پیوندهای مفید
اخبار و اعلانات
آمار
| تعداد نشریات | 43 |
| تعداد شمارهها | 1,639 |
| تعداد مقالات | 13,327 |
| تعداد مشاهده مقاله | 29,884,911 |
| تعداد دریافت فایل اصل مقاله | 11,949,598 |
بررسی ویژگیها و افزایش تولید آمیلاز در سویههای جهشیافته باسیلوسلیکنیفورمیس بومی ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| زیست شناسی میکروبی | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مقاله 7، دوره 6، شماره 21، فروردین 1396، صفحه 67-81 اصل مقاله (712.21 K) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| نوع مقاله: پژوهشی- فارسی | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| شناسه دیجیتال (DOI): 10.22108/bjm.2017.21313 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| نویسندگان | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| محسن مبینی دهکردی* 1؛ سحر جعفری دهکردی2؛ بهناز صفار3 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه شهرکرد، ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2کارشناسی ارشد زیستفناوری میکروبی، دانشگاه شهرکرد، ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 3استادیار زیست سلولی و مولکولی، دانشگاه شهرکرد، ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| چکیده | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مقدمه: آمیلاز آنزیم هیدرولیزکنندۀ نشاسته است که پیوندهای داخلی گلیکوزیدی در پلیساکاریدها را هیدرولیز میکند. آمیلازها یکی از آنزیمهای صنعتی مهم هستند که گسترۀ وسیعی از کاربردها را دارا هستند؛ ازجمله تبدیل نشاسته به شربت قند، تولید سیکلودکسترینها؛ همچنین این آنزیمها در صنعت داروسازی و پزشکی کاربرد دارند. مواد و روشها: در این پژوهش، سویۀ باسیلوسلیکنیفورمیسگرمادوست و بومی که از چشمۀ آب گرم روستای قینرچه از توابع استان اردبیل جداسازی و خالصسازی شده بود در محیط نوترینت براث، در معرض پرتو ماوراءبنفش با طولموج 254 نانومتر و از فاصلۀ 1متری بهمدت 45 ثانیه در دستگاه هودلامینار قرار داده شد. کلیۀ سویههای جهشیافتۀ جداسازیشده ازنظر تحمل دمایی و شوری، میزان تولید آمیلازو همچنین ازنظر مقاومت آنتیبیوتیکی با سویۀ والد مقایسه شدند. نتایج: از بین 70 نمونۀ جهشیافتۀ جداسازیشده تنها دو سویه بهنامهایB.L.2.M.1 و B.L.2.M.2توانستند میزان بیشتری آمیلاز نسبت به سویۀ والد تولید کنند. تفاوت در تولید آنزیم با تغییر در میزان رشد باکتریهای جهشیافته همراه شد؛ بهطوری که تمامی اختلافهای مشاهدهشده ازنظر آماری در سطح 5درصد معنادار بودند. میزان تولید آنزیم در سویۀ B.L.2.M.1 در دمای 40 درجه سانتیگراد بعد از 72 ساعت 7/41درصد نسبت به سویۀ والد افزایش نشان داد. از طرف دیگر میزان تحمل دمایی و شوری در باکتری جهشیافتۀ B.L.2.M.1 از سایر باکتریهای مطالعهشده بیشتر ارزیابی شد. بحث و نتیجهگیری: برآیند جهشهای تصادفی ایجادشده در باکتری جهشیافتۀ B.L.2.M.1سبب بروز فنوتیپ جدیدی شده است که افزایش میزان تولید آنزیم، افزایش سرعت رشد سلولی، افزایش مقاومت به دماهای بالاتر و افزایش تحمل شوری از مهمترین آنها هستند. با توجه به ویژگیهای مثبت و منحصربهفرد ایجادشده در جهشیافتۀ ذکرشده، زمینه برای مطالعات تکمیلی بهمنظورتولید و بهینهسازی آنزیم آمیلاز مقاوم به حرارت فراهم شده است. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| کلیدواژهها | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| باسیلوسلیکنیفورمیس؛ گرمادوست؛ جهشزایی؛ آمیلاز؛ پرتو ماوراءبنفش | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| اصل مقاله | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
مقدمه. آنزیم آمیلاز[1] را انسلم پاین[2] در سال ۱۸۳۳ کشف کرد (1). آنزیم آمیلاز، آنزیم هضمکنندۀ نشاسته است که پیوندهای داخلی گلیکوزیدی در پلیساکاریدها را هیدرولیز میکند. نام دیگر آنزیم آمیلاز، گلیکوژناز[3] است. آنزیمهای آمیلاز متالوآنزیم[4] هستند که به یون کلسیم جهت ایجاد ساختار کامل و انجام فعالیت خود نیاز دارند. آنزیم آمیلاز متعلق به گروه گلیکوزیدهیدرولاز[5] است. گلیکوزیدهیدرولازها قادر به هیدرولیز وسیع ساکاریدها هستند. این آنزیمها براساس حالت واکنشها و اسیدهای آمینه دستهبندی میشوند. آنزیم آمیلاز دارای چهارده دسته (N-A) است. این دستهها برای گلیکوزیدها و ترانس گلیکوزیدها تعریف شده است (2). آمیلازها یکی از آنزیمهای صنعتی مهم هستند که گسترۀ وسیعی از کاربردها را دارا هستند؛ ازجمله: تبدیل نشاسته به شربت قند، تولید سیکلودکسترین[6]ها؛ همچنین این آمیلازها در صنعت داروسازی کاربرد دارند. این آنزیمها حدود 30درصد از تولید آنزیمهای جهان را به خود اختصاص دادهاند (3). آنزیم آمیلاز در میکروارگانیسمها، گیاهان و موجودات زنده تکامل یافته مشاهده میشود (4). آنزیمهای آمیلاز اساساً به 4 گروه تقسیم میشوند: اندوآمیلازها، اگزوآمیلازها، شاخهشکن[7] و ترانسفرازها[8]. اندوآمیلازها، پیوندهای گلیکوزید داخلی آلفا-دی-1،4 نشاسته را هیدرولیز میکنند و محصولات آلفا-آنومریک[9] تولید میکنند. اگزوآمیلازها پیوندهای آلفا-1،4 یا آلفا-1،6 از باقیماندۀ[10] گلوکز خارجی را هیدرولیز میکنند و محصولات آلفا یا بتا-آنومریک را تولید میکنند. آنزیمهای شاخهشکن، پیوندهای خارجی آلفا-1،6 پلیساکاریدهای خطی را هیدرولیز میکنند و ترانسفرازها پیوندهای گلیکوزیدی آلفا-1،4 از مولکولدهنده[11]را هیدرولیز میکنند و بخشی از مولکولدهنده به مولکولپذیرنده انتقال داده میشود ویک پیوند گلیکوزیدی جدید ایجاد میکند (5). محصولات نهایی حاصل از عملکرد آنزیم آمیلاز بر نشاسته، مخلوطی از ترکیبات گلوکز، مالتوز[12]، مالتوتریوز[13] و اولیگوساکاریدهای شاخهای با 6 تا 8 واحد گلوکز است که هر دو پیوند آلفا-1،4 و آلفا-1،6 را شامل میشوند (6). وزن مولکولی آنزیم آمیلاز در موجودات گوناگون متفاوت است و از حدود 10 تا 210 کیلودالتون است. کمترین وزن مولکولی، 10 کیلودالتون برای باسیلوس کالدولیتیکوس[14] و بیشترین وزن مولکولی برای کلروفلکسوسائورنتیکوس[15] گزارش شده است (7). بهینهسازی عوامل مختلف و دستکاری در محیطها، یکی از فناوریهای مهم برای تولید بیشازحد آنزیمها در مقادیر زیاد برای درخواستهای صنعتی است. عوامل فیزیکی و شیمیایی مختلفی شناخته شدهاند که تولید آنزیم آمیلاز را تحتِتأثیر قرار میدهند؛ ازجمله میتوان به تأثیر پرتوهای موتانزا، دما، اسیدیته[16]، دورۀ گرمخانهگذاری، منابع کربن، منابع نیتروژن، مواد فعال سطحی[17]، فسفات، یونهای فلزی مختلف، رطوبت و فشار اکسایشی[18] اشاره کرد. فعل و انفعالات حاصل از این فاکتورها تأثیر قابلِتوجهی را در تولید آنزیم نشان داده است (8). بهینهسازی تولید آنزیم بهمعنای تغییراتی است که بر رشد پرگنه باکتریها و تولید آنزیم اثر میگذارد. بهینهسازی و دستکاری عوامل مختلف بر رشد باکتریها و افزایش تولید آنزیمها از مهمترین روشها برای تولید بیشازحد آنزیم در صنایع است. در این پژوهش، هدف اصلی بررسی اثر پرتو ماوراءبنفش (بهعنوان عامل جهشزای فیزیکی) بر باسیلوسلیکنیفورمیس[19] گرمادوست جداشده از چشمۀ آب گرم اردبیل و بررسی و مقایسۀ خصوصیات مورفولوژی و فیزیولوژی و میزان تولید آنزیم آمیلاز در سویههای والد و جهشیافته بود.
مواد و روشها. .سویه باکتری و محیطهای کشت: باسیلوسلیکنیفورمیس B.L.2، نوعی میکروارگانیسم بومی و گرمادوست است که در طی تحقیقات قبلی، مبینی و همکاران[20] آن را با عنوان بهینهسازی فرآیند تولید آنزیم آمیلاز و شناسایی مولکولی باکتری گرمادوست از چشمۀ آب گرم اردبیل، جداسازی و شناسایی کردند؛ توانایی تولید آنزیم آمیلاز آن برابر 76/3 واحد/میلیلیتر/دقیقه است. این سویه از چشمۀ آب گرم روستای قینرچه از توابع استان اردبیل جداسازی، خالصسازی و شناسایی شد (9). از کشت خالص باسیلوسلیکنیفورمیس گرمادوست فوق در این پژوهش استفاده شد. سویۀ موردنظر در محیط نوترینت براث (مرک) کشت داده شد و بهمنظور ایجاد جهش از پرتو ماوراءبنفش (جهشزای فیزیکی) استفاده شد. .انجام فرآیند جهشزایی با اشعۀ پرتو ماوراءبنفش و جداسازی جهشیافتهها: نمونۀ موردنظر در محیط کشت نوترینت براث تلقیح شد و در دمای 37 درجه سانتیگراد با 100 دور بر دقیقه بهمدت 18 ساعت گرمخانهگذاری شد تا جذب نوری در طولموج 600 نانومتر به 5/0 رسید. محیط کشت حاوی نمونۀ موردنظر 106 بار رقیق شد، بهطوری که در هر 1 میلیلیتر محیط کشت، 500 سلول وجود داشت. 5 میلیلیتر از محیط کشت رقیقشده، در یک پلیت استریل در داخل هودلامینار (ژال تجهیز)، در معرض پرتو ماوراءبنفش با طولموج 254 نانومتر و فاصلۀ 1متری از لامپ ماوراءبنفش در بازههای زمانی 2، 5، 10، 20، 30، 40، 50 و 60 دقیقه قرار داده شد. در هنگام پرتودهی با پرتو ماوراءبنفش درِ پلیت برداشته شد. نمونههای پرتودیده به محیط کشت آگار مغذی منتقل شدند و در دمای 30 درجه سانتیگراد بهمدت 24 ساعت گرمخانهگذاری شدند. پس از بررسی و شمارش پرگنههای پرتودیده بازۀ زمانی از دقیقه به ثانیه کاهش یافت. درنهایت پرتو ماوراءبنفش با طولموج 254 نانومتر در فاصلۀ 1متری در بازۀ زمانی 15، 30، 45، 60، 75، 90، 105 و 120 ثانیه بر نمونههای رقیقشده، تابیده شد. از سوسپانسیون پرتودیده در هر بازۀ زمانی 100 میکرولیتر بر روی محیط کشت آگار مغذی کشت داده شد. نمونۀ شاهد در این آزمون، محیط کشت حاوی نمونۀ موردنظر با رقت 106 بود که پرتو ماوراءبنفش به آن تابیده نشده بود. پلیتهای حاوی نمونههای پرتودیده در دمای 30 درجه سانتیگراد بهمدت 24 ساعت گرمخانهگذاری شدند. تمامی پرگنهها در بازههای زمانی شمارش شدند (10). بازۀ زمانی که واجد 50درصد باکتری زنده است، بهعنوان بهترین بازۀ زمانی در نظر گرفته شد. تمامی مراحل دو بار تکرار شد. درنهایت 45 ثانیه بهعنوان بهترین بازۀ زمانی در نظر گرفته شد. از محیط کشت نوترینت براث حاوی نمونۀ موردنظر که در زیر هودلامینار، پرتو ماوراءبنفش بهمدت 45 ثانیه دریافت کرد، اقدام به تهیۀ کشتهای متعدد در پلیتهای حاوی آگار مغذی شد و تمامی آنها در دمای 30 درجه سانتیگراد بهمدت 24 ساعت گرمخانهگذاری شدند. باکتریهای پرتودیده که توانایی ایجاد پرگنه داشتند با روش تهیۀ ساب کالچر جداسازی و خالصسازی شدند. با این روش در ابتدا سویههایی که مقاوم به پرتو ماوراءبنفش بودند، جداسازی شدند و تمامی سویههای مقاوم به پرتو ماوراءبنفش از جهت میزان تولید آنزیم آمیلاز بررسی شدند. سویههایی که میزان تولید آنزیم آمیلاز بیشتری داشتند، بهعنوان جهشیافته در نظر گرفته شدند. سویههای جهشیافته ازنظر ویژگیهای مورفولوژی و فیزیولوژی ازجمله شکل ظاهری، تحمل دمایی، تحمل شوری، رشد در دماهای گوناگون و مقاومت به آنتیبیوتیکها (آزمون آنتیبیوگرام) نسبت به سویۀ والد بررسی شدند. سنجش آنزیم آمیلاز: با استفاده از معرف 3،5-دینیتروسالیسیکاسید[21] (سیگما) تولید آنزیم آمیلاز بهصورت کمی در تمامی پرگنههای پرتودیدۀ بهدستآمده، بررسی شد. پرگنههای پرتودیده در محیط کشت نوترینت براث در دمای 30 درجه سانتیگراد با 100 دور بر دقیقه گرمخانهگذاری شدند. 50 میکرولیتر از محیطهای نوترینت براث حاوی هر پرگنه بر روی محیط کشت نوترینت آگار کشت داده شدند. از پرگنههای موجود در سطح پلیت، یک پرگنه به 10 میلیلیتر محیط نوترینت براث تلقیح شد و در دمای 30 درجه سانتیگراد با 100 دور بر دقیقه گرمخانهگذاری شد. زمانی که جذب نوری نمونه به 5/0 رسید، 200 میکرولیتر به محیط کشت نوترینت براث تلقیح شد و در دمای 30 درجه سانتیگراد با 100 دور بر دقیقه گرمخانهگذاری شد. پس از سانتریفیوژ نمونه در هر زمان موردِنظر، حجم 500 میکرولیتر از سوپرناتانت به 500 میکرولیتر محلول نشاسته (1درصد وزن/حجم) در بافر فسفات سدیم 02/0 مولار با اسیدیتۀ برابر 5/6 اضافه شد. محلول حاصل بهمدت 3 دقیقه در دمای 30 درجه سانتیگراد با 100 دور بر دقیقه گرمخانهگذاری شد. پس از آن 1 میلیلیتر از محلول 3،5-دینیتروسالیسیکاسید به نمونهها افزوده شد. حدود 15 دقیقه در بنماری در دمای 95 درجه سانتیگراد قرار داده شد. پس از آن تمامی نمونهها در دمای آزمایشگاه سرد شدند و 10 میلیلیتر آب مقطر برای جلوگیری از واکنش اضافه شد. در نمونۀ کنترل آب مقطر استریل بهجای سوپرناتانت استفاده شد. درنهایت، جذب نوری در طولموج 540 نانومتر با کمک دستگاه اسپکتروفتومتر (فارماسیا) خوانده شد (11). تولید آنزیم در 24، 48، 72، 96 و 120 ساعت پس از کشت بررسی شد. از هر بازۀ زمانی سه تکرار و از هر تکرار سه سنجش آنزیم صورت گرفت. برای ترسیم منحنی استاندارد از غلظتهای گوناگون گلوکز (مرک) شامل 10، 15، 20 و 25 میلیگرم در میلیلیتر استفاده شد و طبق رابطۀ (1) میزان گلوکز آزادشده محاسبه شد: رابطۀ شماره 1 Y= ۰۳۱۳/۰X+۰۸۸/۰
و از رابطۀ (2) برای سنجش میزان فعالیت آنزیم آمیلاز (واحد/میلیلیتر/دقیقه) استفاده شد: رابطۀ شماره 2
پس از بررسی کمی تولید آنزیم آمیلاز، سویههایی که تولید بیشری داشتند، جداسازی شدند و ازنظر کیفی هم بررسی شدند. بررسی تحمل دمایی: آزمون تحمل دمایی برای سه سویۀ B.L.2، B.L.2.M.1و B.L.2.M.2 با محیط نوترینت براث در دماهای 30، 40، 45، 50 و 55 با 100 دور بر دقیقه پس از 24 ساعت و در سه تکرار صورت گرفت. میزان جذب نوری سوسپانسیون باکتریها در طولموج 600 نانومتر بررسی شدند (12). بررسی تحمل شوری: محیطهای آگار مغذی حاوی 3، 5 و 7درصد کلریدسدیم آماده شدند. نمونهها با نسبت 106 رقیق شدند و 100 میکرولیتر نمونۀ رقیقشده بر روی محیطهای آگار مغذی حاوی کلریدسدیم کشت داده شد و بهصورت وارونه در گرمخانه (ممرت) در دمای 37 درجه سانتیگراد بهمدت 24 ساعت گرمخانهگذاری شدند. دو تکرار برای هر آزمون تحمل شوری انجام شد (13). در این بررسی تأثیر پرتوهای ماوراءبنفش بر تحمل شوری در سویههای جهشیافته با سویۀ والد مقایسه شد. آزمون آنتیبیوگرام: این آزمون جهت بررسی مقاومت سویههای جهشیافته و سویۀ والد به آنتیبیوتیکها صورت گرفت، تا تأثیر پرتو ماوراءبنفش بر مقاومت آنتیبیوتیکها در سویههای جهشیافته با سویۀ والد مقایسه شود. آنتیبیوتیکهایی در این آزمون استفاده شد که بر سنتز دیوارۀ سلولی و سنتز پروتئینهای سلولی تأثیرگذار بودند. از ده آنتیبیوتیک استرپتومایسین، اریترومایسین، آزیترومایسین، آمپیسیلین، آموکسیسیلین، آمیکاسین، پنیسیلین، جنتامایسین، سفالکسین و نئومایسین با روش انتشار دیسک در سه تکرار استفاده شد. آنتیبیوتیکهای آمپیسیلین، آموکسیسیلین و پنیسیلین بر سنتز دیوارۀ پپتید و گلیکان و سایر آنتیبیوتیکها بر سنتز پروتئینها بر باکتریهای گرممثبت تأثیرگذار بودند. برای انجام این آزمون از محیط کشت مولر هینتون آگار (شارلو) و سوسپانسیون باکتریها معادل استاندارد 5/0 مک فارلند استفاده شد و بهمنظور تفسیر نتایج، جداول استاندارد مقاومت/حساسیت به آنتیبیوتیکهای مختلف استفاده شدند (14). آنالیز آماری: از آزمون t-Test با نرمافزار اسپیاساس نسخۀ 17[22] جهت بررسی آماری تمامی دادههای حاصلشده از آزمونهای مختلف و معناداربودن یا نبودن دادهها استفاده شد. همچنین رسم نمودارها بهکمک نرمافزار اکسل 2013[23] انجام شد.
نتایج. در ابتدا سوسپانسیونی از نمونۀ موردنظر طبق مراحل ذکرشده تهیه شد. تنها در دو پلیت پرگنه مشاهده شد، یکی از این پلیتها حاوی نمونۀ شاهد با 40 پرگنه و پلیت دیگر نمونۀ پرتودیده در بازۀ زمانی 2 دقیقه با 2 پرگنه بود. بهعلت کمبودن تعداد پرگنهها، بازۀ زمانی از دقیقه به ثانیه کاهش داده شد و زمانهای 15، 30، 45، 60، 75، 90، 105 و 120 ثانیه در نظر گرفته شد. نمونههای پرتودیده در هر بازۀ زمانی دو بار تکرار شد و نتایج میانگین تعداد پرگنههای زنده حاصلشده پس از تأثیر پرتو ماوراءبنفش در جدول 1 نشان داده شده است. نتایج این جدول، تعداد پرگنههای مقاوم به پرتو ماوراءبنفش را در بازههای زمانی موردنظر نشان میدهد. برایناساس بازۀ زمانی انتخاب شد که 50درصد تعداد پرگنههای شاهد را داشت. با بررسی نتایج، بهینه تأثیر پرتو ماوراءبنفش بر نمونۀ موردنظر در بازۀ زمانی 45 ثانیه در نظر گرفته شد. در این بازۀ زمانی تمامی مراحل چهار بار تکرار شد. از نمونهای که بهمدت 45 ثانیه پرتو ماوراءبنفش دریافت کرده بود، پس از کشت و گرمخانهگذاری در مجموع تعداد 70 پرگنه جداسازی و خالصسازی شد. این پرگنههایی که تحتِتأثیر پرتو ماوراءبنفش زنده مانده بودند، ازجهت میزان تولید آنزیم آمیلاز سنجش شدند و سویههایی که آنزیم آمیلاز بیشتری تولید کردند بهعنوان سویههای جهشیافته جداسازی و خالصسازی شدند.
جدول 1- میانگین تعداد پرگنههای حاصل از باکتری پس از تأثیر پرتو ماوراءبنفش
سنجش تولید آنزیم آمیلاز: تولید آنزیم آمیلاز بهصورت کمی در تمامی نمونهها (70 پرگنه) در دمای 30 درجه سانتیگراد در بازههای زمانی 24، 48، 72، 96 و 120 ساعت بررسی شدند و تنها دو پرگنه فعالیت آنزیمی بیشتری نسبت به سویۀ والد داشتند که با B.L.2.M.1و B.L.2.M.2نامگذاری شدند و در اصل جهشیافتههای اصلی به شمار میآیند. نتایج حاصل در جدول 2 و شکل 1 نشان داده شده است. طبق جدول 2، 10 مورد باکتری جهشیافته که پرتو ماوراءبنفش را تحمل کردهاند و جزء 15درصد باقیمانده هستند، رشد میکنند و تولید آنزیمی متفاوت با سویۀ والد را نشان میدهند. پس دستیابی به سویۀ جهشیافته قطعی است و پرتو ماوراءبنفش توانسته است با اعمال جهشهای تصادفی، تغییراتی در سلول ایجاد کند که منجر به تولید بیشتر آنزیم شود. برای بررسی معناداربودن نتایج، از نرمافزار SPSS استفاده شد و در سطح 5درصد اختلاف فعالیت آنزیم آمیلاز بین سویۀ والد و دو سویۀ جهشیافته کاملاً معنادار است (05/0>Pvalue). در ادامه منحنی رشد باکتریها در دمای 30 درجه سانتیگراد رسم شد. نتایج حاصل از سه نمونۀ B.L.2، B.L.2.M.1و B.L.2.M.2 در جذب نوری با طولموج 600 نانومتر در شکل 2 نشان داده شده است. نتایج با آزمون t-Test آنالیز شد و نشان داد که اختلاف رشد باکتریها در سویۀ والد و دو سویۀ جهشیافته اصلی در سطح 5درصد کاملاً معنادار است (05/0>Pvalue). منحنی رشد و نمودار میزان فعالیت آنزیم آمیلاز نشان داد که رشد سویۀ جهشیافتۀ B.L.2.M.1 از هر دو سویۀ والد و B.L.2.M.2بیشتر است. درحالیکه سویۀ B.L.2.M.2 رشد کمتری نسبت به سویۀ والد داشت، اما میزان فعالیت آنزیم آمیلاز بیشتری را نشان داد. برای بررسی بیشتر سویهها ازنظر مورفولوژی، تحمل دمایی و شوری و تولید آنزیم آمیلاز در دماهای مختلف بررسی شدند.
جدول 2- میزان فعالیت و انحراف معیار میانگین آنزیم آمیلاز (واحد/میلیلیتر/دقیقه) در تعدادی از باکتریهای جهشیافته در مقایسه با سویۀ والد
شکل 1- میزان فعالیت آنزیم آمیلاز در دو سویۀ جهشیافتۀ اصلی در مقایسه با سویۀ والد. فعالیت آنزیم در سه تکرار و در دمای 30 درجه سانتیگراد محاسبه شده است. (errorbarها نشاندهندۀ انحراف معیار سه تکرار است)
شکل 2- منحنی رشد دو سویۀ جهشیافتۀ اصلی در مقایسه با سویۀ والد. منحنی رشد در سه تکرار، در دمای 30 درجه سانتیگراد و در محیط کشت نوترینت براث با rpm100ترسیم شد. (errorbarها نشاندهندۀ انحراف معیار سه تکرار است)
تولید آنزیمها جزء متابولیتهای اولیه است؛ پس در فاز رشد، همزمان با رشد سلولی آنزیمها تولید میشوند. همانطور که مشاهده میشود در زمان 24 ساعت به بعد آنزیم شروع به تولید کرده است و با گذشت زمان میزان تولید افزایش داشته است. این احتمال نیز دربارۀ آنزیم آمیلاز در نظر گرفته میشود که تا زمانی که مقدار منبع کربن (گلوکز) کافی در محیط کشت است نیازی به تولید زیاد آنزیم نیست. با گذشت زمان و ورود سلول به فاز رکود، مقدار منبع کربن یعنی گلوکز در محیط کاهش مییابد و بهتبع میزان تولید آنزیم آمیلاز توسط ژنهای مولد آنزیمهای هیدرولاز بهمنظور مصرف نشاسته افزایش مییابد. همانطور که در شکل 1 و 2 مشاهده میشود بعد از گذشت 24 ساعت آنزیم آمیلاز شروع به تولید میکند و بهترین بازۀ زمانی برای بیشترین میزان تولید آنزیم 72 و 96 ساعت است. بررسی شکل ظاهری و واکنش گرم نمونه: برای بررسی شکل ظاهری سویهها از کیت رنگآمیزی گرم استفاده شد. نمونهبرداری، رنگآمیزی و مشاهدۀ لامها در زیر میکروسکوپ نوری در شرایط یکسانی صورت گرفت. بررسی لامها نشان داد که هر سه سویۀ باسیلوس گرممثبت هستند و ازنظر ساختاری سویۀ B.L.2.M.2 از هر دو سویۀ والد و B.L.2.M.1 بزرگتر است. نتایج میکروسکوپی نمونهها در شکل 3 نشان داده شده است. بررسی تحمل دمایی: نتایج رشد سه سویه در دماهای گوناگون با هم مقایسه شد. نتایج نشان داد که بیشترین رشد بعد از 24 ساعت در تمامی دماها به دست آمده است. رشد سویۀ B.L.2.M.1 نسبت به دو سویۀ دیگر بیشتر بود؛ اما دو سویۀ B.L.2 و B.L.2.M.2رشد تقریباً مشابهی داشتند. این نتیجه در منحنی رشد در دما 30 درجه سانتیگراد هم مشاهده شد. بهترین رشد سویهها بعد از 24 ساعت در دمای 40 و 45 درجه سانتیگراد مشاهده شد. نتایج حاصل از مقایسۀ رشد سه سویه در جدول 3 نشان داده شد.
شکل 3- لام میکروسکوپی سویههای باسیلوس بومی و جهشیافته. الف) B.L.2، ب) B.L.2.M.1 و ج) B.L.2.M.2
جدول 3- میانگین جذب نوری و انحراف معیار میانگینهای مربوط به رشد سویههای جهشیافتۀ اصلی و والد در دماهای مختلف بعد از 24 ساعت در سه تکرار.
هر دو سویۀ جهشیافتۀ اصلی میزان تولید آنزیم آمیلاز بیشتری داشتند اما طی بررسیهایی که بر رشد سلولی سویهها صورت گرفت، مشخص شد که سویۀ B.L.2.M.1در دماهای بالا نیز سریعتر رشد میکند، درحالیکه در دماهای 40 تا 55 درجه سانتیگراد رشد سویۀ B.L.2.M.2 برابر با رشد سویۀ والد بود. سپس تولید آنزیم آمیلاز در دماهای مختلف سنجش شد و نتایج نشان داد تولید آنزیم آمیلاز B.L.2.M.1 در دمای 40 و 45 درجه سانتیگراد بیشتر از سویۀ والد و B.L.2.M.2بود. نتایج میزان فعالیت آنزیم آمیلاز در دماهای مختلف در جدول 4 نشان داده شده است.
جدول 4- میانگین و انحراف معیار فعالیت آنزیم آمیلاز (واحد/میلیلیتر/دقیقه) در دماهای مختلف در سه تکرار.
بررسی تحمل شوری: دو سویۀ جهشیافته ازنظر تحمل شوری هم بررسی شدند. سویههای جهشیافته مانند سویۀ والد با افزایش مقدار نمک دچار کاهش میزان رشد شدند. نتایج حاصل از تحمل شوری در جدول 5 نشان داده شده است. آزمون آنتیبیوگرام: این آزمون طبق مراحل ذکرشده با دیسکهای آنتیبیوتیک صورت گرفت. براساس اطلاعات موجود در جدول استاندارد، مقاوم و نیمهحساس و حساسبودن سویهها بررسی شد. هر سه سویه در برابر آنتیبیوتیکهای اریترومایسین، آزیترومایسین و پنیسیلین مقاوم بودند و در برابر آنتیبیوتیکهای آمپیسیلین، آموکسیسیلین، آمیکاسین، جنتامایسین، سفالکسین و نئومایسین حساس بودند. درواقع دو سویۀ جهشیافته با سویۀ والد در نه آنتیبیوتیک نتایج یکسانی را نشان دادند؛ اما در برابر آنتیبیوتیک استرپتومایسین دو سویۀ والد و B.L.2.M.2 حساس بودند و B.L.2.M.1 نیمهحساس بود. درنهایت نتیجه گرفته شد که پرتو ماوراءبنفش بر مقاومت سویۀ B.L.2.M.2نسبت به ده آنتیبیوتیک موردنظر تغییری ایجاد نکرده است، اما توانسته است بر مقاومت سویۀ B.L.2.M.1 نسبت به آنتیبیوتیک استرپتومایسین مؤثر باشد. گفتنی است که پرتوهای ماوراءبنفش میتوانند باعث تأثیر بر پمپهای غشایی و مسیرهای متابولیک (تولید آنزیم) شوند (15، 16 و 17). این احتمال وجود دارد که در سویۀ جهشیافتۀ B.L.2.M.1پرتو ماوراءبنفش بر عملکرد پمپهای غشایی اثر گذاشته باشد و ضمن کاهش عملکرد این پمپها، از ورود آنتیبیوتیک به سلول باکتری ممانعت شده باشد. بنابراین عملکرد سویه از حالت حساس به نیمهحساس تغییر کرده است. نتایج این آزمون در جدول 6 نشان داده شده است.
جدول 6- نتایج حاصل از بررسی مقاومت باکتریها نسبت به آنتیبیوتیکهای مختلف
جدول 5- نتایج تحمل شوری. میانگین و انحراف معیار تعداد پرگنههای شمارششده در پلیتها در سه تکرار.
بحث و نتیجهگیری. آنزیمهای آمیلاز ازجمله آنزیمهای مهم صنعتی هستند که سالانه چند تن از آنها در صنایع گوناگون مصرف میشوند. حدود 50 نوع باکتری و قارچ، آنزیم آمیلاز تولید میکنند. بارزترین آنها گونههای باسیلوس ازجمله باسیلوسسوبتیلیس و باسیلوسلیکنیفورمیس هستند (18). در این پژوهش سویۀ باسیلوسلیکنیفورمیس استفاده شده است. نتایج پژوهش حاضر ثابت کرد که محیط کشت متداول آزمایشگاهی برای تولید آنزیم آمیلاز از باسیلوسلیکنیفورمیس گرمادوست بهطور موفقیتآمیزی قابلِاستفاده است. در پژوهشهای پیشین از محیط کشت نوترینت براث با نشاسته 1درصد (وزن/حجم) برای رشد باسیلوسسوبتیلیس و همچنین بررسی تولید آنزیم آمیلاز استفاده شده است (19 و 20). در این پژوهش نیز برای رشد باسیلوسلیکنیفورمیس گرمادوست و بررسی تولید آنزیم آمیلاز از محیطهای کشت نوترینت براث و نوترینت آگار با 1درصد (وزن/حجم) نشاسته استفاده شد. در این پژوهش برای القای جهش و ایجاد سویههای جهشیافته از عوامل فیزیکی استفاده شد. پیش از بررسی اثر پرتو ماوراءبنفش بر میزان فعالیت آنزیم آمیلاز، تعداد پرگنههای باقیمانده در بازههای زمانی بررسی شد و بهترین بازههای زمانی برای تابش پرتو ماوراءبنفش بهمنظور ایجاد جهشزایی در سویۀ والد به دست آمد (18، 21 و 22). تابش پرتو ماوراءبنفش در بازۀ زمانی 45 ثانیه باعث شد 50درصد از باکتریهای گرمادوست مقاوم به پرتو ماوراءبنفش زنده بماند. درنتیجه احتمال ایجاد جهشیافته در بین پرگنههای تشکیلشده بیشتر بود. به همین دلیل ابتدا جدولی از تعداد پرگنههایی که در اثر تیمار توسط پرتو ماوراءبنفش زنده ماندند تهیه شد (23).پس از آن، بهمنظور القای جهش و ایجاد سویههای جهشیافته بهجهت افزایش میزان تولید آنزیم آمیلاز از پرتو ماوراءبنفش استفاده شد. درنهایت از بین جهشیافتههایی که با پرتو ماوراءبنفش تیمار شده بودند، دو سویه با نامهای B.L.2.M.1و B.L.2.M.2 حاصل شد. این دو سویۀ جهشیافته، آنزیم آمیلاز بیشتری نسبت به سویۀ والد تولید کردند. پاندی[xxiv] و گوپدا[xxv]از پرتو ماوراءبنفش بهمدت 4 و 8 دقیقه برای بهینهسازی آنزیم آمیلاز در باسیلوسسوبتیلیس استفاده کردند و تولید آنزیم آمیلاز 08/2درصد افزایش داشت (10). پرتو ماوراءبنفش به سویههای رشدیافته در محیط کشت نوترینت براث، بهمدت 45 ثانیه تابیده شد و از سویههای جهشیافتۀ ارزیابیشده دو سویۀ جهشیافته با نامهای انتخابی B.L.2.M.1و B.L.2.M.2 جداسازی شدند. در بهینهسازی با پرتو ماوراءبنفش، نمونههای جهشیافته در مقایسه با نمونۀ والد با استفاده از معرف دینیتروسالیسیلیکاسید سنجش شدند (11) و نتایج نشان داد سویۀ جهشیافتۀ B.L.2.M.1 در دمای 40 درجه سانتیگراد بعد از گذشت 72 ساعت 8/5 واحد/میلیلیتر/دقیقه تولید آنزیم آمیلاز داشتهاند که در مقایسه با سویۀ والد 7/41درصد آنزیم بیشتری تولید کردند. نتایج بازدهی تولید آنزیم در سویۀ گرمادوست همچون نتایج پاندی و گوپدا روند افزایشی داشت (10)؛ اما در این پژوهش درصد تولید آنزیم بسیار بالاتر بود. سویههای جهشیافته ازنظر مورفولوژی و فیزیولوژیکی نسبت به سویۀ والد بررسی شدند. ازنظر مورفولوژی سویۀ B.L.2.M.2 ازنظر ساختاری بزرگتر از سویۀ والد مشاهده شد. بررسی شکل ظاهری هر سه سویه (والد و دو سویۀ جهشیافته) در شرایط آزمایشگاهی و میکروسکوپی یکسان صورت گرفت. ازنظر فیزیولوژیکی تأثیر شوری، دما و مقاومت به آنتیبیوتیکها توسط آزمون آنتیبیوگرام جهت مقایسۀ تأثیر پرتو ماوراءبنفش بر روی سویۀ والد با دو سویۀ جهشیافته صورت گرفت (12، 13 و 14). نتایج نشان داد که تابش پرتو ماوراءبنفش بر تحمل به شوری در سویههای جهشیافته نسبت به سویۀ والد اثر گذاشته است و سویۀ جهشیافتۀ B.L.2.M.1در محیطهای نمکی تعداد پرگنههای بیشتری تولید کرد، با توجه به اینکه همانند سویۀ والد با افزایش درصد شوری در محیط کشت پایه، میزان رشد سویهها روند کاهشی مشاهده شد. در آزمون آنتیبیوگرام تنها در یک آنتیبیوتیک (استرپتومایسین) و در سویۀ B.L.2.M.1مقاومت از حالت حساس به نیمهحساس تغییر کرده است. این تغییر مقاومت به آنتیبیوتیک در سویۀ جهشیافته میتواند در اثر تأثیر پرتو ماوراءبنفش بر عملکرد پمپهای غشایی صورت گرفته باشد و باعث شده عملکرد این پمپها کمتر شود که نتیجۀ آن، کاهش ورود آنتیبیوتیکها به داخل باکتری است. بنابراین عملکرد سویه از حالت حساس به نیمهحساس تغییر کرده است. تأثیر دما برای تولید آنزیم به رشد میکروارگانیسمها وابسته است. دامنۀ وسیع دما بین 35 تا 80 درجه سانتیگراد در باکتریها گزارش شده است (24، 25). لیو[xxvi] و همکارانش سویهای از جنس باسیلوس جدا کردند که در دمای 45 درجه سانتیگراد بعد از 44 ساعت بیشتر تولید آنزیم آمیلاز (53 واحد/میلیلیتر) را نشان داد (26). کنشولا[xxvii] و همکارانش سویهای از باسیلوسسوبتیلیس جدا کردند که در دمای 40 درجه سانتیگراد بعد از 36 ساعت (22 واحد/میلیلیتر) بیشترین تولید آنزیم آمیلاز را داشت (27). در این پژوهش میزان رشد سویهها در دماهای بررسی شدند و بهترین رشد سویهها بعد از 24 ساعت در دماهای 40 و 45 درجه سانتیگراد مشاهده شد. سویۀ B.L.2.M.1 در دماهای 40 و 45 درجه سانتیگراد بیشترین رشد سلولی را نسبت به سویۀ والد داشت. تولید آنزیم در سویههای مطالعهشده در دماهای مختلف بررسی شدند و میزان تولید آنزیم آمیلاز در سویۀ جهشیافتۀ B.L.2.M.1 بعد از 72 ساعت در دماهای 40 و 45 درجه سانتیگراد بهترتیب 8/5 و 45/3 واحد/میلیلیتر/دقیقه بود، که این میزان تولید آنزیم نسبت به دو سویۀ دیگر بیشتر بود. تولید آنزیم در سویۀ B.L.2.M.1 بعد از 72 ساعت در 40 درجه سانتیگراد، 7/41درصد افزایش نسبت به سویۀ والد را نشان داد. رسولی و همکارانش میزان رشد باسیلوسلیکنیفورمیسگرمادوست و میزان تولید آنزیم آمیلاز در دمای 50 درجه سانتیگراد بهمدت 36 ساعت بررسی کردند و نتیجه گرفتند بعد از 26 ساعت، جمعیت توده سلولی به حداکثر مقدار خود رسیده باشد، میزان تولید آنزیم افزایش مییابد. پس میزان تولید آنزیم آمیلاز با رشد سویه رابطۀ مستقیم دارد(28). نتایج این پژوهش نشان داد که در زمان 26 و 28 ساعت بهترتیب برای B.L.2.M.1 و B.L.2.M.2، تولید آنزیم آمیلاز با افزایش رشد سلولی، افزایش داشت که این نتایج با نتایج رسولی وهمکارانش منطبق بود، اما تا 96 و 72 ساعت بهترتیب برای B.L.2.M.1 و B.L.2.M.2 تولید آنزیم افزایش مییابد. بهعبارتیدیگر، با گذشت زمان دسترسی سلولها به منبع کربن کاهش یافته است که باعث افزایش بیان آنزیم آمیلاز میشود(26، 27 و 28). آنزیمهای آمیلاز از منابع کربنی همچون گلوکز، لاکتوز و مالتوز استفاده میکند. درصورتیکه منابع اصلی کربن در محیط کم باشند، از منبعی چون نشاسته استفاده میکنند و تولید آنزیم آمیلاز افزایش مییابد. در پژوهشهای مشابهی که بر تولید آنزیم آمیلاز صورت گرفته است؛ نشان داده شده است که تولید آنزیم آمیلاز در حضور نشاسته افزایش مییابد (27 و 28). از طرفی دیگر، با افزایش زمان تا 120 ساعت، تولید آنزیم کاهش یافت که میتوان علت کاهش را افزایش بیان آنزیمهای پروتئاز و پپتیداز مختلف دانست که بر آنزیم آمیلاز اثر میگذارد و باعث هیدرولیز پروتئینهای آنزیمی و درنتیجه کاهش فعالیت آمیلاز میشوند (18 و 29). بنابراین دستاوردی که در این پژوهش حاصل شد، سویههای جهشیافته بودند که میزان تولید آنزیم آمیلاز بیشتری نسبت به سویۀ والد داشتند و تولید آنزیم تا دمای 45درجه سانتیگراد در یکی از سویههای جهشیافته همچنان روند افزایشی را نشان میدهد. بدیهی است که استفاده از سویههایی که میزان تولید آنزیم و مقاومت حرارتی بیشتری دارند در صنایع مرتبط با زیستفناوری مناسبتر و مقرونبهصرفهتر هستند ومیتوان زمینه را برای تولید انبوه آنزیم با حضور آنها فراهم کرد.
تشکر و قدردانی از همکاری و مساعدتهای آقای مهندس فرهاد بنی مهدی بهعنوان کارشناس آزمایشگاه زیستفناوری و مولکولی دانشکده علوم پایه که در انجام این پژوهش ما را یاری کردند، تشکر و قدردانی میشود.
[1]-Amylase [2]-Anselme Payen [3]-Glycogenase [4]-Metalloenzyme [5]-Glycoside hydrolase [6]-Cyclodextin [7]-Debranching [8]-Transfrasese [9]-Alpha-anomeric [10]Residues [11]Donor molecule [12]-Maltose [13]-Maltotriose [14]-Bacillus caldolyticus [15]-Chloroflexusaurantiacus [16]-pH [17]-Surfactants [18]-Oxidative stress [19]-Bacillus licheniformis [20]- Jafari-Dehkordi [21]-3,5-Dinitrosalicylic acid (DNS) [22]-SPSS ver.17 [23]-Excel 2013 [xxiv]-Pandey [xxv]-Gupta [xxvi]-Liu | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مراجع | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
(1) Silverman RB. The organic chemistry of enzyme-catalyzed reactions. 3rd ed. London, England: Academic Press; 2002. (2) Bordbar AK., Omidiyan K., Hosseinzadeh R. Study on interaction of alpha-amylase from Bacillus subtilis with cetyl trimethylammonium bromide. Journal of Colloids and surfaces B: Biointerfaces 2005; 40(1): 67-71. (3) Van Der Maarel MJ., Van Der Veen B., Uitdehaag J., Leemhuis H., Dijkhuizen L. Properties and applications of starch-converting enzymes of the α-amylase family. Journal of biotechnology. 2002; 94(2): 137-55. (4) Kandra L. α-Amylases of medical and industrial importance. Journal of Molecular Structure: Theochem 2003; 666: 487-98. (5) Tangphatsornruang S., Naconsie M., Thammarongtham C., Narangajavana J. Isolation and characterization of an α-amylase gene in cassava (Manihot esculenta). Journal of Plant Physiology and Biochemistry 2005; 43(9): 821-7. (6) Whitcomb DC., Lowe ME. Human pancreatic digestive enzymes. Journal of Digestive diseases and sciences 2007; 52(1): 1-17. (7) Gupta R., Gigras P., Mohapatra H., Goswami VK., Chauhan B. Microbial α-amylases: a biotechnological perspective. Journal of Process Biochemistry 2003; 38(11): 1599-616. (8) Tanyildizi MS., Özer D., Elibol M. Optimization of α-amylase production by Bacillus sp. using response surface methodology. Journal ofProcess Biochemistry 2005; 40(7): 2291-6.
(9) Jafari-Dehkordi S., Mobini-Dehkordi M., Saffar B. Alpha-amylase enzyme production process optimization and molecular identification of thermophilic bacteria hotspring of Ardebil [Dissertation].Shahrekord: Shahrekord Univ; 2015.
(10) Pandey A., Gupta L. Effect of UV Radiations on Enzyme Kinetics of Extracellular Amylases Isolated from Bacillus subtilis. Journal of Advanced BioTechnology 2011; 11(6): 20-4.
(11) Aynadis T., Tilahun B., Gulelat D. Thermostable alpha-amylase from geothermal sites of Ethiopia (Afar Region): Isolation, purification and characterization. Greener Journal of Biological Sciences 2013; 3(2): 061-73.
(12) Samanta A., Bera P., Khatun M., Sinha C., Pal P., Lalee A., et al. An investigation on heavy metal tolerance and antibiotic resistance properties of bacterial strain Bacillus sp. isolated from municipal waste. Journal of Microbiology and Biotechnology Research 2012; 2(1): 178-89.
(13) Cowan ST., Steel KJ., Barrow G., Feltham R. Cowan and Steel's manual for the identification of medical bacteria. Journal of clinical pathology 2004; 28(7): 600.
(14) Schwalbe R., Steele-Moore L., Goodwin AC. Antimicrobial susceptibility testing protocols. 3rd ed. NewYork: Scientific American; 2007.
(15) Kim J-S., Lee C-H., Chang I-S. Effect of pump shear on the performance of a crossflowmembrane bioreactor. Journal of Water research 2001; 35(9): 2137-44.
(16) Wetzel RG, Hatcher PG., Bianchi TS. Natural photolysis by ultraviolet irradiance of recalcitrant dissolved organic matter to simple substrates for rapid bacterial metabolism. Journal of Limnologyand Oceanography 1995; 40(8): 1369-80.
(17) Smith KC. UV radiation effects on molecules and cells. The Science of Photobiology: Springer2010; 113-42.
(18) Siddique F., Hussain I., Mahmood MS., Ahmed SI., Iqbal A. Isolation and characterization of a highly thermostable αlpha-amylase enzyme produced by Bacillus licheniformis. Pakistan Journal of Agriculture Scienes 2014; 51(2): 309-14.
(19) Moghbeli M., Noshiri H. Isolation of a Native Bacillus licheniformis Amylase Producer from Hot Source of Semnan. Journal of Microbial World 2009; 2(3): 155-160.
(20) Akbari Z., Nayeri H., Behetimaal K. A Study on Effect of different culture media on amylase enzyme production by a native strain of Bacillus subtilis. Biological Journal of Microorganism 2015; 4(15): 99-108.
(21) Parry JM., Cox BS. Photoreactivation of Ultraviolet Induced Reciprocal Recombination, Gene Conversion and Mutation to Prototrophy in Saccharomyces cerevisiae. Journal of general Microbiology 1965; 402(4): 235-41.
(22) Besoain XA., Perez LM., Araya A., Lefever L., Sanguinetti M., Montealegre JR. New strains obtained after UV treatment and protoplast fusion of native Trichodermaharzianum: their biocontrol activity on Pyrenochaetalycopersici. Electronic Journal of biotechnology 2007; 10(4): 605-617.
(23) Ashraf H., Haq I., Iqbal J. Screening of Bacillus licheniformis mutants for improved production of alpha amylase. Pakistan Journal of Bioteny 2001; 40: 518-25.
(24) Lin LL., Chyau CC., Hsu WH. Production and properties of a raw‐starch‐degrading amylase from the thermophilic and alkaliphilic Bacillus sp. TS‐23. Journal of Biotechnology and Applied Biochemistry 1998; 28(1): 61-8.
(25) Sivaramakrishnan S., Gangadharan D., Nampoothiri KM., Soccol CR., Pandey A. α-Amylases from microbial sources–an overview on recent developments. Journal of Food Technology Biotechnology 2006; 44(2): 173-84.
(26) Liu XD., Xu Y. A novel raw starch digesting α-amylase from a newly isolated Bacillus sp. YX-1: purification and characterization. Journal ofBioresource Technology 2008; 99(10): 4315-20.
(27) Konsula Z., Liakopoulou-Kyriakides M. Hydrolysis of starches by the action of an α-amylase from Bacillus subtilis. Journal of Process Biochemistry 2004; 39(11): 1745-9.
(28) Pandey A., Nigam P., Soccol C., Soccol V., Singh D, Mohan R. Advances in microbial amylases. Journal ofBiotechnology and Applied Biochemistry 2000; 31: 135-52.
(29) Rasooli I., Mousavi Gargari S., Sorouri Zanjani R., Darvish Alipoor Astaneh S. Characterization of a Thermotolerant α-amylase Producing Natural Variant of Bacillus Species. Journal of Rafsanjan University of Medical Sciences 2009; 8(4): 303-16. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
آمار تعداد مشاهده مقاله: 4,387 تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 1,023 |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||