تعداد نشریات | 43 |

تعداد شمارهها | 1,658 |

تعداد مقالات | 13,565 |

تعداد مشاهده مقاله | 31,196,666 |

تعداد دریافت فایل اصل مقاله | 12,286,503 |

## کاربرد طرح مرکب مرکزی چرخش پذیر به منظور بهینه سازی تولید آنزیم آلکالین پروتئاز خارج سلولی توسط سویه جداسازی شده جدید باسیلوس پسودوفیرموس MSB4 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

زیست شناسی میکروبی | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

مقاله 4، دوره 5، شماره 20، بهمن 1395، صفحه 17-31 اصل مقاله (868.02 K)
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

نوع مقاله: پژوهشی- انگلیسی | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

شناسه دیجیتال (DOI): 10.22108/bjm.2017.21143 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

نویسندگان | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

ماتیا سادات برهانی^{1}؛ زهرا اعتمادی فر^{*} ^{2}؛ عیسی جرجانی^{3}
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

^{1}دانشجوی دکترای میکروبیولوژی، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

^{2}دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

^{3}استادیار ژنتیک، دانشگاه گنبد کاووس، گلستان، ایران | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

چکیده | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

مقدمه: پروتئازهای قلیایی خارج سلولی با منشا میکروبی، یکی از مهمترین آنزیمهای صنعتی بوده که کاربردهای فراوان در صنایع مختلف دارند. در این مطالعه، تولید پروتئاز قلیایی باکتری باسیلوس پسودوفیرموس MSB4 با استفاده از روششناسی سطح پاسخ افزایش یافت.مواد و روشها: چهار متغیر مستقل موثر، بر اساس نتایج به دست آمده از روش تک عاملی (غلظت زایلوز، غلظت عصاره گوشت، pH و دمای انکوباسیون)، به منظور تجزیه و تحلیل الگوی پاسخ و ساخت مدل با استفاده از روش طرح مرکب مرکزی چرخش پذیر انتخاب شدند. طراحی آزمایش، شامل 30 آزمایش دارای 4 تکرار در نقطه مرکزی می شد و هر متغیر در 5 سطح مختلف بررسی شد. به علاوه حضور ژنهای پروتئازهای قلیایی خارج سلولی در سویه MSB4 با استفاده از PCR ارزیابی شد.نتایج: حداکثر مقدار تولید آنزیم (U/ml 397/185) که حدود 2/2 برابر بیشتر از روش تک عاملی و 7/3 برابر بیشتر از شرایط غیر بهینه است، بر طبق نتایج طرح مرکب مرکزی چرخش پذیر با استفاده از 3 درصد عصاره گوشت، اسیدیته 9 و دمای 37 درجه سانتیگراد به دست آمد. همچنین ژن های sub I, II و apr با سایز مورد انتظار (به ترتیب با 319، 486 و 194 زوج باز) مسؤول متالوپروتئاز و سرین پروتئاز قلیایی خارج سلولی در سویه MSB4 با استفاده از PCR تشخیص داده شدند.بحث و نتیجهگیری: نتایج آزمایشگاهی به خوبی با مدل به دست آمده سازگاری دارند (9982/0 Adj R^{2}:) و این مدل توانایی زیادی برای پیش بینی متغیر پاسخ برای مشاهدات جدید خواهد داشت (9967/0Pred R^{2}: ). نتایج این مطالعه نشان داد که روش تک عاملی و سطح پاسخ به ترتیب روش مفیدی برای غربالگری و بهینهسازی تولید پروتئاز در سویه MSB4 بودند | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

کلیدواژهها | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

باسیلوس پسودوفیرموس MSB4؛ پروتئاز قلیایی؛ روش تک عاملی؛ روششناسی سطح پاسخ؛ طرح مرکب مرکزی چرخش پذیر | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

اصل مقاله | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Microbial alkaline proteases (EC.3.4.21-24, 99) are one of the most commercially important industrial enzymes because of their stability and activity under harsh conditions such as high temperatures, high pH and in the presence of surfactants or oxidizing agents (1). Currently, the major proportion of commercially available alkaline proteases such as Subtilisin obtained from The production of microbial extracellular proteases is influenced by the incubation time, pH, temperature, carbon and nitrogen sources. Even small improvements in biotechnological enzyme production processes have been significant for commercial success (6). A number of optimization methods could be used for this purpose. Statistical approaches offer ideal ways for optimization studies of enzyme production. Time consuming, requirement of more experimental data sets and missing the interactions among parameters are some of the obstacles in the conventional optimization procedures like ‘one-factor at a time’ (OFAT) (7). On the other hand, statistical methods have some advantages basically due to utilization of fundamental principles of statistics, randomization, replication and duplication (8). Response surface methodology (RSM) is one of the useful methods in the optimization procedures, mainly developed based on the central composite design (CCD). RSM is a collection of mathematical and statistical techniques that are applicable for modeling and analysis where the objective is to optimize a response and the response is influenced by several variables (9). The present study aimed to find the optimum medium component and physicochemical parameters which influence alkaline protease production by
The inoculum was prepared by adding a loop full of pure culture into 5 ml of sterile pre-culture medium
Table 1- Oligonucleotides used as primers for detection of genes for alkaline metallopeptidases (
The mathematical relationship of the independent variables and the response (MSB4 alkaline protease production) can be calculated with a quadratic (second degree) polynomial equation: Y=b where Y is predicted value, b
Table 2- Experimental range and levels of the independent variables in terms of actual and coded factors
Fig. 1- Phylogenetic tree showing the position of
Fig. 2- Gel electrophoresis of PCR products with the primers specific for the genes for bacterial serine peptidases (
Fig. 3- Kinetics of growth and protease production of
Fig. 4- Effect of pH and temperature on protease production of
In the present study, the effect of organic and inorganic nitrogen sources on protease production was examined and the results compared with those of the initial production medium which had skim milk as the only carbon and nitrogen source (Fig. 5). Beef extract proved to be the best nitrogen source for protease production by MSB4 (83.24 U/ml) which increased enzyme production by 65.69%. The enzyme production was reduced in the presence of ammonium chloride, sodium nitrate and urea. These results were in agreement with the previous studies which reported that complex nitrogen sources are better for protease production and enzyme synthesis was repressed by rapidly metabolizable nitrogen sources such as amino acids or ammonium ion (15, 21 & 22). However, the influences of both carbon and nitrogen sources were statistically significant (
Fig. 5- Effect of different carbon and nitrogen source on protease production of
Using the experimental data, the polynomial model for enzyme production yield (Y) was regressed only by considering the significant terms. The regression coefficients were calculated and the data were fitted to a second-order polynomial equation. The response, enzyme production, was expressed in terms of the following regression equation: Enzyme activity (U/ml)= 172.34 + (0.36*X
Table 3- Rotatable CCD matrix for four variables with actual and predicted protease activity
in which X
The statistical significance was evaluated by performing F-test and ANOVA analysis as shown in Table 4. The Model
Table 4- Regression analysis for enzyme production from
Std. Dev. (0.77); Mean (148.23); C.V.% (0.52);PRESS (30.81); R-Squared (0.9991); Adj R-Squared (0.9982); Pred R-Squared (0.9967); Adeq Precision (124.606)
The fit of the model was also checked by the co-efficient of determination (R 3D response surface plots and two dimensional contour plots were generated by plotting the response, Overall, the RSM results revealed that pH, temperature and concentration of carbon and nitrogen sources had a significant effect on enzyme production, which is in agreement with the results of OFAT strategy. According to the CCD results, the highest protease production was achieved at 37ºC, pH 9, 0% w/v xylose, 3% w/v beef extract (185.39 U/ml), which was 2.2 times higher than that of the OFAT method. Because each organism and even each strain have its own nutritional requirement for maximum enzyme production, the optimization of culture conditions of each strain is unique. There is scarce information about the statistical optimization of protease production by using other strains of
Fig. 6- Contour plots and 3D response surface curves of enzyme activity (U/ml) by
Fig. 7- Normal plot of residual for protease activity (U/ml) by
Table 5- Validation of quadratic model within the design space
Fig. 8- Perturbation plot of enzyme activity by
A significant improvement (two-fold) in the production of alkaline protease by MSB4 was accomplished using CCD with respect to OFAT strategy. According to the agreements between OFAT and RSM results, regarding the significant effects of the variables tested in the present study, the OFAT strategy was a useful screening method for the selection of effective variables. In addition, RSM results showed that the enzyme production was enhanced using different values of variables with respect to OFAT results. However, maximum protease activity (185.397 U/ml) was low when compared with the protease activity of many
This research was supported by the University of Isfahan. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

مراجع | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

(1) Haki G., Rakshit S. Developments in industrially important thermostable enzymes: a review. Bioresource technology 2003; 89(1): 17-34.
(2) Haddar A., Bougatef A., Agrebi R., Sellami-Kamoun A., Nasri M. A novel surfactant-stable alkaline serine-protease from a newly isolated Bacillus mojavensis A21. Purification and characterization. Process Biochemistry 2009; 44(1): 29-35.
(3) Lotfi Mandana, Beheshti Maal Keivan, Hashem N. Evaluation of alkaline protease production and optimization of culture medium by Yarrowia lipolytica. Biological Journal of Microorganisms 2015; 4(14):61-70.
(4) Veloorvalappil NJ., Robinson BS., Selvanesan P., Sasidharan S., Kizhakkepawothail NU., Sreedharan S., Sailas B. Versatility of microbial proteases. Advances in Enzyme Research 2013; 1 (3): 39-51.
(5) Gupta R., Ramnani P. Microbial keratinases and their prospective applications: an overview. Applied Microbiology and Biotechnology 2006; 70 (1): 21-33.
(6) Bhunia B., Basak B., Dey A. A review on production of serine alkaline protease by Bacillus spp. Journal of Biochemical Technology 2012; 3:448-457.
(7) Singh SK., Singh SK., Tripathi VR., Khare, SK., Garg, SK. Comparative one-factor-at-a-time, response surface (statistical) and bench-scale bioreactor level optimization of thermoalkaline protease production from a psychrotrophic Pseudomonas putida SKG-1 isolate. Microbial Cell Factories 2011; 10: 114-127.
(8) Oskouie SFG., Tabandeh F., Yakhchali B., Eftekhar F. Response surface optimization of medium composition for alkaline protease production by Bacillus clausii. Biochemical Engineering Journal 2008; 39(1): 37-42.
(9) Baş D., Boyacı İH. Modeling and optimization I: Usability of response surface methodology. Journal of Food Engineering 2007; 78(3): 836-845.
(10) Tari C., Genckal H., Tokatlı F. Optimization of a growth medium using a statistical approach for the production of an alkaline protease from a newly isolated Bacillus sp. L21. Process Biochemistry 2006; 41(3): 659-665.
(11) Vaishnav D., Suthar J., Oza T., Dave, G., Sheth, N., Sanghvi, G. A statistical approach for the enhanced production of thermostable alkaline protease showing detergent compatibility activity from Bacillus circulans. Biocatalysis and Biotransformation 2014; 32:151-160.
(12) Jiang H, Dong H, Zhang G, Yu B, Chapman LR, Fields MW. Microbial diversity in water and sediment of Lake Chaka, an athalassohaline lake in northwestern China. Applied and environmental microbiology 2006; 72(6): 3832-45.
(13) Bach HJ., Hartmann A., Schloter M., Munch J. PCR primers and functional probes for amplification and detection of bacterial genes for extracellular peptidases in single strains and in soil. Journal of Microbiological Methods 2001; 44(2): 173-182.
(14) Cupp-Enyard C. Sigma's non-specific protease activity assay-casein as a substrate. Journal of visualized experiments 2008; 899-890.
(15) Sen S., Veeranki VD., Mandal B. Effect of physical parameters, carbon and nitrogen sources on the production of alkaline protease from a newly isolated Bacillus pseudofirmus SVB1. Annals of microbiology 2009; 59: 531-538.
(16) Perchat S., Dubois T., Zouhir S., Gominet, M., Poncet, S., Lemy, C., et al. A cell–cell communication system regulates protease production during sporulation in bacteria of the Bacillus cereus group. Molecular microbiology 2011; 82: 619-633.
(17) Gupta R., Beg Q., Khan S., Lorenz, P. An overview on fermentation, downstream processing and properties of microbial alkaline proteases. Applied microbiology and biotechnology 2002; 60: 381-395.
(18) Chi Z., Ma C., Wang P., Li, HF. Optimization of medium and cultivation conditions for alkaline protease production by the marine yeast Aureobasidium pullulans. Bioresource Technology 2007; 98:534-538.
(19) Patel R., Dodia M., Singh SP. Extracellular alkaline protease from a newly isolated haloalkaliphilic Bacillus sp.: Production and optimization. Process Biochemistry 2005; 40: 3569-3575.
(20) Mehrotra S., Pandey P., Gaur R., Darmwal, NS. The production of alkaline protease by a Bacillus species isolate. Bioresource Technology 1999; 67:201-203.
(21) Naidu KSB., Devi KL. Optimization of thermostable alkaline protease production from species of Bacillus using rice bran. African Journal of Biotechnology 2005; 4:724-726.
(22) Shafee N., Aris SN., Rahman RA., Zaliha, RN., Basri, M., Salleh, A B. Optimization of environmental and nutritional conditions for the production of alkaline protease by a newly isolated bacterium Bacillus cereus strain 146. Journal of Applied Sciences Research 2005; 1: 1-8.
(23) Richa K., Bose H., Singh K., Karthik, L., Kumar, G., Bhaskara Rao, KV. Response surface optimization for the production of marine eubacterial protease and its application. Research Journal of Biotechnology 2013; 8:78-85
(24) Abdel-Fattah Y, El-Enshasy HA, Soliman NA, El-Gendi H. Bioprocess development for production of alkaline protease by Bacillus pseudofirmus Mn6 through statistical experimental designs. Journal of Microbiology and Biotechnology 2009; 19(4): 378-86.
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

آمار تعداد مشاهده مقاله: 1,342 تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 1,404 |