زیست‌سنتز نانومیله‌های اکسید روی به‌وسیلۀ باکتری زانتوموناس‌کمپستریس

مقدمه.

 پیشرفت‌های اخیر در عرصۀ نانو تکنولوژی، توانایی پژوهشگر را برای ساخت نانوذرات مختلف از جمله نانوذرات فلزی و اکسید فلزی افزایش داده است. با بهره‌گیری از دانش روز می‌توان نانوذرات مهم در علوم پایه‌ای و کاربردی را، در اندازۀ موردنظر و شکل مناسب برای استفاده در محصولات صنعتی تولید کرد. در میان نیمه‌رساناهای اکسید فلزی، نانوذرات اکسید روی توجه عمیقی را به‌دلیل ویژگی‌های منحصربه‌فردی مثل گاف نواری پهن مستقیم[1] (3.37 الکترون ولت) و انرژی پیوند اکسایتونی بالا[2](60 میلی الکترون ولت) به خود جلب کرده‌اند که سبب شده تا پژوهشگران از خواص این ماده در کاربردهایی نظیر مواد پیزوالکتریک، سلول‌های خورشیدی و حسگرهای فتونیک استفاده کنند (۱ و ۲).

 در میان نانوساختارهای مختلف اکسید روی، نانوبلورهای یک‌بعدی به‌خصوص نانومیله‌های اکسید روی محبوبیت زیادی در زمینۀ علم به‌دلیل خواص و کاربردهای متنوع کسب کرده‌اند؛ ازجملۀ این خواص و کاربردها این موارد است: فعالیت‌های کاتالیزوری (3)، سلول‌های خورشیدی (4)، تصفیۀ فاضلاب، پردازش لاستیک (5)، جذب گاز هیدروژن سولفید (6)، سنسورها، استفاده در مواد آرایشی و بهداشتی به‌ویژه در کرم‌های سوختگی و ضدآفتاب به‌دلیل جذب کار آمد امواج uv – A و uv – B (5)، فعالیت فتو کاتولیستی (7)، استفاده در صنعت نساجی (8)،کامپوزیت‌ها (9)، صنایع غذایی(10)، مواد آنتی‌باکتریال و مواد ضدقارچ (3 و 11)، سیستم رهایش دارو به‌ویژه داروی درمان سرطان (7 و 12) و استفاده در سیمان‌های دندانی (13).

تاکنون روش‌های فیزیکی و شیمیایی زیادی مانند روش سنتز هیدروترمال، روش سل ژل، روش تجزیۀ حرارتی، روش شیمیایی مرطوب، روش اسپری پیرولیز، روش میکرو امولسیون، روش رسوبگذاری پالس لیزری، روش رسوب شیمیایی فاز بخار (CVD)[3] و روش میکروامولسیون برای تولید نانوذرات اکسید روی استفاده شده است. این روش‌ها اغلب شامل فرایند نسبتاً مشکل، حرارت بالا، همراه با استفاده از مواد شیمیایی پرهزینه به‌عنوان سورفکتانت، عوامل پوشاننده و تثبیت‌کننده به‌منظور بهبود شکل و فاز کریستالی هستند (11، 2، 1 و 14). این پیش‌ماده‌های سنتز نانوذرات، غالباً بر سطح ذرات باقی می‌مانند و ایجاد سمیت می‌کنند. با توجه به کاربردهای نانوذرات اکسید روی در بسیاری صنایع، به‌دست‌آوردن نانوذراتی که سازگاری بیشتری با محیط زیست و انسان داشته باشند، مد نظر قرار گرفت (5،10 و 11).

سنتز زیستی یا سنتز سبز نانوذرات یک فرایند دوستدار محیط زیست در زمینۀ شیمی و تکنولوژی زیستی است که به‌صورت فزاینده‌ای محبوبیت یافته و می‌تواند به‌عنوان یک راه حل در رابطه با مشکلات جهانی آلودگی و سمیت در نظر گرفته شود. برای سنتز نانوذرات تاکنون پژوهش‌های زیادی مبنی بر سنتز زیستی با استفاده از عصارۀ گیاهان (15 و 16)، عصارۀ میوه (17)، جلبک‌ها (18)، آنزیم (19)، سیانو باکتر (5) ، قارچ‌ها (10، 20 و21) و باکتری ها(7، 22 و23)گزارش شده است.

 تولید نانوذرات اکسید روی در سال‌های اخیر، در اندازه‌های متفاوت با سویه‌های مختلف قارچ و باکتری مورد توجه قرار گرفته است. در سال 2013 سلوارجان[4] به‌همراه همکارانش، به‌وسیلۀ باکتری لاکتوباسیلوس‌پلانتاروم نانوذرات اکسید روی در اندازه‌های بسیار کوچک 9-7 نانومتر تولید کردند (23). سویه‌های مختلف قارچ آسپرژیلوس نیز در چند سال اخیر برای سنتز نانوذرات اکسید روی در گسترۀ اندازۀ 14-2/1 نانومتر استفاده شده‌اند(11، 20 و 24). در سال 2013 پژوهشگر ایرانی، آشنگرف[5] موفق به سنتز خارج سلولی نانوذرات اکسیدروی در اشکال کروی با اندازه‌ای حدود 32 نانومترتوسط سویۀ قارچی آسپرژیلوس‌نایجر شد (21).

 استفاده از میکروارگانیسم‌ها به‌عنوان عوامل کاهش‌دهنده و پوشاننده با توجه به مزایایی همچون سادگی، سهولت رشد، دردسترس‌بودن، انعطاف‌پذیری نسبت به شرایط دمایی و pH و تنوع متابولیکی بالا، موجب می‌شود تا سنتز زیستی روشی قابلِ‌اعتماد و کارآمد در این زمینه باشد. هرچند سنتز زیستی نانوذرۀ اکسید روی در دهۀ اخیر بارها انجام شده، مکانیسم دقیق سنتز هنوز هم بررسی می‌شود و یافتن گونۀ میکروبی مناسب که قادر به سنتز کافی نانوذرات در سایزهای مختلف و اشکال متفاوت همراه با بازده بالا باشد، هنوز هم یک چالش محسوب می‌شود (7 و 25).

 باتوجه به اهمیت روزافزون توسعۀ روش‌های جدید و سازگار با محیط زیست در تولید نانومواد، سنتز زیستی نانومیله‌های اکسید روی با استفاده از باکتری گرم‌منفی زانتوموناس‌کمپستریس[6] در این پژوهش برای نخستین بار گزارش می‌شود. باکتری زانتوموناس‌کمپستریس یک پاتوژن گیاهی است؛ ولی در صنعت به‌دلیل تولید صمغ زانتان بسیار مورد توجه قرار گرفته است. صمغ زانتان یک پلی‌ساکارید مهم است که در صنایع غذایی و بهداشتی کاربرد بسیار دارد (26). تولید نانومیله‌های اکسید روی به‌وسیلۀ باکتری زانتوموناس‌کمپستریس یک روش ساده، کم‌هزینه، مطمئن و سازگار با محیط زیست است.

‏‏مواد و روش‏ها.

مواد شیمیایی و میکروارگانیسم: در این پژوهش از باکتری زانتوموناس‌کمپستریس1473 PTCC خریداری شده از بانک میکروبی ایران برای سنتز استفاده شد. از مواد شیمیایی نیترات روی 6 آبه، گلوگز و سود ساخت شرکت مرک و پپتون، عصارۀ مخمر و نوترنیت براث شرکت کیولب استفاده شد. برای رشد باکتری از محیط کشت سادۀ YEDP[7] با ترکیب 2درصد گلوکز، 2درصد پپتون و 1درصد عصارۀ مخمر استفاده شد. در تمام مراحل برای ساخت محیط کشت و محلول‌ها و شستشو از آب دی‌یونیزه استفاده شد.

سنتز نانوذرۀاکسید روی:  ابتدا 50 میلی‌لیتر محیط کشت مایع YEDP ساخته شده و در اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتیگراد به‌مدت 15 دقیقه استریل می‌شود، از پلیت‌های کشت جامد خالص، چند کلونی زانتوموناس‌کمپستریس به محیط کشت مایع YEDP تلقیح شده و سپس به‌مدت 24 ساعت محیط کشت در شیکرانکوباتور در دمای 28 درجه سانتیگراد و چرخش 130 دور در دقیقه قرار داده می‌شود تا باکتری مورد نظر کاملاً رشد کند. pH محیط کشت بعد از رشد به 5/5 می‌رسد؛ سپس محیط کشت بانوترینت براث 4 مرتبه رقیق‌سازی می‌شود و برای رشد بیشتر باکتری، محیط کشت به‌مدت 24 ساعت دیگر در شیکر انکوباتور قرار داده می‌شود. دانسیته نوری محیط کشت باکتری رشدکرده، به‌وسیلۀ دستگاه اسپکتروفتومتر(CHROMTECH UV-VIS ساخت کشور تایوان) در طول موج 600 نانومتر، حدود 3/0 اندازه‌گیری شد. بعد از گرمخانه‌گذاری، pH به‌وسیلۀ سود 4/0 مولار روی 7 تنظیم می‌شود. دانستن pH مخلوط واکنش مهم است؛ چرا که نقش مهمی در پروسۀ سنتز وکنترل شکل و اندازۀ نانوذرات ایفا می‌کند (5 و 23). 10 میلی‌لیتر محلول نیترات روی 1/0 مولار تهیه و استریل می‌شود؛ سپس به50 میلی‌لیتر محیط کشت باکتری اضافه می‌گردد. محلول حاصل در حمام آب گرم  80 درجه سانتیگراد به‌مدت 10 – 5 دقیقه حرارت داده می‌شود، در طی حرارت‌دادن رسوب سفیدرنگی در انتهای ارلن ظاهر می‌شود و این نشان‌دهندۀ آغاز تولید نانوذرات اکسید روی است (شکل1). محیط کشت باکتری بدون محلول نمکی به‌عنوان کنترل مثبت و محلول نمکی نیترات روی بدون محیط کشت باکتری به‌عنوان کنترل منفی در شرایط یکسان آزمایش و حرارت‌دهی شد که فاقد رسوب سفیدرنگ مشاهده‌شده در ارلن محیط کشت و نمک موردنظر در این آزمایش بود. ارلن از حمام آب گرم خارج می‌شود و سپس به‌مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد و چرخش 130 دور در دقیقه در شیکر انکوباتور قرار گذاشته می‌شود تا تمام نانوذرات شروع به رسوب کنند. محصول حاصل در چرخش3400 دور در دقیقه به‌مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شده و سپس 3 بار با آب دی‌یونیزه شستشو داده می‌شود. بعد از آن رسوبات حاصل در دمای 45 درجه سانتیگراد در آون خشک می‌گردد. پودر حاصل در دمای  600 درجه سانتیگراد به‌مدت 2 ساعت به‌منظور حذف بقایای باکتری و مواد آلی کلسینه می‌شود (5 و 23).

شکل 1- رسوب تشکیل‌شده حین حرارت‌دادن محیط کشت باکتری همراه با محلول نمکی

.مشخصه‌یابی نانوذرات اکسید روی تشکیل‌شده: برای شناسایی نانوذرات اکسید روی ساخته‌شده، از آنالیزهای متفاوتی استفاده می‌شود تا سنتز این نانو ذره را تأیید کند. پودر حاصل به‌وسیلۀ آنالیز اسپکتروسکوپی مادون قرمز با تبدیل فوریه FTIR[8](دستگاه Bruker مدل 27 Tensor ساخت کشور آلمان) به‌منظور شناخت پیوندها، گروه‌های عاملی درگیر، در محدودۀ طیف بین4000 -400 cm^-1 با میانگین 16 اسکن و رزولوشن cm^-1 4 سنجش شد. به‌منظور آماده‌سازی نمونه برای این آنالیز پودر حاصل با پتاسیم بروماید به نسبت 1به 100 مخلوط می‌شود و سپس پودر نرم‌شده جهت قرارگیری در دستگاه به‌صورت قرص در آورده شده و در مسیر پرتو برای سنجش قرار می‌گیرد.

 آنالیز طیف سنج پراش اشعۀ ایکس XRD[9] (دستگاه Bruker مدل AdvanceD8ساخت کشور آلمان) با لامپی از جنس آند مس با طول موج Kα حدود 5406/1 آنگستروم در 35 کیلوولت و 35 میلی‌آمپر در رنج زاویه براگ،80> θ2>10 به‌منظور تعیین فازها، تشخیص ساختار کریستالی ماده انجام شد. پودر تولیدشده با آنالیزهای میکروسکوپ الکترونی روبشی SEM[10]،طیف‌سنجی پراش انرژی پرتو ایکسEDX[11](دستگاهZeiss sigma vp ساخت کشور آلمان) سنجش شد. آنالیز SEMبه‌منظور بررسی شکل، ساختار و سایز نانوذرات و آنالیزEDX برای تعیین عناصر تشکیل‌دهنده و خلوص نمونه است. خواص نوری نانوذرات اکسید روی تولیدی به‌وسیلۀ طیف‌سنجیUV-VIS[12](UVD-3200LABOMEDساخت کشور امریکا) بررسی شد. به این منظور ابتدا پودر تولیدی در آب دیونیزه به‌وسیلۀ دستگاه اولتراسونیک به‌طور یکنواخت پراکنده شد؛ سپس پودر سنتزشده برحسب میزان طیف جذب در طول موج 800-200 نانومتر شناسایی شد.

نتایج.

زیست‌ سنتزنانوذرات اکسیدروی مطابق روش ذکرشده درقسمت موادوروش‌ها همراه با آزمایشات کنترل انجام شد.آزمایشات کنترل با استفاده از محلول نمکی بدون حضور میکروراگانیسم ونیزمحیط میکروبی بدون حضورمحلول نمکی درشرایط یکسان انجام گرفت ولی منجر به تولیدرسوب نشد؛ اما در آزمایش اصلی همان‌گونه که درشکل ۱ مشاهده می‌شود رسوب سفیدرنگ در انتهای ارلن بیان‌کنندۀتشکیل نانوذرات اکسید روی است. برای تأیید این موضوع آنالیزهای FTIR، XRD، SEM و EDX انجام گرفت که نتایج آن به شرح زیر است:

آنالیز FTIR برای دستیابی به جزئیات گروه‌های عاملی درگیر سنتز زیستی نانوذرات اکسید روی است شکل 2 آنالیز FTIRنمونه رسوب تولیدشده توسط باکتری زانتوموناس‌کمپستریسرا نشان می‌دهد که پیک‌های برجسته‌ای در3431، 2924،2372، 2340، 1630، 1072و 563 cm^-1دارد. پهنای قوی مشاهده‌شده در3431 و 1072 cm^-1مربوط به حالت کشش متقارن مولکول‌های آب و ارتعاشات گروه عاملی  O-H است (5 و10).وجوداین پیک‌ها نشان‌دهنده جذب رطوبت ازمحیط اطراف بر روی نانوذرات است. پیک 2924cm^-1 مربوط به لرزش‌های کششی گروه عاملی C-H (10) و پیک‌های 2340 –2372 cm^-1مربوط به ارتعاشات گروه‌های کربونیل است.پهنای cm^-11630 لرزش‌های گروه‌های عاملی N-H و C=C را نشان می‌دهد که می‌توانند مربوط به گروه‌های آمید 1 ووینیل باشند (3 و 10). پیک برجستۀ 1072cm^-1هم مربوط به لرزش‌های گروه عاملیO-Hاست (5). وجود پیک‌های ذکرشده ممکن است به‌دلیل وجود اجزای باقیمانده ازمواد آلی و پروتئین‌هادرساختارکریستالی نانوذره و یا بخشی از آن دراثرجذب موادی همچون آب و دی‌اکسیدکربن از محیط بر روی سطح نانوذره باشد. درمراجع مختلف،لرزش‌هایZn-O (اکسیدفلزی) در بازۀ600-400cm^-1گزارش شده است (5 و 7)؛بنابراین پیک مشاهده‌شده در 563cm^-1متناظر با لرزش کششی نانوذرات اکسید روی است (11). نتایج حاصل از طیف‌سنجی FTIR احتمال حضورگروه‌های عاملی مربوط به پروتئین‌ها را تأیید می‌کنند. براساس نتایج پژوهش‌های قبل، نقش این پروتئین‌ها این است که نانوذرات اکسید روی را تثبیت کنند و باعث جلوگیری از به‌هم‌چسبیدن و آگلومر‌شدن آنها شوند (10).

شکل2- نمودار FTIR نانومیله‌های اکسید روی سنتزشده توسط زانتوموناس‌کمپستریس

شکل 3 الگوی XRD پودر سنتزشدۀ نانومیله‌های اکسید روی را نمایش می‌دهد. نانوذرات کریستالی اکسید روی در سطوح (100)،(002)، (101)، (102)، (110)، (103)، (200)، (112)، (201)، (004) و (202) پیک‌هایی را نشان می‌دهند که با داده‌های کریستالوگرافی استاندارد الگوی مرجع 1451 – 36 JCPDS مطابقت دارد. همۀ خطوط پراش گویای سنتز خالص نانوذرۀ اکسید روی با ساختار هگزاگونال (ورتزیت)[13] است. هیچ پیکی ناخالصی و یا وجود فاز دیگری غیر از اکسید روی را بیان نمی‌کند. درواقع به‌وسیلۀ آنالیز XRD خالص‌بودن و تبلور نانوذرات اکسید روی نشان داده شده است (27 و 28).

شکل 3- نمودار XRD نانومیله‌های اکسید روی سنتزشده توسط زانتوموناس‌کمپستریس

 آنالیز SEM به‌منظور بررسی مورفولوژی و سایز نانوذرات است. شکل 4 تصاویر SEM نانوذرات اکسید روی سنتزشده توسط زانتوموناس‌کمپستریس را نشان می‌دهد که همان‌طور که در تصویر مشخص است، مورفولوژی نانوذرات تولیدشده به‌صورت کریستال‌های میله‌ای‌شکل به‌طول تقریبی300 نانومتر است. قطر سطح مقطع شش گوشۀ این نانوذرات بین 200 – 122 نانومتر با میانگین تقریبی 163 نانومتر است (28).

 شکل 5 آنالیز EDX را نشان می‌دهد که مربوط به بررسی عناصر تشکیل‌دهنده و خلوص محصول است. پیک‌های نشان‌داده‌شده مربوط به عناصر روی، اکسیژن و طلا است که طلای به‌کاربرده‌شده مربوط به آماده‌سازی نمونه برای آنالیز EDX و SEM و پوشش‌دهی پودر اکسید روی بر روی نوارچسب‌های طلا به‌منظور انجام آنالیز است. مقدار روی موجود در پودر سنتزشده 5/76درصد و اکسیژن 5/23درصد است و تأیید می‌کند که نانوذرات تولیدشده خالص است و اثری از ناخالصی عناصر دیگر در آن وجود ندارد (10 و 24).

طیف‌سنجی مرئی –فرابنفش(UV-VIS) پودر سنتزشده در شکل 6 نشان داده شده است؛ همان‌طور که در شکل قابل توجه است، پیک جذب برجسته و مشخصی در376 نانومتر مشاهده می‌شود که در راستای نتایج دیگر(3) بیان‌کنندۀ حضور نانوذرات اکسید روی است.

شکل 4- تصاویر SEM نانو میله های اکسید روی بوسیله ی زانتوموناس کمپستریس

شکل 5- نمودار EDX نانومیله‌های اکسید روی توسط زانتوموناس‌کمپستریس

شکل 6- طیف‌سنجی مرئی- فرابنفش نانومیله‌های اکسید روی توسط زانتوموناس‌کمپستریس