تولید بیوفیلم در میان سویه‌های استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس جداسازی‏شده از افراد سالم

مقدمه.

استافیلوکوک‌های کواگولاز منفی[1] از جمله فراوان‌ترین میکروارگانیسم‌های جداسازی‌شده از نمونه‌های بالینی در آزمایشگاه‌ها هستند (1). به دلیل حضور این ارگانیسم‌ها به‌عنوان فلور طبیعی پوست و غشاهای مخاطی انسان، پیش‌تر جداسازی آن‌ها از نمونه‌های بیماران به‌عنوان آلودگی کشت در نظر گرفته می‌شد، درحالی‌که در دهه‌های اخیر این باکتری‌ها به‌عنوان عوامل بیماری‌زا، خصوصاً در محیط بیمارستان‌ها اهمیت زیادی پیدا کرده‌اند (2). امروزه استافیلوکوک‌های کواگولاز منفی، از مهم‌ترین عوامل عفونت‌های بیمارستانی هستند، به‌طوری‌که مطالعات مختلف نشان می‌دهند، بیش از 30درصد موارد باکتریمی بیمارستانی را این باکتری‌ها ایجاد می‌کنند (3). این باکتری‌ها معمولاً باعث ایجاد عفونت در نوزادان و افراد دارای نقص سیستم ایمنی می‌شوند و عفونت‌هایی که این ارگانیسم‌ها ایجاد می‌کنند، عمدتاً در ارتباط با وسایل خارجی درون بدن بیماران، مانند سوندهای داخل وریدی، شانت‌های مغزی- نخاعی، دریچه‌های مصنوعی قلب و مفاصل مصنوعی هستند (4).

استافیلوکوک‌های کواگولاز منفی مشتمل بر چندین گونه هستند که از نظر همه‌گیرشناسی، مقاومت آنتی‌بیوتیکی و بیماری‌زایی با یکدیگر تفاوت دارند. در گذشته، این تصور وجود داشت که شناسایی این دسته از باکتری‌ها تا حد گونه ضروری نیست و تأثیری در درمان عفونت‌های ناشی از آن‌ها ندارد (5). مطالعات بیشتر نشان داد که تعیین گونة این ارگانیسم‌ها برای شناخت پتانسیل بیماری‌زایی آن‌ها امری ضروری است که علاوه بر مشخص‌کردن اهمیت بالینی و بیماری‌های مرتبط با هر گونه، می‌تواند در درمان و تجویز آنتی‌بیوتیک مناسب نیز، بسیار مفید باشد. به همین دلیل، امروزه با گسترش عفونت‌های ناشی از استافیلوکوک‌های کواگولاز منفی، تعیین گونۀ این باکتری‌ها در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی امری مهم است (6). استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس به‌عنوان یکی از عوامل مهم ایجاد عفونت‌های بیمارستانی در جهان شناخته می‌شود و عوامل مستعدکننده‌ای نظیر سوندگذاری، استفاده از پروتز و پیوند دریچۀ مصنوعی قلب، خطر ابتلا به عفونت‌های ناشی از استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس را افزایش می‌دهند (7).

باکتری‌ها می‌توانند به‌صورت بیوفیلم در سطح سوندها و سوندهای ادراری رشد کنند و مقاومت فوق‌العاده‌ای نسبت به عوامل ضدمیکروبی از خود نشان دهند (8). استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس به‌عنوان مهم‌ترین گونۀ استافیلوکوکوس در تولید بیوفیلم به‌خصوص در دستگاه ادراری شناخته می‌شد، اما در حال حاضر، استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس و استافیلوکوکوس اورئوس اغلب به‌عنوان مهم‌ترین عوامل ایجاد بیوفیلم در بیماران دارای عفونت ادراری حائز اهمیت هستند (8-10). بیوفیلم‏های باکتریایی در بیمارانی که از ابزارهای خارجی استفاده می‌کنند یک فرآیند دومرحله‌ای است که مشتمل بر اتصال به سطوح، رشد، تکثیر و گسترش باکتری‌ها به‌شکل چند لایه است (9). تشکیل بیوفیلم منجر به ایجاد عفونت‌های عودشونده می‌شود که نسبت به درمان‌های ضدمیکروبی مقاومت نشان می‌دهد و باعث افزایش هزینه‌های ناشی از درمان می‌شود (11). تولید بیوفیلم ناشی از فعالیت اپرون icaADBC است که مسئول سنتز بخش عمده‌ای از ماتریکس اگزوپلی‌ساکاریدی، پلی‌ساکارید چسبندۀ بین سلولی[2] و عامل گردِهم‌آمدن سلول‌های باکتریایی در بیوفیلم است (12). علاوه‌بر‌این، تولید اتولایزین و پروتئین سطحی نیز در تشکیل بیوفیلم حائز اهمیت است (13). این مطالعه با هدف بررسی سویه‌های استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس مولد بیوفیلم جداسازی‌شده از افراد سالم به انجام رسیده است.

‏‏مواد و روش ‏ها.

نمونه‌گیری: جهت انجام این مطالعه در طی سال‌های 1393-1392 در مجموع 200 فرد سالم که دارای 3 ویژگی زیر بودند، انتخاب شدند: 1. در طی 6 ماه گذشته به پزشک یا مرکز درمانی مراجعه نکرده‌اند؛ 2. در طی 6 ماه گذشته آنتی‌بیوتیک مصرف نکرده‌اند و 3. در طی 6 ماه گذشته با بیماری که در بیمارستان یا مرکز درمانی بستری بوده است سروکار نداشته‌اند. برای این منظور با استفاده از سوآب آغشته به سرم فیزیولوژی استریل، از نواحی ساعد، بازو و زیربغل (دست غیرغالب) افراد نمونه‌گیری به عمل آمد و سپس سوآب‌ها به محیط آبگوشت تایوگلیکولات[3] (مرک، آلمان[4]) منتقل شدند. پس از 24 ساعت گرمخانه‌گذاری در دمای 37 درجه سانتی‌گراد، نمونه‌ها بر روی محیط ژلوز مانیتول نمک[5] (مرک، آلمان) کشت داده شدند. تمامی جدایه‌ها در ابتدا با استفاده از آزمون‌های کاتالاز، رنگ‌آمیزی گرم، کواگولاز، مقاومت به دیسک باسیتراسین و دی ان آز[6] به‌عنوان جدایه‌های استافیلوکوکوس کواگولاز منفی بررسی و تأیید شدند (14). سپس با استفاده از آزمون‌های پی وای آر[7]، دیسک نووبیوسین، آزمون دکربوکسیلاسیون اورنیتین، تولید اسید از قندهای مالتوز، ترهالوز، سوکروز و مانیتول تا حد گونه (استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس) شناسایی شدند (15).

.بررسی تولید بیوفیلم:

الف: به روش کیفی: جهت تعیین سویه‌های استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس مولد بیوفیلم، سویه‌ها بر روی محیط ژلوز قرمز کنگو[8] دارای 40 گرم در لیتر سوکروز کشت داده شدند و به‌مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد گرمخانه‌گذاری شدند و سپس به‌مدت 48 ساعت در دمای اتاق قرار داده شدند (16). کلنی‌های سیاه‌رنگ به‌عنوان سویه‌های مولد بیوفیلم و کلنی‌های قرمزِ تیره به‌عنوان سویه‌های مولد بیوفیلم ضعیف و سویه‌های قرمزِ روشن تا صورتی به‌عنوان سویه‌های فاقد قدرت تولید بیوفیلم شناسایی شدند (16).

ب: به‌روش کمی میکروتیتر پلیت: این روش مبتنی بر سنجش میزان بیوفیلم تولیدی در محیط آبگوشت تریپتیکاز سوی[9] دارای 25/0درصد سوکروز و در میکروپلیت‌های 9۶خانه (گرینر، آمریکا[10]) با استفاده از اسپکتروفتومتر است. این روش کمی بوده که براساس میزان چسبندگی کلنی‌های باکتریایی به سطوح پلی استیرن ته چاهک‌ها و رنگ‌آمیزی با کریستال ویوله و قرائت جذب نوری 570 نانومتر آن‌ها با استفاده از دستگاه خوانشگر الایزا[11] (استت فکس، آمریکا[12]) است (17). سویه‌هایی که جذب نوری[13] آن‌ها زیر 35/0 بود غیرچسبنده، سویه‌هایی که جذب نوری آن‌ها بین 35/0 تا 45/0 بود چسبندۀ ضعیف و سویه‌هایی که جذب نوری آن‌ها بالاتر از 45/0 بود به‌عنوان چسبندۀ قوی در نظر گرفته شدند.

استخراج DNA: جهت استخراج DNA سویه‌های مولد بیوفیلم، از روش جوشاندن استفاده شد (18). برای این منظور، چند کلنی از باکتری در 200 میکرولیتر سرم فیزیولوژی حل شد و به‌خوبی ورتکس شد و سپس به‌مدت 20 دقیقه جوشانده شد. پس از 15 دقیقه سانتریفوژ با دور 13000، 10 میکرولیتر از سوپرناتانت[14] به‌عنوان الگوی DNA در آزمون واکنش زنجیره‌ای آنزیم پلیمراز[15] استفاده شد.

تعیین ژن‌های مؤثر بر تولید بیوفیلم: جهت تعیین وجود ژن‌های icaA و icaD از آزمون واکنش زنجیره‌ای آنزیم پلیمراز با استفاده از پرایمرهای اختصاصی که آرکیولا و همکاران[16] معرفی کرده‌اند استفاده شد (19). تکثیر این ژن‌ها با مخلوط واکنش زنجیره‌ای آنزیم پلیمراز و چرخۀ حرارتی که آرکیولا و همکاران معرفی کرده‌اند انجام گرفت. باندهای مدنظر برای ژن‌های icaA و icaD به‌ترتیب 188 و 198 جفت باز بودند.

نتایج.

جداسازی و شناسایی باکتری‌ها: در این مطالعه 200 فرد سالم که متشکل از 100 زن و 100 مرد سالم بودند انتخاب شدند که درمجموع 104 سویۀ استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس از این افراد جداسازی شد. بدین ترتیب که 49 سویه (47درصد) از مردان و 55 سویه (53درصد) نیز از زنان جداسازی شد. تمامی این سویه‌ها با استفاده از آزمون‌های بیوشیمیایی شناسایی و تأیید شدند.

آزمون کیفی تولید بیوفیلم: درمجموع از 104 سویه استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس جداسازی‌شده از افراد سالم در این مطالعه، پس از کشت بر روی محیط ژلوز قرمز کنگو، 39 سویه (38درصد) کلنی‌های سیاه‌رنگ (بیوفیلم مثبت)، 27 سویه (26درصد) کلنی‌های قرمزرنگ (نامشخص) و 38 سویه (36درصد) نیز کلنی‌های قرمزِ روشن (بیوفیلم منفی) تشکیل دادند.

آزمون کمی تولید بیوفیلم: پس از انجام آزمون میکروتیتر پلیت جهت سنجش کمی تولید بیوفیلم، مشخص شد که در این بررسی 49 سویه (47درصد) به‌عنوان سویه‌های چسبنده، 17 سویه (16درصد) به‌عنوان سویه‌های چسبندۀ ضعیف و 38 سویه (37درصد) نیز به‌عنوان سویه‌های غیرچسبنده تعیین شدند.

تعیین ژن‌های icaA و icaD: پس از انجام آزمون واکنش زنجیره‌ای پلیمراز جهت شناسایی icaA و icaD مشخص شد که 100درصد سویه‌ها (66 سویه) دارای هر دو ژن بودند (شکل‌های 1 و 2). در این مطالعه نتایج آزمون‌های فنوتایپی و ژنوتایپی کاملاً منطبق بر یکدیگر بودند.

شکل 1- آزمون واکنش زنجیره‌ای آنزیم پلیمراز جهت شناسایی ژن icaA در میان سویه‌های استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس

چاهک 1: کنترل منفی، چاهک‌های 12-2 سویه‌های استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس، چاهک 13: کنترل مثبت، چاهک 14: بیانگر DNA.

شکل 2- آزمون واکنش زنجیره‌ای آنزیم پلیمراز جهت شناسایی ژن icaD در میان سویه‌های استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس

چاهک 1: کنترل مثبت، چاهک‌های 12-2: سویه‌های استافیلوکوکوس اپیدرمایدیس، چاهک 13: بیانگر DNA.