بررسی تنوع باکتریایی غالب در فلور باکتری‌های هوازی و بی‌هوازی گل‌فشان‌های جنوب ‌شرقی دریای‌ خزر

مقدمه.

به‌دلیل ارتباط بین گل‌فشان‌ها با ذخایر نفت وگاز، طی چند دهۀ اخیر شرکت‌های تحقیقاتی نفت جهت دست‌یابی به مخازن هیدروکربنی در اعماق اقیانوس‌ها و دریاها در پی یافتن محل فعالیت این پدیده‌های زمین‌شناسی بوده‌اند. کاوش  متخصصان شرکت‌های نفتی کشورهای حاشیۀ دریای خزر و دریای سیاه در بستر دریا، بیانگر این ادعاست. همگام با کاوشگران صنعت نفت، متخصصان سایر علوم از جمله میکروبیولوژی با بهره‌گیری ازاطلاعات به‌دست‌آمده دامنۀ ‌فعالیت‌های پژوهشی خود را گسترش دادند و در این زمینه به نتایج قابلِ‌توجهی دست یافته‌اند.

تنوع میکروبی در گل‌فشان‌هایی که تاکنون شناخته شده‌اند، بیشتر از نوع بی‌هوازی)3-1) و کمتر از نوع هوازی (1) است. متابولیسم میکروبیدر نمونه‌های به‌دست‌آمده از گِل‌فشان‌ها از نوع متانوتروف (2) یا احیاکنندۀ سولفات (3) است. حدود 86درصد گازهای خروجی گِل‌فشان‌ها متان و به‌مقدار کمتر دی‌اکسیدکربن و نیتروژن است. میکروب‌های موجود در این مکان‌ها از سوبستراهای کربنی که سیال هیدروکربنی هستند، به‌شکل تخمیری استفاده می‌کنند (4). بررسی رسوب گل‌فشان‌های فعال سه فیلوتیپ پروتئوباکتری‌ها، اکتینوباکتری‌ها و فوزوباکتری‌ها را نشان داده است. پس از مقایسۀ داده‌ها در  بانک ژن NCBI این نتایج حاصل شد: باکتری‌های غیرقابلِ‌کشت، باکتری‌های ناشناخته،Clostridium thiosulfatireducens، Frigovirgula patagoniensis و Pseudomonas aeruginosaشناسایی شدند.کلوستریدیوم‌ها با تشکیل سولفات رابطه داشتند؛ در مقالات متعدد اعلام شده است که سویه‌های جداشده از گل‌فشان در تولید سوخت‌های میکروبی کاربرد دارند(5).با هدف جداسازی باکتری‌های احیاکنندۀ سولفات، نمونه‌های برگرفته از گل‌فشان رشته‌کوه اَپناین شمالی[1] واقع در ایتالیا در محیط غنی کشت داده شدند. میکروب‌های جداسازی‌شده براساس 16S rRNAشامل Desulfovibrio psychrotoleransوClostridium thiosulfatireducensاست که ممکن است پروتئین‌هایی با منشأ میکروبی را تخمیر کنند (5-7). گونۀ متعلق به جنس کلوستریدیوم که از این گل‌فشان جدا شده، رکسارسون یا آرسنیک‌اسید را طی فرایند تغییر و تبدیل زیستی[2] به شکل آرسنیک معدنی آزاد می‌کند (8). به‌طور کلی هدف از انجام پژوهش حاضر بررسی تنوع میکروبی به‌خصوص انواع باکتری‌های هوازی و بی‌هوازی اختیاری موجود در سه گل‌فشان مستقر در جنوب شرقی دریای خزر است. نتایج حاصل از آن می‌تواند منبع مناسبی برای سایر پژوهش‌های مشابه در آینده باشد چرا که تاکنون در این زمینه در ایران مطالعۀ مشابهی انجام نشده است.

مواد و روش‌ها.

تعیین نقاط نمونه‌برداری: نمونه‌برداری از سه گل‌فشان نفتلیچه، اینچه‌برون و قارنیاریق انجام شد. در شکل شماره 1 موقعیت جغرافیایی گل‌فشان‌ها نشان داده شده است.

شکل1- موقعیت جغرافیایی سه گل‌فشان بررسی‌شده در حاشیه دریای خزر

نمونه‌برداری با دو هدف بررسی حضور انواع هوازی و بی‌هوازی انجام شد. به ‌این منظور نمونه‌برداری از سطح، مواد میانه، مناطق عمقی گل‌ولای، آب‌های غیرسطحی، رسوبات عمیق گل‌فشان و بستر دریا انجام شد. نمونه‌ها درون فلاسک‌های با دمای حدود 4 درجه سانتی‌گراد در مدت 24 ساعت از منطقۀ نمونه‌برداری در گمیشان استان گلستان به آزمایشگاه محمودیۀ تهران منتقل شدند. برای انتقال نمونه‌های بی‌هوازی از ظروف خاص رشد بی‌هوازی حاوی گازپک[3] استفاده شد.

کشت نمونه‌ها و جداسازی باکتری‌ها: به‌منظور به‌دست‌آوردن میکروب‌های متنوع هوازی و بی‌هوازی اختیاری موجود در گل‌فشان، لازم است از انواع مناسب محیط‌های کشت میکروبی با درنظرگرفتن pH محیط گل‌فشان و میزان نمک آن استفاده شود. به‌منظور کشت نمونه‌های هوازی، جداسازی به‌روش پورپلیت انجام شد. پس از خالص‌سازی تک‌کلنی‌ها با کشت متوالی، رنگ‌آمیزی گِرم انجام شد. پس از مشاهده و تشخیص باسیل‌های گرم‌مثبت و اسپوردار، باسیل‌های گرم‌منفی و کوکسی‌های گرم‌مثبت، آزمایش‌های تشخیصی شامل اندول، لستیناز، احیای نیترات، کاتالاز، اوره‌آز، هیدرولیز ژلاتین، اکسیداز، MR-VP، دکربوکسیلاز، KOH، تخمیر مواد قندی، هیدرولیز نشاسته، هیدرولیز کازئین، محیط کشتOF، محیط آبگوشت 7درصد نمک، محیط TSI و محیط سیمون سیترات آگار برای شناسایی آن‌ها تا حد جنس یا گونه انجام شد. آزمایش‌های بیوشیمیایی و استفاده از محیط‌های اختصاصی برای افتراق انواع باکتری‌های گل‌فشان با تنظیم میزان نمک و pH انجام شد(5).

برای جداسازی باکتری‌های بی‌هوازی از محیط کشت‌های حاوی پودر جگر و تیوگلیکولاتبراث تهیه‌شده طبق دستورالعمل استاندارد کشت باکتری‌های بی‌هوازی استفاده شد. برای تهیۀ پلیت،30 گرم بر لیتر از محیط کشت و 15 گرم بر لیتر آگار با یکدیگر مخلوط شد، pH  مخلوط بر روی 1/7 تنظیم شد و در دمای 121 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 15 دقیقه اتوکلاو شد. محیط‌های براث روزانه به‌طور مرتب تا 7 روز مشاهده و بررسی شدند(6).

پس از بررسی اولیه محیط‌های کشت، با توجه به شمارش بالای میکروبی نمونه، رقیق‌سازی انجام شد و از غلظت ^8-10 تا ^10-10، رقت متوالی تهیه شد. به‌منظور رشد باکتری‌های بی‌هوازی‌اختیاری پلیت‌ها در جار بی‌هوازی قرار داده شدند و در دو دمای 30 و 37 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شدند. با تجدید کشت و اطمینان از خلوص سویه‌ها، بررسی ملکولی کلنی‌های خالص انجام شد.

شناسایی مولکولی باکتری‌های هوازی: سویه‌های خالص‌شده از نظر ویژگی‌های میکروسکوپی، ماکروسکوپی، فیزیولوژیکی وتست‌های مختلف بیوشیمیایی دسته‌بندی شدند. پس از حذف سویه‌های تکراری و آن‌هایی که تکثیر چندانی نداشتند، تعداد 17 سویه برای بررسی فیلوژنتیکی انتخاب شد. برای استخراج DNA  سویه‌های منتخب، از کیت MBST[4] متعلق به شرکت روبین‌طب‌گستر مخصوص باکتری‌های گرم‌منفی و گرم‌مثبت استفاده شد.

ابتدا هریک از باکتری‌های جداشده در محیط کشت  LB در دمای 37 درجه سانتی‌گراد، به‌مدت 18 ساعت نگهداری شد. سپس نمونۀ موردِنظر به لوله‌های اپندورف 2 میلی‌لیتری انتقال داده شد و برای 2 دقیقه سانتریفیوژ (rpm13000 در دمای37 درجه سانتی‌گراد) شد. سپس مایع رویی دور ریخته شد و این کار تا زمان به‌دست‌آوردن مقدار مناسب از رسوب باکتری ادامه یافت. مراحل بعدی طبق پروتکل کیت استخراج ژنوم MBST انجام گرفت.

به‌منظور تکثیر ژن 16S rRNAدر 17 سویۀ منتخب هوازی از پرایمرهای عمومی تهیه‌شده از شرکت روبین‌طب‌گستر، به ترتیب زیر برای انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز استفاده شد(7).

Fd: 5'  AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3'

Rd: 5'  TAA GGA GGT GAT CCA GCC   3'

FM: 8F :  5' AGAGTTGGATCCTGGCTCAG   3'

RM: 1541R:  5' AAGGAGGTGATCCAGCCGCA3'

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در حجم نهایی 25 میکرولیتر انجام شد. به‌منظور تکثیر ژن  16S rRNAبا استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز آب دوبار تقطیر استریل (3/18 میکرولیتر)، بافر با غلظت 1X(5/2 میکرولیتر)، dNTPs (1میکرولیتر)، پرایمرهای رفت و برگشت هرکدام به‌مقدار ۱ میکرولیتر، DNA ژنومی (1 میکرولیتر)، آنزیم DNATaq پلی‌مراز (2/0 میکرولیتر) استفاده شد.

مراحل انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز برای واسرشت اولیۀ دمای 95 درجه سانتی‌گراد به‌مدت60 ثانیه و 30 چرخۀ تکرارشونده شامل واسرشت با دمای 95 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 60 ثانیه، اتصال با دمای 50 درجه سانتی‌گراد و زمان 30 ثانیه و سنتز با دمای 72 درجه سانتی‌گراد و زمان 60 ثانیه و پس از پایان 30 چرخه برای سنتز نهایی دمای 72 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 10 دقیقه تنظیم شد.

پس از خالص‌سازی محصول واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، محصول نهایی توسط شرکت کیاژن توالی‌یابی شد. نتایج توالی‌یابی با استفاده از نرم‌افزارChromas Pro ویرایش و در فرمتFASTA  ذخیره شد و به‌کمک نرم‌افزارBLAST در پایگاه دادۀ  NCBI، با سایر داده‌های مندرج در GenBank مقایسه و درصد تشابه سویه‌های به‌دست‌آمده با انواع شناخته‌شدۀ آن‌ها تعیین شد و درپایان تحلیل فیلوژنتیک سویه‌ها با استفاده از نرم‌افزارMEGA  (ویرایش چهارم) و درخت فیلوژنتیک با الگوریتم neighbor-joining رسم شد.

شناسایی مولکولی باکتری‌های بی‌هوازی: تودۀ سلولی در محیط کشت حاوی پودر جگر و تیوگلیکولات براث به‌وسیلۀ سانتریفیوژ از محیط‌کشت مایع جدا شد و DNA ژنومی مشابه روش‌های استفاده‌شده برای باکتری‌های هوازی خارج شد. برای نمونه‌های بی‌هوازی 2 پرایمر طراحی شد. براین‌اساس سویه‌هایی که با پرایمر  Aواکنش تکثیری داشتند با مشخصۀ akh.1-3 و نمونه‌هایی که با پرایمرB تکثیر یافتند با مشخصۀ akh.4,5 نام‌گذاری شدند.

به‌منظور تکثیر ژن16S rRNA  با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بافر با غلظت 1X در ترکیب نهایی MgCl₂ با غلظت mM5/1، dNTPs 200 میکرومول، پرایمرهای رفت و برگشت (D1) هرکدام به‌مقدار 5 فمتومول، DNA ژنومی 5 میکرولیتر، آنزیم DNATaq پلیمراز به‌میزان 1 میکرولیتراستفاده شد(7).

A:

FD1: 5' AGA GTT TGA TCC TGG CTT AG 3'

RD1: 5' TAA GGA GGT GAT CCA GCC 3'

B:

9F:5̕-AAG AGT TTG ATC ATG GCT-3̕

1541R:5̕-AGG AGG TGA TCC AAC CGC-3̕

مراحل انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز نمونه‌های بی‌هوازی، با واسرشت اولیه دمای 95 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 60 ثانیه و 30 چرخه تکرارشونده شامل واسرشت با دمای 95 درجه‌ سانتی‌گراد به‌مدت 60 ثانیه، اتصال با دمای 50 درجه ‌سانتی‌گراد و زمان 30 ثانیه و سنتز با دمای 72 درجه ‌سانتی‌گراد و زمان 90 ثانیه و پس از پایان یک چرخه برای سنتز نهایی دمای 72 درجه ‌سانتی‌گراد به‌مدت 10 دقیقه تنظیم شد.

محصول واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در پلاسمید pTZ57RT/A کلون شد و کلونی‌های سفید حاوی DNA خارجی روی پلیت حاوی IPTG و X-GAL  انتخاب و کتابخانۀ ژنی برای  ژن16S rRNA ساخته شد. سپس از کتابخانۀ موجود چند کلون انتخاب شد و پس از تأیید حضور قطعۀ خارجی توسط واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از پرایمرهای رفت و برگشتD1 در کلون‌ها از 5 کلون با استفاده از کیت استخراج پلاسمید، DNA پلاسمیدی خارج شد و با پرایمرهایM13 fwd و M13Rev  از دو طرف تعیین توالی شد.

توالی‌های حاصل با توالی‌های موجود در پایگاه دادۀ NCBI بخش توالی‌های 16S rRNAتوسط نرم‌افزار BLAST مقایسه شد و توالی‌های انتهای´3 و´ 5 آن بررسی و آنالیز شد و توالی کامل ژن 16S rRNA به‌دست آمد. توالی مربوط به هر کلون در پایگاه دادۀ EZtaxon از نظر شباهت با توالی‌های 16S rRNA موجود در بانک‌های اطلاعات زیستی بررسی شد. توالی 16S rRNA سویه‌های ثبت‌شده در پایگاه داده‌های زیستی که بیشترین قرابت را با توالی ژن مربوطه داشتند، برای رسم درخت فیلوژنی با استفاده از نرم‌افزار MEGA (ویرایش پنجم) استفاده شد.

آنالیز عنصری نمونه‌های گل‌فشان: برای آنالیز عنصری نمونه‌های جمع‌آوری‌شده از سه گل‌فشان با روش شیمی تر و به‌کمک دستگاه  ICP-OES (پلاسمای جفت‌شدۀ القایی نشرنوری) اقدام شد.
نتایج.

باکتری‌های هوازی: در این پژوهش از میان محیط‌های استفاده‌شده برای نمونه‌های هوازی، محیط نوترینت آگار و BHI آگار کارایی بالاتری در جداسازی میکروب‌ها با استفاده از روش رقیق‌سازی متوالی داشتند. در محیط‌های ذکرشده تعداد کلنی‌های بیشتری رشد کردند که می‌تواند بیانگر تطابق بیشتر این محیط‌ها با شرایط فیزیکوشیمیایی گل‌فشان‌ها است. اکثر کلنی‌های به‌دست‌آمده به‌رنگ سفید کرم و یا حتی بی‌رنگ بودند. همچنین در میان سویه‌های کروی‌شکل، کلنی‌هایی به‌رنگ زرد و نارنجی مشاهده شد. از نکات قابلِ‌توجه رشد سریع اکثر کلنی‌ها به‌مدت 48-24 ساعت بود. در محیط‌های مک‌کانکی آگار وENDO Agar هیچ‌گونه کلنی ظاهر نشد. در محیط سابورودکستروزآگار به‌جای رشد قارچ وکپک، کلنی‌های باکتریایی به‌رنگ‌های قرمز، صورتی، سبز، قهوه‌ای، سیاه و بنفش مشاهده شد که اکثریت دارای اشکال باسیلی و چندشکلی بودند. در مجموع، 127 سویۀ باکتری از نمونه‌های هوازی جدا شد. بیشترین تعداد باکتری‌های هوازی از منطقۀ گل‌فشان قارنیاریق جدا شد که معادل 89 سویه بود و حدود 72درصد کل جدایه‌ها را شامل می‌شود. در شکل 2 نمودار مقایسه‌ای تعداد باکتری‌های هوازی جداشده از گل‌فشان‌ها رسم شده است.

شکل 2- مقایسۀ تعداد سویۀ باکتری هوازی جداشده از 3 گل‌فشان و ذکر نسبت آن‌ها (%)

از میان جدایه‌های به‌دست‌آمده از محیط‌های کشت، تفکیک جدایه‌ها براساس رنگ‌آمیزی گرم و مشاهدۀ لام میکروسکوپی نشان داد که گل‌فشان قارنیاریق دارای فراوانی باکتریایی بیشتری در میان سایر مناطق گل‌فشانی است.

تمامی جدایه‌ها از نظر شکل و ویژگی‌های کلنی، واکنش گِرم و شکل و آرایش میکروسکوپی سلول، شکل و موقعیت اسپور، حرکت، واکنش کاتالاز و اکسیداز بررسی شدند. در پایان بررسی لام و مشاهدۀ واکنش KOH 3% برای جدایه‌ها نشان داد که درصد فراوانی جدایه‌ها به این ترتیب است: باسیل‌های گرم‌مثبت 45درصد، باسیل‌های گرم‌منفی 36درصد و کوکوس‌های گرم‌مثبت 19درصد. همچنین مشاهدۀ لام نشان داد که باسیل‌های گرم‌مثبت اسپوردار با تعداد 46 عدد (37درصد) بیشترین فراوانی را در میان جدایه‌ها دارند. از نظر واکنش کاتالاز اکثر باسیل‌های گرم‌مثبت و کوکوس‌های جداشده، کاتالازمثبت و اکسیدازمثبت(بیشتر در باسیلوس‌ها) بودند.

براساس ویژگی‌های فنوتیپی، جدایه‌های بی‌هوازی به چندین گروه تقسیم شدند. با توجه به آزمایش‌های بیوشیمیایی از بین سویه‌های گرم‌منفی اکثراً جنس‌های سودوموناس، سالمونلا و سیتروباکتر و نیز اشرشیا کلی مشاهده شد و از بین کوکوس‌ها از استافیلوکوک‌ها بیشتر نمونه‌ها مربوط به استافیلوکوک اورئوس و از استرپتوکوک‌ها بیشتر نمونه‌ها مربوط به انتروکوک بود. ویژگی‌های ریخت‌شناختی، فیزیولوژیک و بیوشیمیایی سویه‌های منتخب در جدول‌های 1 و 2 نشان داده شده است.

جدول 1- خصوصیات ظاهری 17 سویۀ باکتری‌های هوازی جداشده

جدول 2-آزمایش‌های تشخیصی مربوط به 17 سویۀ باکتری هوازی جداشده

شکل 3- رنگ‌آمیزی گرم برخی از نمونه‌های باکتری‌های گل‌فشان‌ها. اشکال باسیلی غالب هستند.

باکتری‌های بی‌هوازی اختیاری: نمونه‌های بی‌هوازی اختیاری در محیط‌های حاوی پودر جگر و تیوگلیکولات براث به‌طور جداگانه بررسی شدند. کدورت محیط تیوگلیکولات بیشتر از محیط حاوی پودر جگر بود و این می‌تواند نشان‌دهندۀ تعداد باکتری بیشتری در این محیط باشد. به‌همین‌دلیل نمونه‌های کشت‌شده در محیط تیوگلیکولات براث برای رنگ‌آمیزی گرم و همچنین آنالیز مولکولی انتخاب شدند. رنگ‌آمیزی گرم نمونه‌های بی‌هوازی اختیاری اشکال باسیلی را بیشتر از سایر شکل‌ها نشان داد. به‌علت محدودیت در کشت باکتری‌های بی‌هوازی و همچنین آزمایش‌های بیوشیمیایی در رابطه با این باکتری‌ها پس از طی زمان استاندارد کشت آن‌ها، درخت فیلوژنتیکی برای تشخیص سویه‌های بی‌هوازی اختیاری موردِنظر رسم شد.

مشاهدات میکروسکوپی: برای بررسی شکل‌های باکتریایی پس از رنگ‌آمیزی گرم نمونه‌ها ازطریق میکروسکوپ نوری مشاهده شدند که در شکل3 نشان داده شده است.

شناسایی سویه‌های منتخب: نمونه‌های هوازی: از بین 17 سویه منتخب هوازی فقط 11 نمونه با موفقیت توالی‌یابی شد. جدول 3 میزان شباهت هر سویه با نزدیک‌ترین باکتری شناخته‌شده را نشان می‌دهد.

نمونه‌های بی‌هوازی: پس از انجام آزمایش‌های مولکولی، توالی‌یابی و بلاست نمونه‌های کشت‌شده در محیط‌های بی‌هوازی، 5 سویۀ بی‌هوازی اختیاری شناسایی شد. جدول 4 میزان شباهت هر سویه با نزدیک‌ترین باکتری شناخته‌شده را نشان می‌دهد.

جدول3- میزان شباهت سویه‌های منتخب هوازی با نزدیک‌ترین گونۀ ثبت‌شده در پایگاه NCBI

جدول4- میزان شباهت سویه‌های بی‌هوازی با نزدیک‌ترین گونۀ ثبت‌شده در پایگاه NCBI

رسم درخت فیلوژنتیکی: از بین سویه‌های به‌دست‌آمده از نمونه‌های هوازی، به‌صورت انتخابی درخت فیلوژنتیکی برای سویۀ B1a رسم شد که موقعیت این سویه در شکل شماره 4 نشان داده شده است.

از بین سویه‌های بی‌هوازی اختیاری هر 5 سویه توالی یابی شدند و برای آن‌ها درخت فیلوژنتیکی رسم شده است که در شکل شماره 5 رسم شده است.

آنالیز عنصری سه گل‌فشان: برای آگاهی از ماهیت شیمیایی نمونه‌های بررسی‌شده سه گل‌فشان، ترکیبات آن‌ها از نظر کاتیون‌ها وآنیون‌ها آنالیز عنصری انجام شد که نتایج این بررسی در جدول 4 آورده شده است.

شکل 4- درخت فیلوژنتیکی سویۀ B1a

شکل 5- درخت فیلوژنتیکی مربوط به 5 سویۀ بی‌هوازی اختیاری

جدول4- ترکیبات موجود در سه گل‌فشان