنی بر ارتباط مستقیم بین سالیسیلیک اسید، تحریک سلول‌ها و فعالیت متابولیسم اولیه در کالوس روناس مطابقت دارند (Bulgakov et al., 2002). نوع ترکیب، غلظت سالیسیلیک اسید و گونة گیاه، تعیین‌کنندة وجود یا نبود ارتباط مستقیم بین غلظت‌های القا‌کنندگی و القای فعالیت‌های متابولیسمی اولیه هستند که به افزایش وزن سلول‌ها منجر می‌شوند (Namdeo, 2007). تیمارهای متیل جاسمونات 100 و 150 میکرو‌مولار نسبت به شاهد وزن تر و خشک کالوس‌ها را افزایش دادند. در کشت کالوس‌های رودندرون هندی، افزایش وزن تر و خشک کالوس با افزایش غلظت متیل جاسمونات همراه بود که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد (Suan See et al., 2011). برخی از بررسی‌ها نشان دادند استفاده از غلظت‌های زیاد جاسمونات اثر تحریک‌کنندگی و بازدارندگی بر رشد و فعالیت متابولیک گیاهان دارد و آثار بازدارندگی مشابه آبسزیک اسید و اتیلن از خود نشان می‌دهد که تأییدکنندة نتایج پژوهش حاضر در غلظت 150 میکرومولار متیل جاسمونات است (Swiatek et al., 2003 and Chong et al., 2005).

شکل 1- تاثیر سالیسیلیک اسید (SA) و متیل جاسمونات بر وزن تر(A)  و  وزن خشک  (B)کالوس برگ گیاه نوروزک. مقادیر، میانگین سه تکرار (هر تکرار پنج جدا کشت)± SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار  با استفاده از آزمون LSD است.

با‌توجه‌به شکل 2 بیشترین میزان فنل و فلاونوئید کل در کالوس‌های تیمارشده با غلظت 100 میکرو‌مولار متیل جاسمونات وکمترین میزان، در کالوس‌های شاهد مشاهده شد. محتوای فنل و فلاونوئید کل با افزایش غلظت سالیسیلیک اسید روند رو‌به‌افزایش نشان دادند؛ به‌طوری‌که این مقادیر در غلظت 150 میکرو‌مولار سالیسیلیک اسید به‌ترتیب حدود 5/3 و 2 برابر شاهد افزایش نشان دادند (شکل 2). افزایش محتوای فنل کل و فلاونوئید با تیمار سالیسیلیک اسید در پژوهش حاضر با نتایج بررسی‌های قبلی در شیرین‌بیان (Shabani and Ehsanpour, 2010)، گل همیشه‌بهار (Pacheco et al., 2013)، کنگر‌فرنگی (Samadi et al., 2014) و سیاه‌دانه (Kabiri et al., 2014) مطابقت دارد و با غلظت‌های متیل جاسمونات، با پژوهش‌های Samadi و همکاران (2014)، Mehrabani و همکاران (2013) و Kim و همکاران (2006) هم‌راستا است؛ زیرا چالکون سنتاز که پیش‌ساز فلاونوئیدها را تولید می‌کند با متیل جاسمونات القا می‌شود (Pinot et al., 1998).

شکل 2- تاثیر سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات بر فنل (A)وفلاونوئید کل (B)کالوس برگ گیاه نوروزک. مقادیر، میانگین سه تکرار (هر تکرار پنج جدا کشت)± SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار  با استفاده از آزمون LSD است

نتایج پژوهش حاضر نشان دادند مقدار کافئیک اسید در گیاه نوروزک به‌طور‌طبیعی بسیار ناچیز است؛ درحالی‌که با تیمار سالیسیلیک اسید افزایش چشمگیری نسبت به شاهد داشته است؛ ولی با افزایش غلظت، روند رو‌به‌کاهش داشته است و بیشترین کاهش، در غلظت 50 میکرو‌مولار مشاهده شد. نتایج مربوط به اثر متیل جاسمونات بر محتوای کافئیک اسید نشان دادند تنها غلظت 150 میکرو‌مولار متیل جاسمونات میزان کافئیک اسید را نسبت به شاهد افزایش داد (شکل 3-A). نتایج مقایسة میانگین اثر سالیسیلیک اسید بر محتوای رزمارینیک اسید نشان دادند با افزایش غلظت سالیسیلیک اسید، مقدار رزمارینیک اسید نیز روند رو‌به‌افزایش داشته است؛ به‌طوری‌که با غلظت 150 میکرومولار سالیسیلیک اسید، بیشترین میزان رزمارینیک اسید حاصل و کمترین میانگین در شاهد مشاهده شد. همة تیمارهای متیل جاسمونات نیز افزایش میزان رزمارینیک اسید را نسبت به شاهد سبب شدند؛ ولی نسبت به تیمارهای سالیسیلیک اسید تأثیر کمتری بر افزایش محتوای این ماده داشتند (شکل 3-B).

داده‌های حاصل از سنجش مقدار کافئیک اسید در پژوهش حاضر با نتایج گزارش‌های قبلی در کنگرفرنگی (Samadi et al., 2014) وگیاه  Salvia miltiorrhiza (Dong et al., 2010) هم‌راستا هستند. بسیاری از بررسی‌ها نشان می‌دهند افزودن سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات خارجی

شکل 3- تاثیر سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات بر کافئیک اسید  (A)و رزمارینیک اسید (B) کالوس برگ گیاه نوروزک. مقادیر، میانگین سه تکرار (هر تکرار پنج جدا کشت)± SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار  با استفاده از آزمون LSD است.