ارزیابی کارایی پیشبرهای مختلف (CaMV35s, E8, 2A11) با بیان موقت آنتی‌ژن سطحی هپاتیت ب (HBsAg) در گیاه گوجه‌فرنگی

استفاده از گیاهان برای تولید پروتئین‌ها و ترکیبات ارزشمند دارویی و صنعتی در سال‌های گذشته به یکی از فناوری‌های امیدبخش در صنعت زیست‌فناوری گیاهی تبدیل شده است. این فناوری که به کشاورزی مولکولی معروف است، در‌حال‌حاضر اهمیت زیادی در تولید انواع ترکیبات از جمله پروتئین‌های نوترکیب دارد. در سال 1986، هورمون رشد انسانی، نخستین پروتئین دارویی بود که در گیاهان تراریخت توتون تولید شد. مطالعات بعدی نشان داد که امکان تولید سایر پروتئین‌های ارزشمند مانند انواع آنتی‌بادی، واکسن‌ها، هورمون‌ها و تنظیم‌کننده‌های رشد انسانی و آنزیم‌های صنعتی در گیاهان وجود دارد. در ‌حال حاضر، برخی از محصولات فناوری کشاورزی مولکولی وارد بازار شده‌اند و بسیاری دیگر هم در مراحل ورود به بازار هستند (Glenz and Warzecha, 2006).

برای به بیشینه رساندن میزان بیان پروتئین‌های نوترکیب در گیاهان تراریخت عوامل مختلفی دخالت دارند که از آن جمله به ترجیح کدونی، بیان پایدار و کارای ژن خارجی و ... اشاره می‌کنیم. با وجود این، چگونگی، زمان و محل بیان ژن با مجموعه‌ای از ساز‌و‌کار‌های کنترلی تنظیم می‌شود. پیشبرها، انواعی از عوامل تنظیمی اصلی، نقش مهمی در بیان ژن دارند (He et al., 2008).

پیشبر عمومی ویروس موزائیک گل‌کلم (CaMV35S) پیشبر بسیار قدرتمندی برای بیان ژن‌های خارجی در سلول‌های گیاهی است؛ با وجود این، این پیشبر هیچ‌نوع ویژگی خاصی در بیان ژن ندارد؛ بنابراین، بیان ژن در زمان یا مکان ویژه انجام نمی‌شود. در تولید واکسن‌های نوترکیب در گیاهان تراریخت، بیان اندک ژن به کاهش ایمنی‌زایی واکسن و در نتیجه، ناکارایی سیستم حفاظتی یا تحمل ایمونولوژیک بدن انسان منجر می‌شود. یکی از مزایای اصلی هدفمندسازی بیان پروتئین‌های نوترکیب در میوه‌های گیاهان این است که بخش‌های خوراکی گیاه را می‌توان بدون پختن یا فراوری مصرف کرد؛ این موضوع، چنین بافت‌هایی را برای تولید واکسن مناسب می‌کند. در گوجه‌فرنگی، پیشبرهای مختلفی مانند E4، E8، PG و 2A11 که اختصاصی میوه هستند شناسایی شده است. این پیشبرها بیشتر برای تعیین نقش اتیلن در رسیدگی میوه‌ها بررسی شده‌اند. پیشبر E8 یکی از شناخته‌شده‌ترین پیشبرهای اختصاصی گیاه گوجه‌فرنگی است. در پژوهش‌های متعدد، از این پیشبر برای بیان اختصاصی ژن در میوه‌های گوجه‌فرنگی استفاده شده است(Sandhu et al., 2000; Krasnyaski et al., 2001; Mehta et al., 2002; Yakoby et al., 2006; (He et al., 2008. برخی محققان، پیشبر E11 را نیزبرای بیان هدفمند ژن در گوجه‌فرنگی استفاده کرده‌اند (Yin-Hua et al., 2006).

میوه‌های گوجه‌فرنگی، سیستم تولید عمومی در کشاورزی مولکولی به شمار می‌روند و برای تولید انواع آنتی‌بادی‌ها، واکسن‌ها و سایر پروتئین‌های دارویی استفاده می‌شوند. نخستین گزارش در این زمینه، تولید واکسن هاری در این گیاه است که میزان بیان آن بیش از 1 درصد پروتئین کل بوده است (McGarvey et al., (1995. سایر واکسن‌های تولید‌شده در گوجه‌فرنگی عبارتند از: زیر واحدهای کلراتوکسین ب (واکسن وبا) (Jani et al., 2002)، پروتئین F ویروس سینستیال تنفسی (Sandhu et al., 2000)، پس از آن هم واکسن هپاتیت E (Ma et al., 2003)، هپاتیت ب (Srinivas et al., 2008) و انتروتوکسین حساس به گرمای
E. coli (Walmsley et al., 2003). از مزایای گوجه‌فرنگی نسبت به سیب‌زمینی این است که برای مصرف نیاز به پختن ندارد؛ در‌حالی‌که مصرف خام سیب‌زمینی چندان مرسوم نیست و حرارت‌دهی و پختن آن، بیشتر آنتی‌ژن‌های تولید شده را از بین می‌برد (Fischer and Schillberg, 2004). بیان آنتی‌ژن سطحی هپاتیت ب (HBsAg) در گیاهان توتون (Mason et al., 1992)، سلول‌های توتون (Kumar et al., 2007)، کاهو (Pniewski et al., 2012)، هویج (Imani et al., 2002)، سیب‌زمینی(Richter et al., (2000، موز (Kumar et al., 2005) و گوجه‌فرنگی (Srinivas et al., 2008) گزارش شده است.

یکی از روش‌های بررسی کارایی پیشبرها در بیان ژن‌ها، استفاده از روش‌های بیان موقت با کمک آگرواینفیلتریشن است. این روش علاوه بر تحلیل پیشبرهای گیاهی و رونویسی در گیاهانی مانند برنج و توتون (Yang et al., 2000; Zhang et al., 2012)، در جداسازی ژن‌های مقاومت به بیماری در سیب‌زمینی (Bendahmane et al., 2000) و تحلیل کارکردی سایر ژن‌ها در گیاهان در مدت کوتاه چند روز استفاده شده است (Bertazzon et al., 2012; Leckie and Neal Stewart, 2011; Figueiredo et al., 2011; (Hoffmann et al., 2006. قدرت بیماری‌زایی Agrobacterium tumefacience و ویژگی‌های فیزیولوژیک گیاه بر کارایی بیان موقت ژن بسیار اثر‌گذار است (Wroblewski et al., 2005). نکتة شایان توجه این است که، روش بیان موقت ژن، بسیار ساده است؛ نیازمند تجهیزات گران قیمت نیست و این امکان را فراهم می‌کند که فعالیت ژن را درون بافت برگ به‌سرعت غربال‌گری کنیم (Faizal and Geelen, (2012. به‌علاوه، نشان داده شده است که از این روش می‌توان در سیستم‌های مختلف گیاهی مانند آرابیدوپسیس، توتون، گوجه‌فرنگی، سیب‌‌‌زمینی، انگور و رز استفاده کرد (Tsuda et al., 2012; Yasmin and Debener, 2010; Zottini et al., 2008; Koscianska et al., 2005; Bhaskar et al., 2009; (Kim et al., 2009.

در پژوهش حاضر، از ژن‌های سنتزی HBsAg بهینه‌‌سازی شده بر اساس توالی ترجیحی گیاه گوجه‌فرنگی استفاده شده است. با‌توجه به توالی ژنتیکی جدید ژن HBsAg، برای بررسی عملکرد ژن، لازم است کارایی آن با سیستم‌‌های بیان موقت کنترل‌شده با پیشبرهای اختصاصی بررسی شود. بدین منظور، ژن هپاتیت ب HBsAg کنترل‌شده با پیشبرهای اختصاصی میوة گوجه‌فرنگی (E8 و 2A11) و پیشبر دایمی CaMV35S در برگ و میوة گیاه گوجه‌فرنگی و همچنین برگ توتون بررسی شده است. پس از موفقیت عملکرد ژن، از این سازة ژنی برای بیان دایمی آن و تولید گیاهان تراریخت استفاده خواهد شد.

مواد و روش‌ها

همسانه‌سازی پیشبرهایE8و2A11:بذرهای گیاه گوجه‌فرنگی (Lycopersicon esculentum Mill) پس از شستشو، در گلدان‌های پلاستیکی در گلخانه کشت شدند. از برگ‌های جوان این گیاه در مرحلة 8 تا10 برگی برای استخراج DNA ژنومی استفاده شد (Dellaporta et al., 1983). DNA استخراج‌شده، الگوی جداسازی پیشبرهای E8 و 2A11، با روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) با آغازگرهای اختصاصی به کار گرفته شد. از دمای 94 درجة سانتیگراد برای واسرشت‌سازی اولیه به مدت 4 دقیقه استفاده شد. 35 چرخه برای PCR بدین صورت در نظر گرفته شد: واسرشت‌سازی (یک دقیقه در دمای 94 درجة سانتیگراد)؛ اتصال (یک دقیقه در دمای 63 درجة سانتیگراد برای 2A11 و 59 درجة سانتیگراد برای E8)؛ بسط (یک دقیقه در دمای 72 درجة سانتیگراد) و در پایان، 4 دقیقة اضافه برای بسط نهایی در 72 درجة سانتیگراد در نظر گرفته شد(Hooshyar et al., 2015) . توالی آغازگرهای اختصاصی برای این پیشبرها عبارتند از: F2A11: 5′-caagctttaaaaagtatagtcaatatttac-3 و R2A11: 5′-ggatccggttttggattaattgctaattgatg-3′ برای پیشبر 2A11 و FE8: 5′- aagcttctagaaatttcacgaaat-3′ و RE8: 5′- ggatccttcttttgcactgtgaatgat-3′ برای پیشبر E8. این آغازگرها بر اساس توالی ژنی موجود در پایگاه NCBI با شمارة دسترسی X13743.1 برای2A11 و AF515784 برای E8 با نرم افزار Oligo طراحی شدند.

پیشبرهای مد نظر پس از تعیین توالی، جایگزین پیشبر CaMV35S در ناقل دوگانة pBI121 شدند (Ahmadi et al., 2012; Ahmadi and Rahnama, 2013).

سنتز توالی‌های HBsAg:پس از یافتن توالی‌های آنتی‌ژن HBsAg از پایگاه NCBI، توالی‌های نوکلئوتیدی این ژن به‌طور اختصاصی برای گوجه‌فرنگی بهینه‌سازی شد؛ سپس توالی قطعات KOZAK و توالی SEKDEL برای افزایش بیان و هدف‌گیری در شبکة اندوپلاسمی به این مجموعه افزوده شد. علاوه بر آن، جایگاه‌های اختصاصی برای آنزیم‌های BamHI و SacI در ابتدا و انتهای توالی HBsAg اضافه شد (شکل 1). توالی‌های طراحی‌شده به طول حدود 720 جفت باز در شرکت Millgene (فرانسه) سنتز‌ و به‌صورت کلون‌شده در وکتورهای pMAT تحویل گرفته شد (شکل 1).

HBs-LY

gcgga tcc acc atg gaa aat att act tct gga ttt ctt gga cca ctt ctt gtt ttg caa gct gga tct ttt ttg ttg act agg att ctt act att cca caa agt ctt gat tct tgg tgg act tct ctt aat ttt ctt gga gga act act gtt tgt ctt ggt caa aat tct caa tct cca act tct aat cat tct cca act tct tgt cct cca act tgt cct ggt tat cgt tgg atg tgt ctt cgt cgt ttt att att ttt ctt ttt att ctt ctt ctt tgt ctt att ttt ttg ttg gtt ctt ctt gat tat caa ggt atg ttg cca gtt tgt cct ctt att cca gga tct tct act act agt act gga cca tgt aga act tgt act act cct gct caa gga act tct atg tat cca tct tgt tgt tgt act aaa cct tct gat gga aat tgt act tgt att cca att cca tct tct tgg gct ttt gga aaa ttt ctt tgg gaa tgg gct tct gct cgt ttt tct tgg ctt agt ttg ctt gtt cca ttt gtt caa tgg ttt gtt gga ctt tct cca act gtt tgg ctt tct gtt att tgg atg atg tgg tat tgg gga cca agt ctt tat agt att ttg agt cca ttt ttg cca ctt ttg cca att ttt ttt tgt ctt tgg gtt tat att tct gaa aaa gat gaa ctt taa gag ctc acc

شکل 1- توالی نوکلئوتیدی اصلاح شدة آنتی‌ژن HBsAg برای گیاهان گوجه‌فرنگی (HBs-LY) (بالا) و ناقل پلاسمیدی حاوی قطعة سنتز‌شده (پایین)

ساخت سازه‌‌هایpBI-E8HB، pBI-2A11HB، pBI-35SHB: برای ساخت سازه‌های بالا، ژن gus با ژن HBsAg در سازه‌های pBI-35SGus، pBI-E8Gus، pBI-2A11Gus جایگزین شد. بدین‌ منظور ژن gus با آنزیم‌های BamHI و SacI از سازه‌های بالا خارج و سپس قطعة 720 جفت بازی در همان جایگاه برشی وارد شد. همة سازه‌ها با روش هضم اختصاصی با آنزیم‌های برشی و همچنین PCR تایید شدند. سازه‌های نهایی با روش انجماد - ذوب به آگروباکتریوم
A. tumefacience LBA4404 منتقل شدند.

بیان موقت آنتی‌ژنHBsAgبا روش آگرواینفیلتریشن: Agrobacterium حاوی سازه‌های pBI-E8HB، pBI-2A11HB وpBI-35SHB  به‌طور جداگانه در محیط کشت LB حاوی آنتی‌بیوتیک کانامایسین به‌صورت شبانه در 28 درجة سانتیگراد کشت شدند. برای تلقیح، ابتدا نمونه‌های میوه و برگ گوجه‌فرنگی و برگ توتون در اندازه‌های کوچک برش زده شدند. نمونه‌ها در محیط کشت LB حاوی سویه‌های Agrobacterium (AM- محیط تلقیح 1) غوطه‌ور شدند. علاوه بر محیط کشت یاد‌شده، در آزمایشی دیگر ابتدا کشت شبانة Agrobacterium با سانتریفیوژ در دمای 4 درجة سانتیگراد به مدت 5 دقیقه در 4000 دور در دقیقه رسوب داده شدند. رسوب باکتریایی در محیط تلقیح (2/1 محیط MS)
(IM- محیط تلقیح 2) به حالت سوسپانسیون تبدیل شد و نمونه‌‌های گیاهی در این محیط هم تلقیح شدند؛ سپس مجموعة حاوی نمونه‌های گیاهی غوطه‌ور در سوسپانسیون باکتری برای نفوذ بهتر باکتری‌ها در بافت‌ها در دسیکاتور و در خلا به‌ مدت 15 دقیقه قرار گرفتند. این کار 3 بار انجام شد. نمونه‌ها در پتری‌دیش‌های استریل حاوی سه لایه کاغذ صافی منتقل شدند و به مدت 4 روز در تاریکی قرار گرفتند. نمونه‌های گیاهی آمادة ارزیابی بیان آنتی ژن HBsAg، در دمای 70- نگهداری شدند.

سنجش آنتی‌ژنHBsAg:نمونه‌های گیاهی تیمار‌شده با لیوفیلایزر (مدل FDB5502، شرکت Opran، کرة جنوبی) خشک و سپس در هاون ساییده شدند. برای استخراج پروتئین از نمونه‌های گیاهی، بافر استخراج پروتئین (0.05M NaHPO₄ pH 7.5, 0.15M NaCl, 1 mM EDTA, 0.3% Tween 20, and 4mM PMSF) به آن‌ها افزوده شد و به مدت یک شب در 4 درجة سانتیگراد قرار داده شدند. نمونه‌ها به مدت 20 دقیقه در دور 35000 سانتریفیوژ شدند. روشناور حاوی پروتئین، در آزمون الایزا استفاده شد.

آزمون الایزا براساس راهنمای موجود در کیت HBsAg ONE (شرکت DIA-PRO، ایتالیا) انجام شد. جذب نمونه‌ها با دستگاه الایزا (مدل SUNRISE، شرکت Tican، سوئیس) در طول موج 450 نانومتر اندازه‌گیری شد. در بررسی حاضر، میزان تولید آنتی‌ژن HBsAg براساس کنترل مثبت و منفی کیت الایزا محاسبه شد.

تحلیل آماری: همة آزمایش‌ها در سه تکرار انجام شد. تجزیه و تحلیل داده‌ها با نرم افزار SPSS انجام شد. همچنین مقایسة میانگین داده‌ها با آزمون دانکن در سطح احتمال 1 درصد انجام شد.

نتایج و بحث

پروتئین‌ها با اهداف مختلفی در پزشکی، صنایع و پژوهش‌ها استفاده می‌شوند؛ اما استخراج آن‌ها از منابع طبیعی اغلب مشکل و پرهزینه است. روش معمول در تولید پروتئین‌های دارویی از جمله واکسن‌ها در مقیاس صنعتی، مبتنی بر تخمیر میکروبی یا سیستم‌های کشت سلول‌های جانوری است؛ اما در دهة گذشته، گیاهان، سیستم بیانی جایگزین ارزان، ایمن و کارآمد، برای تولید پروتئین‌های نوترکیب معرفی شده‌اند. برای افزایش کارایی سیستم‌های بیانی مبتنی بر گیاهان، استفاده از پیشبرهای مناسب ژنی اهمیت زیادی دارند. ارزیابی این پیشبرها در سیستم بیانی موقت، روشی سریع و ارزان‌ قیمت است. از سوی دیگر، در‌حال‌حاضر سیستم بیان موقت، روشی جایگزین گیاهان تراریخت پایدار، برای تولید واکسن‌ها و سایر پروتئین‌های نوترکیب به شمار می‌رود (Chen et al., 2013; 2016). در پژوهش حاضر، برای بررسی کارایی سازة ژنی حاوی HBsAg و همچنین انتخاب یک پیشبر مناسب برای بیان آنتی‌ژن مربوط در گیاه گوجه‌فرنگی از روش آگرواینفیلتریشن استفاده شده است.

سازه‌های ژنی: ژن‌های سنتزی اصلاح شدة HBsAg برای گوجه‌فرنگی، با روش هضم آنزیمی با آنزیم‌های BamHI و‌SacI  از پلاسمیدهای pMA-T حاوی HBsAg جدا شد و در جایگاه‌های برشی مناسب خود در ناقل‌‌های دوگانة pBI121، pBIE8GUS و pBI2A11GUS آماده‌ شده در تحقیقات قبلی قرار گرفت(Ahmadi et al., 2012; Ahmadi and Rahnama, 2013). برای درستی همسانه‌سازی، سازه‌های جدید با روش‌های هضم آنزیمی و PCR با پرایمرهای اختصاصی تایید شدند (شکل‌های 2 و 3). سازه‌های جدید به‌ ترتیب با نام‌های pBI35SHB، pBIE8HB و pBI2A11HB معرفی شدند (شکل 4).

شکل 2- تایید سازه‌های pBI35SHB (A)، pBI2A11HB (B) و pBIE8HB (C) با هضم آنزیمی- 1) نشانگر مولکولی تعیین اندازة DNA (GeneRuler DNA Ladder)، 2) هضم آنزیمی با دو آنزیم BamHI و SacI، 3) هضم آنزیمی سازه با دو آنزیم HindIII و EcoRI، 4) هضم آنزیمی با دو آنزیم HindIII و BamHI

شکل 3- تایید سازه‌های پلاسمیدی مختلف با آزمون PCR با پرایمرهای اختصاصی HBsAg- 1) نشانگر مولکولی تعیین اندازة DNA (GeneRuler DNA Ladder)، 2) کنترل منفی آب، 3) کنترل مثبت (سازة pMA-T)، 4) pBIE8HB، 5) pBI2A11HB، 6) pBI35sHB

شکل 4- نقشة کلی سازه‌های ژنتیکی pBIE8HB، pBI2A11HB و pBI35SHB. RB و LB- به‌ترتیب ناحیة سرحد مرزی راست و چب،
P-nos- پیشبر نئوپالین سنتاز، nptII- ژن مقاومت به کانامایسین، T-nos- پایانبر نئوپالین سنتاز، (E8)(2A11)(35S)- محل یکی از پیشبرهای اختصاصی E8، 2A11 و CamV35S، HBsAg- زیر واحد کوچک آنتی‌ژن سطحی هپاتیت ب، HindIII، BamHI و EcoRI آنزیم‌های برشی

میزان بیانHBsAg:بررسی میزان بیان آنتی‌ژن پروتئینی HBsAg در بافت‌های مختلف گیاهی (برگ توتون، برگ گوجه‌فرنگی و میوة گوجه‌فرنگی) نشان داد که بیان این آنتی‌ژن، زمانی‌که با پیشبر CaMV35S کنترل شود، در همة بافت‌ها اتفاق می‌افتد (شکل 5). تفاوت معنی‌داری بین بافت‌های مختلف از نظر میزان بیان آنتی‌ژن HBsAg مشاهده نشد. این مشاهده با ویژگی غیر‌اختصاصی پیشبر CaMV35 مطابقت دارد. پیشبر CaMV35S یک پیشبر دایمی است که ژن‌های کنترل‌شده با آن در همة بافت‌ها و در همة وضعیت‌ها بیان می‌شوند (He et al., 2008).

شکل 5- میزان بیان آنتی‌ژن HBsAg کنترل‌شده با پیشبر CaMV35s در سازة ژنی pBI35SHB با آگرواینفیلتریشن در بافت‌ها و محیط‌های تلقیح مختلف- FT (میوة گوجه‌فرنگی)، LT (برگ گوجه‌فرنگی)، LN (برگ توتون)- AM (محیط تلقیح 1)، IM (محیط تلقیح 2)- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیر مشترک بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن است.

یکی از مزایای بیان هدفمند پروتئین‌ها در میوه‌ها این است که بخش‌های خوراکی گیاه را می‌توان بدون پختن یا با اندکی فراوری مصرف نمود؛ بنابراین چنین بافت‌هایی محل مناسب برای تولید واکسن‌ها هستند. یکی از راهکارهای هدفمند‌سازی بیان پروتئین، استفاده از پیشبرهای اختصاصی است. در پژوهش حاضر، دو پیشبر اختصاصی میوة گوجه‌فرنگی E8 و 2A11 برای بیان هدفمند آنتی‌ژن HBsAg بررسی شدند. نتایج نشان داد که هر دوی این پیشبرها بیان آنتی‌ژن هپاتیت ب را در میوه‌های گوجه‌فرنگی باعث می‌شوند (شکل‌های 6 و 7). از این نظر، کارایی بیان این دو پیشبر با پیشبر عمومی CaMV35S مشابه است. میزان بیان این آنتی‌ژن با دو پیشبر CaMV35S و E8 حدود 15/0 میکروگرم برگرم وزن تر میوه است. این مقدار با پیشبر 2A11 در یکی از محیط‌های تلقیح، حدود 18/0 میکروگرم بر گرم وزن تر است. همان‌گونه که در شکل‌های 6 و 7 مشاهده می‌شود، دو پیشبر E8 و 2A11 با‌وجود اختصاصی‌بودن، بیان آنتی‌ژن‌های HBsAg را در سایر بافت‌ها (مانند برگ گوجه‌فرنگی و برگ توتون) باعث شده‌اند، هر چند میزان بیان در برگ‌ها کمتر از میوه است. دو پیشبر E8 و 2A11 از پیشبرهای اختصاصی میوة گوجه‌فرنگی در مرحلة رسیدگی میوه هستند؛ به‌همین‌دلیل یکی از عواملی که فعال‌شدن این پیشبر را سبب می‌شود، هورمون اتیلن است (He et al., 2008). در پژوهش حاضر، از قطعات برش‌خوردة برگ گوجه‌فرنگی و توتون برای تحلیل‌ها استفاده شد. زخمی‌شدن برگ، تولید اتیلن را در بافت‌ها موجب می‌شود؛ بنابراین تولید اتیلن در برگ‌های برش‌خورده ممکن است یکی از عوامل القایی این پیشبرها و در‌ نتیجه بیان آنتی‌ژن مربوط، در بافت غیراختصاصی باشد.

شکل 6- میزان بیان آنتی‌ژن HBsAg کنترل‌شده با پیشبر E8 در سازة ژنی pBIE8HB با آگرواینفیلتریشن در بافت‌ها و محیط‌های تلقیح مختلف- FT (میوة گوجه‌فرنگی)، LT (برگ گوجه‌فرنگی)، LN (برگ توتون). AM (محیط تلقیح 1)، IM (محیط تلقیح 2)- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیر مشترک بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن است.

شکل 7- میزان بیان آنتی‌ژن HBsAg کنترل‌شده با پیشبر 2A11 در سازة ژنی pBI2A11HB با آگرواینفیلتریشن در بافت‌ها و محیط‌های تلقیح مختلف- FT (میوة گوجه‌فرنگی)، LT (برگ گوجه‌فرنگی)، LN (برگ توتون)- AM (محیط تلقیح 1)، IM (محیط تلقیح 2)- مقادیر، میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیر مشترک بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن است.