شناسایی باکتری‌های تحمل‌کنندۀ شوری از خاک‌های شور گلستان و بررسی برخی صفات فیزیولوژیک آنها

مقدمه.

باکتری‌ها و آرکی‌ها میکروارگانیسم‌های غالب در شوره‌زارها[1] هستند (1 و 2). سازگاری آنها می‌تواند به‌دلیل بالابودن فشار اسمزی، تجمع املاح آلی در سیتوپلاسم آنها و ایجاد تعادل اسمزی باشد. دریاچه‌های نمک، حوضچه‌های استخراج نمک، شورابه‌ها و خاک‌های بسیار شور و خشک، زیستگاه طبیعی باکتری‌ها و آرکی‌های نمک‌دوست هستند (1 و 3). این‌گونه میکروارگانیسم‌ها در چنین شرایط سخت طبیعی با تنش‌های فراوان ازجمله غلظت‌های بالای نمک، خشکی شدید و تابش نور فرابنفش خورشید مقابله می‌کنند و با تنظیم فشار اسمزی بقای خود را تضمین می‌کنند (4 و 5). در سال‌های اخیر، پتانسیل استفاده از این ارگانیسم‌ها در زمینه‌های مختلف بیوتکنولوژی دارویی، زیست‌پالایی، کودهای زیستی و غیره به‌شدت مورد توجه قرار گرفته است. پتانسیل بالای این ارگانیسم‌ها به‌دلیل خصوصیات منحصربه‌فرد، متابولیسم متفاوت و سازگاری آنها به شوری بالا است که سبب تسهیل در استفاده از آنها برای بسیاری از فرایندهای صنعتی می‌شود؛ برای مثال هنگام کار با آنها به استریلیزاسیون نیازی نیست. باکتری‌های اکسترموفیل (میکروارگانیسم‌هایی را که قادر به زندگی در زیستگاه‌هایی با دمای بالا و پایین، pH قلیایی و اسیدی، فشار هیدروستاتیک بالا و غلظت بالای نمک هستند) به‌جهت سازگاری با شرایط سخت زیستی به‌عنوان منابع ارزشمندی برای شناسایی و تخلیص آنزیم‌های مورداستفاده در صنایع مختلف مانند آمیلاز، پروتئاز، نوکلئاز، لیپاز، ایزومرازها و هیدرولازهای جدید که در غلظت‌های نمکی بالا پایداری خود را حفظ می‌کنند مطرح هستند (۱، 2و 5).

میکروارگانیسم‌های نمک‌دوست به‌دلیل مقدار بالای نمک در درون سلول، تعادل اسمزی ایجاد می‌کنند، گاهی غلظت نمک (به‌خصوص پتاسیم‌کلرید) در درون سلول ممکن است به 5 مولار هم برسد. پروتئین‌های هالوفیل‌ها به‌نحوی سازگار شده‌اند که برای پایداری و فعالیت مناسب به این میزان نمک نیاز دارند (3). هالوتولرانت‌ها طیف وسیعی از باکتری‌ها را تشکیل می‌دهند که در برابر نمک مقاوم هستند؛ بدین معنی که در حضور نمک و یا غیاب آن می‌توانند رشد و تکثیر داشته باشند. معمولاً این باکتری‌ها که روی مواد غذایی حاوی 5درصد یا بیشتر نمک می‌توانند رشد کنند، شامل بعضی از انواع Bacillus، Microcucus، Corynebacterium، Streptococcus و Clostridium هستند (5).

از راهکارهای نوین برای مقابله با تنش شوری در گیاهان و کاهش آثار زیان‌بار آن معرفی میکروارگانیسم‌های تحمل‌کنندۀ شوری است که بهبوددهندۀ رشد گیاه نیز هستند. گیاه‌پالایی (استفاده از گیاهان تحمل‌کنندۀ شوری) و یا اصلاح زیستی (با استفاده از میکروارگانیسم‌های تحمل‌کنندۀ شوری) برای اصلاح خاک‌های شور در مقیاس وسیع ازجملۀ این روش‌ها است (6 و 7). برخی از باکتری‌های جداسازی‌شده از مناطق شور شامل Flavobacterium, Azospirillum, Alcaligens, Acetobacterium و Pseudomonasاست. باکتری‌های نمک‌دوست و تحمل‌کنندۀ شوری در اطراف ریشۀ گیاهان می‌توانند آثار تنش شوری را کاهش دهند و حاصلخیزی خاک را بهبود ببخشند (2). باکتری‌های محرک رشد جداسازی‌شده از مناطق شور مقاومت به مقادیر بالای نمک را نشان می‌دهند و باعث افزایش مقاومت گیاه دربرابر تنش شوری اطریق هدایت هیدرولیکی، تجع اسمزی، ازبین‌بردن آثار سمی یون سدیم، حفظ هدایت اسمزی بالاتر و فتوسنتز بیشتر می‌شود (8). باکتری‌های ریزوسفری می‌توانند از افزایش غلظت اتیلن در گیاهان در هنگام بروز تنش جلوگیری کند و سبب کاهش آثار منفی این هورمون در رشد و توسعه اندامهای گیاهی به ویژه ریشه شوند. باکتری‌های محرک رشد می‌توانند ازطریق تولید آنزیم ACCدآمیناز (1- آمینوسیکلوپروپان 1-کربوکسیلات) میزان تولید اتیلن را تنظیم کنند. این آنزیم به‌صورت غیرمستقیم و عمدتاً ازطریق کاهش سطح اتیلن در گیاه باعث تداوم رشد گیاه می‌شود (9). همچنین باکتری‌های محرک رشد با مکانیسم‌های مختلفی همچون تثبیت نیتروژن مولکولی، انحلال فسفر نامحلول، تولید سیدروفور میکروبی، تولید هورمون‌های گیاهی ازقبیل اکسین‌ها، سیتوکینین‌ها، جیبرلین‌ها و کاهش غلظت اتیلن می‌توانند باعث افزایش رشد شوند (2 و 10). برای شناسایی و توصیف تکامل نژادی باکتری‌ها از تجزیه و تحلیل ژن 16SrRNA استفاده می‌شود. ژن‌های 16SrRNA برای زنده‌ماندن همۀ موجودات ضروری هستند و همچنین ردیف بازهای آلی در این ژن‌ها به‌شدت محافظت می‌شود. به همین دلیل تعیین ردیف بازهای آلی ژن 16SrRNA به‌عنوان یک روش استاندارد برای شناسایی گونه‌ها، جنس‌ها و باکتری‌ها به کار می‌رود. اخیراً ردیف بازهای آلی فقط در بخش کوچکی از ژن 16SrRNA برای تشخیص باکتری‌های در سطح جنس یا سطوح بالاتر استفاده می‌شود. از جمله اهداف موردنظر در پژوهش پیش رو جداسازی و شناسایی باکتری‌های محرک رشد تحمل‌کنندۀ شوری، و بررسی مقاومت به خشکی، حرارت و اسیدیتۀ محیط در این باکتری‌ها است.

‏‏مواد و روش‏ها.

نمونه‌برداری خاک: نمونه‌گیری از عمق 30سانتی‌متری خاک چهار منطقۀ بیابانی از بیابان‌های شور استان گلستان (اینچه برون، آق قلا، گمیشان و سیمین شهر) در مهرماه 1392 صورت گرفت. نمونه‌های خاک در داخل کیسه‌های نایلونی قرار گرفتند و برای به‌حداقل‌رسیدن تبخیر به آزمایشگاه میکروبیولوژی پژوهشکده ژنتیک و زیست‌فناوری کشاورزی طبرستان منتقل گردیدند و در دمای 4 درجه سانتیگراد (یخچال) نگهداری شدند.

جداسازی باکتری‌ها: برای جداسازی باکتری‌ها یک گرم از نمونۀ خاک در 9 میلی‌لیتر از محلول نمکی استاندارد (85/0درصد نمک طعام) حل شد و به‌مدت یک ساعت روی شیکرانکوباتور با دور 100 دور در دقیقه قرار گرفت و تا رقت^11-10رقیق شد. 60 میکرولیتر از سوسپانسیون خاک روی چند محیط کشت پخش و در دمای 2 ± 30 درجه سلسیوس به‌مدت 24 ساعت انکوبه شد. کلونی‌هایی که مورفولوژی متفاوتی داشتند، انتخاب شدند و با کشت متوالی خالص‌سازی و برای مطالعات بیشتر در دمای4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. در این آزمایش از محیط‌های کشت (جدول 1) برای باکتری‌های تحمل‌کنندۀ شوری برای جداسازی باکتری‌ها استفاده شد.

جدول 1- نام محیط کشت و ترکیبات آنها

مقاومت به شوری: برای بررسی میزان مقاومت به شوری جدایه‌ها، آنها در محیط کشت مایع نوترینت براث با غلظت‌های بدون شوری (شاهد)، 5، 10، 15، 20، 25، 35 و 40درصد کلریدسدیم کشت داده شدند. میزان رشد جدایه‌ها (با اندازه‌گیری چگالی نوری در 660 نانومتر) اندازه‌گیری شدند.

مقاومت به خشکی: محیط کشت مایع با پتانسیل‌های مختلف (50/0 ، 15/0-، 03/0-، 49/0-، و 73/0- مگاپاسکال) با اضافه‌کردن غلظت‌های مناسب از پلی‌اتیلن‌گلیکول (PEG 6000) تهیه و با 1/0 میلی‌لیتر از کشت مایع باکتریایی تلقیح شدند. از هر غلظت سه تکرار تهیه شد؛ سپس در دمای 2 ± 30 درجه سلسیوس و با 120 دور در دقیقه به‌مدت 24 ساعت انکوبه شدند. رشد باکتری‌ها با اندازه‌گیری چگالی نوری در 600 نانومتر با دستگاه اسپکتوفتومتر اندازه‌گیری شد (11).

مقاومت به pH بالا: باکتری‌ها در محیط کشت مایع نوترینت براث با pHهای مختلف 5، 5/5، 6، 5/6، 7، 5/7، 9 و 10 کشت داده شدند. باکتری‌ها به‌مدت 24 ساعت در دمای 2 ± 30 درجه سلسیوس قرار داده شدند؛ سپس جذب نوری محیط حاوی باکتری‌ها در طول‌موج 600 نانومتر خوانده شد (12).

مقاومت به درجه حرارت: به‌منظور بررسی اثر تنش حرارتی یک لوپ از کشت تازه باکتری در لوله‌های 30میلی‌لیتری حاوی 10 میلی‌لیتر نوترینت براث تلقیح و به‌مدت 8 ساعت در شیکر انکوباتور قرار داده شد تا جمعیت باکتریایی به  cfu/ml10⁸ ×2 برسد. لوله‌های کشت‌شده را به‌مدت 24 ساعت در دمای 50 درجه سلسیوس قرار داده و سپس جذب نوری آنها در 600 نانومتر خوانده شد (3).

تخمین کمی ایندول3- استیک‌اسید (IAA): برآورد میزان اکسین با روش بریک و همکاران (1991) و با استفاده از اسپکتروفتومتری انجام شد. نمونه‌های باکتری که به‌مدت 72 ساعت در محیط کشت نوترینت برات همراه با ال-تریپتوفان (500 میکروگرم در میلی‌لیتر) و 2درصد نمک طعام در30 درجه سانتیگراد رشد کرد و با معرف سالکوسکی[2] (50 میلی لیتر، 35درصد از اسیدپرکلریک، 1 میلی‌لیتر 5/0 مولار محلول FeCl₃) به نسبت 1:1 مخلوط شدند. تولید اکسین به‌صورت درجاتی از رنگ صورتی نشان داده می‌شود و چگالی نوری آن، در 530 نانومتر خوانده شد. غلظت اکسین تولیدشده با تهیۀ منحنی استاندارد از اکسین در محدودۀ 10 تا100 میکروگرم در میلی‌لیتر برآورد شد (13).

حلالیتفسفات: برای شناسایی قدرت حل‌کنندگی فسفات باکتری‌ها، هر جدایه به‌طور جداگانه روی محیط کشت جامد پیکوفسکی (PKV) حاوی 10 گرم گلوگز، 5 گرم تری‌کلسیم‌فسفات، 5/0 گرم عصارۀ مخمر، 5/0 گرم سولفات آمونیوم، 2/0 گرم کلرید پتاسیم، 2/0 گرم کلرید سدیم، 1/0گرم سولفات منیزیم، 0003/0گرم سولفات آهن، 0003/0گرم سولفات منگنز و 10 گرم آگار در لیتر با اسیدیتۀ ثابت 7 (محیط کشت جامد) کشت شد و پتری‌ها در دمای 2±30 درجه سانتیگراد به‌مدت 5 روز نگهداری شدند. برای شناسایی قدرت حل‌کنندگی فسفات از خصوصیت شفاف‌سازی محیط پیرامون کلنی استفاده شد (3)؛ سپس هر جدایه به‌صورت جداگانه در محیط کشت مایع پیکوفسکی به‌مدت 100 ساعت (با سرعت 100 دور در دقیقه) و در دمای 2±30 درجه سانتیگراد کشت داده شد. در پایان، 2 میلی‌لیتر محیط کشت از هر فالکون برداشته و به ویال‌های 2میلی‌لیتری انتقال داده شد. سپس برای حذف باکتری و مواد جامد موجود در محیط کشت، ویال‌ها به‌مدت 10 دقیقه در 12000 دور در دقیقه و در دمای 25 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد و محلول رویی شفاف هر ویال به ویال‌های جدید منتقل گردید (14 و15). درنهایت فسفر قابل‌استفاده با روش پیشنهادشده توسط واتانابی و السن[3] (14) اندازه‌گیری شد.

سیدروفور: اندازه‌گیری سیدروفور تولیدشده توسط باکتری‌ها با استفاده از روش کاس شاتل[4] (16) صورت گرفت. باکتری‌های کشت‌شده در محیط حداقل آهن و در دمای (2±30) درجه سلسیوس کشت شدند؛ سپس به‌مدت 15 دقیقه در 27000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. محلول کاس به مایع رویی کشت به نسبت مساوی اضافه و به‌مدت 20 دقیقه انکوبه شد. در صورت وجود سیدروفور، آهن از ترکیب رنگی حذف و باعث کاهش در شدت رنگ آبی می‌شود. شدت رنگ توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در 630 نانومتر خوانده می‌شود. برای اندازه‌گیری میزان سیدروفور، محیط حداقل به‌عنوان شاهد استفاده شد و درصد سیدروفور با استفاده از فرمول [(Ar–As)٫Ar] × 100 محاسبه شد که در آن، به Ar = جذب مرجع (محیط حداقل + محلول تولیدشده به‌روش کاس)، As= جذب نمونه است. (16).

اندازه‌گیری میزان اسیدسیانیدریک(HCN) : بررسی تولید HCN، به‌روش نمک الی یا معدنی اسیدپیکریک (10) انجام شد. باکتری‌ها در محیط کشت نوترینت براث حاوی 4/4درصد گرم گلیسین کشت داده شدند؛ سپس کاغذ صافی (واتمن شماره 1) آغشته به محلول 2درصد کربنات سدیم و 0/5درصد اسیدپیکریک روی محیط کشت قرار داده شد و در انکوباتور با دمای 2± 28 درجه سانتیگراد به‌مدت 96 ساعت قرار گرفتند. تولید HCN توسط تغییر رنگ کاغذ صافی از زرد تا نارنجی قهوه‌ای نشان داده می‌شود (17).

بررسی مولکولی: استخراج DNA به‌روش فنل-کلروفرم انجام گرفت (3) به‌منظور انجام واکنش PCR و تکثیر ژن 16SrDNA با طول bp 1500، از پرایمرهای 27F, 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′ و 1525R, 5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′ استفاده شد (12). هر واکنش 25میکرولیتری شامل 10 میکرولیترPCR Master Mixes kit (Thermo Scientific, USA)، 50 نانوگرم DNA و pmol20 از هر پرایمر بود. شرایط PCR شامل دمای واسرشت‌سازی 94 درجه به‌مدت 5 دقیقه، به‌همراه 35 سیکل حرارتی با دمای 94 درجه به‌مدت یک دقیقه، 58 درجه به‌مدت 90 ثانیه و 72 درجه به‌مدت 2 دقیقه و تکثیر نهایی در 72 درجه به‌مدت 10 دقیقه بود. به‌منظور خالص‌سازی محصولPCR از روی ژل آگارز (یک‌درصد) بریده و توسط کیت خالص‌سازی (MN آلمان) خالص شد و توالی‌یابی توسط شرکت Bioneer کره جنوبی انجام گرفت.

بررسی‌های بیوانفورماتیکی: توالی ژن16SrDNA باکتری‌های موردنظر که مشابه با توالی‌های 16SrDNA سایر باکتری‌ها در بانک ژنی GenBank/EMBL/DDBJ بودند ازطریق برنامۀ BLASTN مقایسه و با نرم‌افزارMEGA6 هم‌ردیف[5] شدند. آنالیز فیلوژنی و رسم درخت فیلوژنتیک براساس الگوریتم Neighbor-joining phylogeny انجام شد (18).

نتایج.

خالص‌سازی باکتری‌ها: از مناطق نمونه‌گیری‌شده با شوری 40 دسی‌زیمنس بر متر 45 جدایه، جداسازی و خالص‌سازی شد. از میان این جدایه‌ها، 30 جدایه توانایی تحمل 5درصد شوری، 10جدایه توانایی تحمل 7/0- مگاپاسکال، 15 جدایه توانایی تحمل دمای 50 درجه و 10 pH= را داشتند. 10 جدایه هم تا حدودی مقاومت به هر چهار تنش را نشان دادند. سه جدایۀ G14، G6 و G3 بالاترین میزان مقاومت به تنش‌های غیرزیستی (شوری، خشکی و pH) را نشان دادند. جدایۀ G14 وG6 در دمای 50 درجه سانتیگراد، 10pH=، پتانسیل اسمزی 7/0- مگاپاسکال و شوری 40درصد مقاومت داشتند. بهترین رشد G6 در شوری 10-25درصد G14 در شوری 10-30درصد مشاهده شد (شکل 2 و 3)؛ درحالی‌که جدایۀ G3 در 30 درصد شوری، دمای 50 درجه، 5/7pH= و پتانسیل اسمزی 49/0- را تحمل کرد و بهینۀ رشد این جدایه در شوری 10درصد مشاهده شد (شکل 1، 2 و3). ارزیابی سه جدایه برای حل‌کنندگی فسفات، تولید اکسین، اسیدسیانیدریک و تولید سیدروفور انجام شد. نتایج نشان داد از بین سه جدایه، جدایه‌های G6 و G3 به‌ترتیب دارای قدرت حل‌کنندگی فسفات به‌میزان 301 و 201 میلی‌گرم بر لیتر بودند. جدایۀ G6 قادر به تولید 7/20  میکروگرم بر میلی‌لیتر اکسین پس از 72 ساعت انکوباسیون بود؛ هیچ‌کدام از جدایه‌ها HCN و سیدروفور تولید نکردند (جدول 2).

شکل 1- رشد جدایه‌های G14 ,G6 و G3 در محیط کشت مایع و نوترینت براث حاوی درصدهای متفاوت نمک (نشان‌داده‌شده در نمودار). رشد باکتری‌ها با OD 660 nm نشان داده شده است.

شکل 2- رشد جدایه‌های G14 ,G6 و G3 در محیط کشت حاوی غلظت‌های مختلف پلی‌اتیلن‌گلیکول در پتانسیل‌های (05/0-، 3/0-، 49/0- و 73/0- مگاپاسکال). رشد باکتری‌ها با OD 600 nm نشان داده شده است.

شکل 3- اثر pH ها (نمودار راست) و دماهای مختلف (نمودار چپ) بر رشد باکتری‌هایG14 ,G6 و G3 رشد باکتری‌ها با OD 600 nm نشان داده شده است.

جدول2- صفات فیزیولوژیکی در جدایه‌های جداسازی‌شده

+، وجود صفت و -، نبودِ صفت

شناسایی جدایه‌ها: تطابق چندگانۀ (Multiple alignment) توالی 16SrDNA باکتری موردنظر با سایر توالی‌های 16SrDNA موجود در بانک ژنی NCBI نشان داد که باکتری G14و G6 با 99 و 9/99درصد شباهت متعلق به Bacillus subtillis و باکتریG3 با 99درصد شباهت متعلق به reactansPesudumonas است(4) (شکل 4).