جداسازی و شناسایی باکتری‌های تجزیه کننده گازوئیل از خاک‌های آلوده به مواد نفتی در استان خوزستان

مقدمه.

امروزه آلودگی نفتی به‌عنوان یکی از خطرناک‌ترین آلودگی‌های محیطی شناخته شده است. گازوئیل که یکی از محصولات عمدۀ نفت خام است، منبع عمده آلودگی محیط زیست به شمار می‌رود که می‌تواند آثار خطرناک زیستی بر محیط اطراف اعمال کند. گازوئیل می‌تواند در نتیجۀ فعالیت‌های انسانی در انتقال از منابع به محل‌های مصرف، پالایش، ذخیره‌سازی و همچنین استفادۀ نادرست آن توسط مصرف‌کننده‌ها و فعالیت‌های کشتیرانی وارد محیط شود. از تقطیر نفت مازوت مایعی حاصل می‌شود که عمدتاً جهت روشن‌کردن موتورهای دیزلی به کار می‌رود؛ به این سوخت گازوئیل گویند. محدودۀ هیدروکربن‌های گازوئیل بین C₁₁-C₂₅ و دامنۀ تقطیر آن 1۸0 تا380 درجه سانتی‌گراد است. گازوئیل از 3 گروه ساختاری اصلی هیدروکربنی تشکیل شده است که شامل آلکان‌ها، سیکلوآلکان‌ها و ترکیبات اروماتیک است. نسبت این ترکیبات در گازوئیل‌های مختلف، متفاوت است (1 و 2).

بیشتر ترکیبات موجود در گازوئیل برای سیستم‌های زیستی مضر هستند. نشت گازوئیل بر روی زمین‌های کشاورزی، رشد گیاهان را کاهش می‌دهد که به‌دلیل اثر سمیت مستقیم بر گیاهان و کاهش جوانه‌زنی که در نتیجۀ عدم تهویۀ مناسب خاک است صورت می‌گیرد (3). پیامد آن حذف پوشش گیاهی، ازبین‌رفتن پدیدۀ فتوسنتز، فرسایش خاک، خالی‌شدن ساختار اجتماعات گیاهی، افزایش نفوذپذیری خاک نسبت به آلاینده‌ها و در آخر، آلودگی منابع آب‌های سطحی و زیرزمینی است. آلاینده‌های موجود در خاک می‌توانند وارد زنجیرۀ غذایی شوند و سلامت حیوان و انسان را با خطر جدی مواجه سازند. گازوئیل نسبتاً در آب محلول است و می‌تواند در بافت‌ها تجمع پیدا کند (3).

تعداد زیادی از باکتری‌ها، قارچ‌های رشته‌ای و مخمرها می‌توانند سوبستراهای هیدروکربنی گازوئیل را تجزیه کنند. ترکیبات هیدروکربنی باید قبل از تجزیه‌شدن وارد سلول شوند. با این حال، تماس مستقیم بین هیدروکربن‌ها که ماهیت آب‌گریز دارند و غشای سلول که بخش‌های آب‌گریز دارد بدلیل نیروی دافعه دو ترکیب آب گریز ممانعت می شود. تجزیۀ هیدروکربن‌ها توسط میکروب‌ها تا حد زیادی توسط فراهمی‌زیستی هیدروکربن‌ها، تحتِ‌تأثیر قرار می‌گیرد. خصوصیات شیمیایی هیدروکربن‌ها، فراهمی‌زیستی آن‌ها را تعیین می‌کند. برای تجزیه، هیدروکربن‌ها ابتدا باید توسط میکروب‌های تجزیه‌کننده جذب شوند که به معنای فرایند انتقال غشاگذر است. جذب دارای دو مرحله است: ارائۀ هیدروکربن‌ها به میکروب‌ها و انتقال غشاگذر. ترکیبات آلی به‌طور طبیعی برای جذب سوبسترا به‌شکل محلول هستند؛ درحالی‌که جذب بر روی ذرات خاک یک مانع برای تجزیه ایجاد می‌کند (4). مکانیسم‌های متفاوتی توسط گونه‌های تجزیه‌کننده برای افزایش جذب هیدروکربن‌ها وجود دارد؛ برای مثال ترشح بیوسورفاکتانت‌ها یا امولسیون‌کننده‌ها. بیوسورفاکتانت‌ها مولکول‌های فعال سطحی هستند که می‌توانند به‌عنوان پراکنده‌سازها و عوامل اصلاح‌کنندۀ سازگار با محیط زیست در فرایندهای بازسازی مثل تصفیۀ زیستی، شستشوی خاک و غیره به کار روند (5).

تاکنون تعداد زیادی از باکتری‌هایی که قادرند گازوئیل را تجزیه کنند، از خاک‌های آلوده جداسازی شده‌اند. به‌طور مثال دو جنس باکتریایی Micrococcus و Pseudomonas از گاراژ ماهاراشترا[1] در هند جداسازی شده است. در این بررسی سرعت تجزیۀ زیستی هریک از جنس‌ها به دست آمد و نشان داده شد که سرعت تجزیۀ زیستی حالت مخلوط این دو جنس باکتری از حالت منفرد آن‌ها بیشتر است (6). در یک پژوهش با استفاده از یک جمعیت میکروبی مخلوط که از انستیتو مکزیک به دست آمده بود نشان داده شد که با افزودن تلقیح میکروبی به خاک و افزودن تدریجی مواد غذایی، فعالیت میکروبی در خاک آلوده به هیدروکربن‌ها را می‌توان افزایش داد (7).

با توجه به آلودگی‌های نفتی گسترده در استان خوزستان و آثار زیان‌بار این آلودگی‌ها بر روی خاک و پوشش گیاهی این منطقه، این پژوهش در جهت پیداکردن باکتری‌هایی که می‌توانند این نوع آلودگی را حذف کنند طراحی شده است. درخصوص باکتری‌های تجزیه‌کنندۀ نفت خام تاکنون کارهای بسیاری انجام شده است. اما گزارشات بسیار کمی دربارۀ جداسازی باکتری‌های تجزیه‌کنندۀ گازوئیل وجود دارد. هدف از این پژوهش جداسازی باکتری‌های مؤثر در تجزیۀ گازوئیل از خاک‌هایی است که در زمان‌های متمادی تحتِ‌تأثیر آلودگی نفتی بوده‌اند.

.مواد و روش‌ها.

نمونه‌برداری: نمونه‌های خاک از پنج ایستگاه نشت گازوئیل از مناطق نفتی مسجد سلیمان، میدان نفت و گاز مارون، میدان نفتی آزادگان، پالایشگاه نفت آبادان، صنایع پتروشیمی اهواز در استان خوزستان جمع‌آوری شد. نمونه‌برداری تحت شرایط استریل انجام شد. ابتدا 10 سانتی‌متر از سطح خاک برداشته شد و حدوداً 400 گرم از خاک داخل ظروف استریل ریخته شد. نمونه‌های خاک تا انتقال به آزمایشگاه روی یخ نگهداری شدند و سپس در دمای 4 درجه سانتیگراد تا انجام آزمایشات بعدی قرار داده شدند.

جدا سازی و شناسایی باکتری‌های تجزیه‌کنندۀ گازوئیل: جهت جداسازی باکتری‌های تجزیه‌کنندۀ گازوئیل از محیط بوشنل هاس حاوی 1درصد گازوئیل به‌عنوان تنها منبع کربن استفاده شد. از نمونه‌های خاک به‌میزان 5 گرم داخل این محیط جهت غنی‌سازی اولیه تلقیح شد و بر روی شیکر با دورrpm  160 و دمای 30 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 1 هفته قرار گرفت. پس از گذشت یک هفته میزان 5 میلی‌لیتر از این محیط برداشته شد و به محیط BH جدید حاوی 1درصد گازوئیل به‌عنوان تنها منبع کربن انتقال یافت. عمل شیک‌کردن برای پاساژ دوم به‌مدت یک هفته ادامه یافت تا کدورت به‌دست‌آمدۀ ناشی از رشد باکتری‌های تجزیه‌کننده باشد و آلودگی ترکیبات دیگر در نمونه کاهش یابد. از پاساژ پایانی (پاساژ سوم)، میزان 100میکرولیتر بر روی محیط  NAپخش شد و پس از رشد در دمای 30 درجه سانتی‌گراد ، باکتری‌های متفاوت از نظر کلنی جداسازی شدند و هر کلنی منحصربه‌فرد، به محیط NA جدید منتقل شدند (8). برای شناسایی بیوشیمیایی باکتری‌های جداشده از منابع فوق از آزمایش‌های اولیه شامل رنگ‌آمیزی گرم، شکل میکروسکوپی، شکل کلنی، حرکت، اکسیداز، کاتالاز، اکسایش/ تخمیر (O/F)، احیای نیترات، تولید H₂S، تولید اندول و آزمون ‌ TSI استفاده شد (۹).

.شناسایی مولکولی باکتری‌های تجزیه‌کنندۀ گازوئیل: شناسایی مولکولی با تکثیر قسمتی از ژن16S rDNA توسط پرایمرهای رفتی 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 و پرایمر برگشتی 5-TACGYTACCTTGTTACGACTT -3  انجام شد. برنامۀ PCR برای تکثیر ژن بدین صورت بود: دمای دناتوراسیون 94 درجه سانتی‌گراد به‌مدت یک دقیقه، دمای اتصال پرایمرها 55 درجه سانتی‌گراد به‌مدت یک دقیقه و دمای تکثیر 72 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 1 دقیقه و تعداد سیکل‌ها 35 است محصول حاصل از PCR در ژل آگاروز 1درصد بارگذاری شد و سپس باند bp 1400 از ژل آگاروز طبق دستورالعمل کیت فرمنتاژ (K0513) استخراج و جهت تعیین توالی فرستاده شد. نتایج حاصل از تعیین توالی در بانک‌های ژنی بلاست‌شده و همولوژی آن‌ها بررسی شد و قرابت بالاتر از 98درصد به‌عنوان جنس و گونۀ باکتری مجهول لحاظ شد (10).

.سنجش حذف گازوئیل توسط باکتری‌های جداشده:

روش اسپکتروفتومتری: برای این منظور یک کشت 24ساعته از باکتری در محیط  NAتهیه شد و با استفاده از محیط BH، کدورت همۀ آن‌ها با خواندن جذب نوری در 600 نانومتر در یک مقدار مشخص تنظیم شد (OD₆₀₀=2). سپس باکتری‌ها در دور 5000 به‌مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند، مایع رویی دور ریخته شد و رسوب باکتری‌ها به محیط بوشنل هاس براث حاوی 1درصد گازوئیل تلقیح شدند. ارلن‌ها بر روی شیکر با دورrpm 160 و دمای 30 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 10روز همراه با نمونه شاهد قرار گرفتند. پس از دورۀ انکوباسیون ، نمونه‌ها با شاهد مقایسه و نتایج به‌صورت کیفی گزارش شد (6).  

روش گاز کروماتوگرافی^[2] (GC): در این روش یک کشت 24ساعته از باکتری در محیط  NAتهیه شد و با استفاده از محیط BH، کدورت همۀ آن‌ها با خواندن جذب نوری در 600 نانومتر در یک مقدار مشخص تنظیم شد (OD₆₀₀=2). سپس باکتری‌ها در دور 5000 به‌مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند، مایع رویی دور ریخته شد و رسوب باکتری‌ها به محیط بوشنل هاس براث حاوی 1درصد گازوئیل تلقیح شدند و بر روی شیکر با دورrpm 160 و دمای 30 درجه سانتی‌گراد همراه با شاهد قرار داده شدند. در انتهای دورۀ انکوباسیون (10 روز) میزان 50 میلی‌لیتر دی‌کلرومتان (DCM) به ارلن حاوی کشت باکتری و گازوئیل اضافه شد. DCM به‌خوبی با محیط گازوئیل بوشنل براث مخلوط شد و درون قیف جداکننده ریخته شد تا فاز آلی و آبی از هم جدا شوند. سپس فاز آلی که حاوی گازوئیل حل‌شده در [3]DCM بود درون ارلن ریخته شد و 3 گرم سدیم سولفات جهت جذب آب باقیمانده به ارلن اضافه شد و به‌مدت یک شب در دمای اتاق انکوبه شد. سپس محتویات ارلن از کاغذ واتمن شماره 1 عبور داده شد و در دمای محیط جهت تبخیر DCM قرار گرفت. پس از تبخیر DCM مجدداً 100میکرولیتر DCM به 100 میکرولیتر گازوئیل باقیمانده اضافه شد و توسط دستگاه GC آنالیز شد. برنامۀ GC بدین صورت بود: ستون ) 0.32 mm × 0.1 μm (30 m × varian capillary column cp-sil5cB دتکتور FID، گاز حامل هلیم، دمای اولیه 100 درجه سانتی‌گراد برای 1 دقیقه، دمای انتقال 300 درجه سانتی‌گراد ، دمای تزریق 200 درجه سانتی‌گراد ، دمای نگهداری ستون 100 درجه سانتی‌گراد برای 1 دقیقه، دمای نهایی 300 درجه سانتی‌گراد و جریان عبوری 25 میلی‌لیتر بر دقیقه بود. پیک‌های حاصل از GC با شاهد مقایسه شد و درصد تجزیه برای هر سویه محاسبه شد (11).

سنجش هیدروفوبیسیته سطح سلولی^[4] (BATH): ابتدا سوسپانسیون باکتریایی در بافر تهیه شد . ترکیبات بافر به شرح زیر است (گرم بر لیتر) 22 گرم دی پتاسیم هیدروژن فسفات، 22 گرم پتاسیم دی هیدروژن فسفات،26/7 گرم اوره و 2/0 گرم منیزیم سولفات.سپس 200 میکرولیتر هیدروکربن هگزا دکان به آن اضافه شد و پس از 2 دقیقه همزنی، 45 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد تا فاز هیدروکربنی جدا شود و کدورت فاز آبی قبل و بعد از تیمار اندازه‌گیری شد. نتایج به‌صورت جذب فاز آبی بعد از تیمار نسبت به جذب اولیۀ سوسپانسیون باکتریایی محاسبه شد (۱۲).

فعالیت امولسیونه‌کنندگی^[5] (E24): باکتری‌های تجزیه‌کننده ابتدا در محیط نوترینت براث به‌همراه 4درصد نمک کشت داده شدند و پس از آنکه باکتری‌ها به رشد لگاریتمی رسیدند، میزان 4 میلی‌لیتر از محیط کشت درون لولۀ آزمایش حاوی 6 میلی‌لیتر از نفت سفید استریل ریخته شد و با سرعت بالا همزنی شد. سپس به‌مدت 24 ساعت به‌صورت ساکن در دمای محیط قرار داده شد. پس از 24 ساعت فعالیت امولسیونه‌کنندگی با فرمول زیر به دست آمد (۱۳).

منحنی رشد سویه در محیط حاوی گازوئیل: برای این منظور یک کشت 24ساعته از هر باکتری در محیط  NBتهیه شد و با استفاده از بافر فسفات، کدورت آن با خواندن جذب نوری در 600 نانومتر در یک مقدار مشخص تنظیم شد (OD₆₀₀=1). سپس باکتری به محیط بوشنل هاس براث حاوی غلظت یک درصد گازوئیل تلقیح شد. ارلن‌ها بر روی شیکر با دور rpm 160 در دمای30 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند و رشد باکتری‌ها با خواندن جذب نوری در 600 نانومتر روزانهسنجش شد (13).

نتایج.

جداسازی باکتری‌های تجزیه‌کنندۀ گازوئیل: در طی این پژوهش 34 سویه باکتری از نمونه‌های خاک جداسازی شد. کلیۀ 34 سویۀ جداسازی‌شده در محیط حاوی گازوئیل به‌عنوان تنها منبع کربن کشت داده شدند. تنها ۱۰ سویه قادر به رشد بالاتر و تجزیۀ بیشتری از گازوئیل بودندکه به‌عنوان سویه‌های تجزیه‌کنندۀ گازوئیل انتخاب و مطالعات بعدی روی آن‌ها انجام گرفت. در جدول 1 پاره‌ای از ویژگی‏های این باکتری‌ها آمده است.

جدول 1- باکتری‌های جداسازی‌شده و ویژگی‏‏های آن‌ها

انتخاب سویه‌های برتر تجزیه‌کننده گازوئیل با غربالگری باکتری‌های جداسازی‌شده: در این مرحله فعالیت امولسیون‌کنندگی (E₂₄) و هیدروفوبیسیتۀ سطح سلولی (BATH) ۱۰ سویۀ تجزیه‌کننده بررسی شد. سویه‌های برتر با درنظرگرفتن این دو ویژگی انتخاب شدند. نتایج حاصل در جدول 2 آمده است با توجه به این جدول بیشترین هیدروفوبیسیتۀ سطح سلولی مربوط به سویۀ K2و بیشترین فعالیت امولسیون‌کنندگی مربوط به سویه‌هایA3وB2است.

شناسایی بیوشیمیایی: پس از غربالگری اولیه، آزمون‌های بیوشیمیایی جهت شناسایی سویه‌های برتر انجام شد. در جدول 3 نتایج حاصل از این آزمون‌ها برای هر سویه آمده است. این نتایج نشان می‌دهد که سویه‌ها در برخی صفات بیوشیمیایی با یکدیگر تفاوت دارند. با توجه به جدول سویه‌های ‌A2, A3, B3, K2 غیر متحرک و سویه‌های ‌A1, K2, L2قابلیت تولید گاز در محیط TSI  را دارند.

جدول 2- فعالیت امولسیون‌کنندگی و هیدروفوبیسیتۀ سطح سلولی سویه‌ها

جدول 3- نتیجه آزمون‌های بیوشیمیایی باکتری‌های تجزیه‌کننده

شناسایی مولکولی: شناسایی مولکولی باکتری‌های قوی در تجزیۀ گازوئیل با تکثیر قسمتی از ناحیه ژنی S rRNA16 با پرایمرهای ویژۀ این ژن انجام شد. سپس محصول bp1400 حاصل از PCR از ژل استخراج، خالص‌سازی و جهت تعیین توالی فرستاده شد. توالی‌های حاصل‌شده در بانک‌های ژنی بلاست شد و بالاترین همولوژی (بالاتر از 98درصد) به‌عنوان جنس و گونۀ باکتری تعیین شد. توالی حاصل‌شده و بالاترین همسانی پس از بلاست‌کردن توالی به‌دست‌آمده در بانک‌های ژنی به‌همراه شمارۀ دستیابی توالی این سویه‌ها در پایگاه EMBL برای هر سویه در جدول 4 آمده است. فیلوژنی این باکتری‌ها در شکل 1 آمده است.

جدول 4- توالی به‌دست‌آمده برای سویه‌های تجزیه‌کنندۀ برتر

شکل 1- درخت فیلوژنی جنس‌های ‌Achromobacter ، Enterobacter و Klebsiella

رشد و تجزیۀ گازوئیل توسط سویه‌های برتر: کلیۀ سویه‌ها در محیط  BHحاوی ۱درصد گازوئیل در دمای 30 درجه سانتی‌گراد و دورrpm  160 به‌مدت 10 روز کشت داده شدند. سپس میزان رشد سویه‌ها به‌صورت کیفی و کمی با مقایسه با نمونه شاهد به دست آمد. درصد تجزیۀ گازوئیل نیز با محاسبه سطح زیر منحنی برای هر نمونه به دست آمد. نتایج حاصل‌شده در جدول 5 آمده است. پیک‌های حاصله از گاز کروماتوگرافی در شکل 2 نشان داده شده است. همان‌طور که در این جدول دیده می‌شود هر چهار سویۀ برتر قادر به حذف بیش از ۵۰درصد نفت پس از ده روز هستند اما سویۀ L2 بالاترین میزان حذف گازوئیل را دارد.

منحنی رشد سویه‌های برتر تجزیه‌کننده: برای این منظور، رشد باکتری‌های درون ارلن‌های حاوی محیط بوشنل براث که بر روی شیکر با دور rpm160 در دمای 30 درجه سانتی‏گراد قرار داده شده بودند، با خواندن جذب نوری در 600 نانومتر با فاصله زمانی 1 روزه سنجش شد. نتایج حاصل‌شده در شکل 3 آمده است. همان‌طور که در این شکل دیده می‌شود، بیشترین میزان رشد پس از 10 روز مربوط به سویۀ K2 با 95/1=OD₆₀₀ بود که قدرت تجزیه‌کنندگی بالایی در مقایسه با سایر سویه‌ها دارد و کمترین میزان رشد مربوط به سویۀ L2 با 23/1OD₆₀₀₌ بود که قدرت تجزیه‌کنندگی پایینی نیز دارد.

جدول 5- میزان رشد ودرصد حذف گازوئیل سویه‌ها پس از 10 روز

شکل 3- منحنی رشد چهار سویۀ برتر در محیط حاوی گازوئیل

شکل 2- طیف‌های گاز کروماتوگرافی حاصل‌شده از تجزیۀ گازوئیل توسط باکتری‌های برتر