جداسازّی ‏و ‏شناسایی ‏سویه‏ های ‏سودوموناس ‏تجزیه‏ کننده ‏استونیتریل از ‏آب‏ انبار ‏گنجعلی ‏خان ‏کرمان

رمضانی پور, نرجس; بدویی دلفارد, ارسطو; نمکی-شوشتری, عبدالحمید; کرمی, زهرا

doi:10.22108/bjm.2016.20370

تعداد نشریات	43
تعداد شماره‌ها	1,646
تعداد مقالات	13,379
تعداد مشاهده مقاله	30,117,315
تعداد دریافت فایل اصل مقاله	12,062,922

جداسازّی ‏و ‏شناسایی ‏سویه‏ های ‏سودوموناس ‏تجزیه‏ کننده ‏استونیتریل از ‏آب‏ انبار ‏گنجعلی ‏خان ‏کرمان

زیست شناسی میکروبی

مقاله 8، دوره 5، شماره 17، خرداد 1395، صفحه 73-86 اصل مقاله (754.06 K)

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

شناسه دیجیتال (DOI): 10.22108/bjm.2016.20370

نویسندگان

نرجس رمضانی پور¹؛ ارسطو بدویی دلفارد^* ²؛ عبدالحمید نمکی-شوشتری³؛ زهرا کرمی⁴

¹دانشجوی ‏کارشناسی ‏ارشد ‏میکروبیولوژی، ‏دانشگاه ‏شهید ‏باهنر ‏کرمان، ‏ایران

²دانشیار ‏بیوشیمی، ‏دانشگاه ‏شهید ‏باهنر ‏کرمان، ‏ایران

³دانشیار ‏ژنتیک، ‏دانشگاه ‏شهید ‏باهنر ‏کرمان، ‏ایران

⁴استادیار ‏بیوفیزیک، ‏دانشگاه ‏شهید ‏باهنر ‏کرمان، ‏ایران

چکیده

مقدمه: ‏نیتریل‏ها ‏ترکیباتی ‏سمی ‏و ‏بسیار ‏خطرناک ‏برای ‏موجودات ‏زنده ‏هستند‏ ‏که ‏به‏‏طور ‏گسترده ‏توسط ‏بشر ‏تولید ‏و ‏موجب ‏آلودگی ‏محیط‏زیست ‏می‏شوند. ‏بهترین ‏روش ‏برای ‏تجزیه ‏نیتریل‏های ‏موجود ‏در ‏فاضلاب، ‏تجزیه ‏زیستی ‏است. ‏هدف ‏اصلی ‏پژوهش حاضر، ‏جداسازی ‏و ‏شناسایی ‏باکتری‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریل ‏از ‏فاضلاب ‏شهری ‏در ‏محل ‏آب ‏انبارهای ‏کرمان ‏است. ‏‏‏‏

مواد ‏و ‏روش ‏‏ها: ‏برای ‏غنی‏سازی ‏و ‏جداسازی ‏باکتری‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریل ‏از ‏محیط ‏کشت ‏اختصاصی ‏حاوی ‏1 ‏درصد ‏استونیتریل ‏به ‏عنوان ‏تنها ‏منبع ‏کربن ‏و ‏نیتروژن ‏استفاده ‏شد. ‏فعالیت ‏آنزیم ‏و ‏تولید ‏آمونیاک ‏در ‏محیط ‏کشت ‏توسط ‏روش ‏فنل- هیپوکلریت ‏سنجیده ‏شد. ‏باکتری‏های ‏جدا ‏شده ‏توسط ‏آزمون‏های ‏بیوشیمیایی‏- ‏میکروبی ‏و ‏مولکولی ‏شناسایی ‏شدند. ‏بهینه‏سازی ‏شرایط ‏تولید ‏آنزیم ‏در ‏حضور ‏منابع ‏مختلف ‏کربن، ‏نیتروژن ‏و ‏اسیدیته ‏بررسی ‏و ‏مقدار ‏نیتریل ‏و ‏اسید ‏حاصل ‏توسط ‏کروماتوگرافی ‏گازی ‏تعیین ‏شد. ‏

نتایج: ‏از ‏بین ‏سه ‏جدایه ‏مولد ‏نیتریل ‏هیدرولاز ‏با ‏عنوان ‏FA11، ‏FA8، ‏AB19 ‏جدایه ‏FA8 ‏بیش‏ترین‏‏ ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏را ‏نشان ‏داد. ‏نتایج ‏آزمون‏های ‏شناسایی ‏جدایه‏ها ‏نشان ‏داد ‏که ‏این ‏باکتری‏ها ‏به ‏جنس ‏سودوموناس ‏تعلق ‏دارند. ‏بررسی ‏مولکولی ‏ژن ‏16S rRNA‏‏ نشان ‏داد ‏که ‏جدایه ‏FA11 ‏و ‏FA8 ‏با ‏سودوموناس ‏اوتیتیدیس ‏و ‏جدایه ‏AB19 ‏با ‏سودوموناس ‏جنیکولاتا ‏به ‏ترتیب ‏دارای ‏99 ‏و ‏100 ‏درصد ‏همولوژی ‏هستند‏. ‏بررسی ‏اثر ‏منابع ‏مختلف ‏بر ‏تولید ‏آنزیم ‏نشان ‏داد ‏که ‏جدایه ‏برتر ‏سودوموناس ‏FA8 ‏با ‏وجود ‏گلوکز ‏و ‏عصاره ‏مخمر ‏در ‏محیط ‏کشت ‏با ‏اسیدیته ‏خنثی ‏دارای ‏بیش‏ترین‏ ‏مقدار ‏تولید ‏آنزیم ‏است. ‏نتایج ‏کروماتوگرافی ‏گازی ‏نشان ‏داد ‏که ‏FA8 ‏پس ‏از ‏48 ‏ساعت ‏انکوباسیون، ‏58 ‏درصد ‏استیک‏‏اسید ‏تولید ‏کرده ‏است. ‏

بحث ‏و ‏نتیجه ‏گیری: ‏نتایج ‏نشان ‏داد ‏که ‏جدایه ‏برتر ‏FA8، ‏گزینه ‏مناسبی ‏برای ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏است ‏که ‏می‏تواند ‏برای ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏از ‏پساب ‏صنایع ‏و ‏مکان ‏های ‏آلوده، استفاده شود. ‏

کلیدواژه‌ها

نیتریل؛ ‏غربال ‏گری؛ ‏نیتریل ‏هیدرولاز؛ ‏سودوموناس

اصل مقاله

مقدمه. ‏

نیتریل‏ها^{^[1]} ‏از ‏جمله ‏ترکیبات ‏آلی ‏با ‏گروه ‏فعال ‏سیانو ‏هستند ‏که ‏در ‏شکل‏های ‏مختلف ‏طبیعی ‏و ‏مصنوعی ‏به‏‏طور ‏رو ‏به ‏افزایشی ‏تولید ‏می‏شوند ‏(1). ‏این ‏ترکیبات ‏به ‏شکل ‏طبیعی ‏در ‏شکل‏هایی ‏از ‏سیانوگلیکوزید^{^[2]}، ‏سیانولیپید^{^[3]}، ‏ایندول ‏3-استونیتریل^{^[4]} ‏و ‏بتا-سیانو-ال–آلانین^{^[5]} ‏توسط ‏طیف ‏گسترده‏ای ‏از ‏گیاهان ‏تولید ‏می‏شوند ‏(2). ‏در ‏این ‏میان ‏سیانوگلیکوزید‏ها ‏که ‏از ‏محصولات ‏متابولیسم ‏ثانویه ‏گیاهی ‏به ‏شمار ‏می‏آیند ‏در ‏اثر ‏صدمات ‏وارده ‏بر ‏بافت ‏گیاهی ‏به ‏سرعت ‏تجزیه ‏و ‏به ‏محصولاتی ‏مانند: ‏قند، ‏ترکیبات ‏کتون^{^[6]}، ‏آلدهید^{^[7]} ‏و ‏همچنین، ‏هیدروژن ‏سیانید^{^[8]} ‏که ‏یک ‏ترکیب ‏فوق ‏العاده ‏سمی ‏است ‏تبدیل ‏می‏شوند. ‏از ‏طرف ‏دیگر ‏ترکیبات ‏نیتریلی ‏به‏‏طور ‏گسترده‏ ‏در ‏شکل ‏محصولات ‏مختلف ‏صنعتی ‏مانند: ‏حلال، ‏پلاستیک، ‏لاستیک‏های ‏سنتزی، ‏‏علف‏کش ‏و ‏دارو ‏تولید ‏می‏شوند ‏(3). ‏این ‏نیتریل‏ها ‏به ‏شکل ‏غیر ‏قابل ‏کنترلی ‏از ‏فاضلاب ‏صنایع ‏و ‏پساب ‏کشاورزی ‏وارد ‏محیط ‏زیست ‏شده ‏و ‏به ‏عنوان ‏یک ‏عامل ‏مهم ‏تهدید ‏برای ‏محیط ‏زیست ‏و ‏سلامت ‏موجودات ‏زنده ‏به ‏شمار ‏می‏روند ‏(4). ‏یکی ‏از ‏مهم‏ترین ‏روش‏های ‏تبدیل ‏و ‏یا ‏حذف ‏نیتریل‏ها، ‏هیدرولیز ‏شیمیایی ‏‏است ‏که ‏معمولا ‏در ‏شرایط ‏سخت ‏اسیدی ‏یا ‏بازی ‏و ‏درجه ‏حرارت ‏بالا ‏انجام می‏شود. ‏این ‏روش ‏دارای ‏معایبی ‏از ‏جمله ‏تولید ‏محصولات ‏جانبی ‏نامطلوب ‏و ‏هزینه ‏زیاد ‏است ‏(5). ‏امروزه ‏استفاده ‏از ‏روش‏های ‏زیستی ‏برای ‏تجزیه ‏آلاینده‏های ‏نیتریلی ‏مورد ‏توجه ‏قرار ‏گرفته ‏است. ‏

نیتریل‏هیدرولاز‏ها^{^[9]}، ‏آنزیم‏هایی ‏هستند ‏که ‏هیدرولیز ‏پیوند ‏کربن- ‏نیتروژن ‏غیر ‏پپتیدی ‏ترکیبات ‏نیتریلی ‏را ‏کاتالیز ‏می‏کنند. به طور ‏معمول ‏این ‏خانواده ‏بزرگ ‏آنزیمی ‏بر ‏اساس ‏تشابه ‏توالی ‏و ‏فعالیت ‏کاتالیزوری ‏به ‏13 ‏شاخه ‏تقسیم ‏می‏شوند ‏که ‏در ‏این ‏میان ‏3 ‏شاخه ‏نیتریلاز^{^[10]}، ‏نیتریل‏هیدراتاز^{^[11]} ‏و ‏آمیداز^{^[12]} ‏بسیار ‏مطرح ‏هستند. ‏هیدرولیز ‏آنزیمی ‏نیتریل‏ها ‏با ‏دو ‏مسیر ‏آنزیمی ‏متفاوت ‏انجام می‏شود. ‏در ‏مسیر ‏اول ‏یک ‏نیتریلاز
(E.C.3.5.5.1) ‏هیدرولیز ‏مستقیم ‏نیتریل‏ها ‏به ‏اسیدهای ‏مربوطه ‏را ‏کاتالیز ‏می‏کند ‏(3) ‏و ‏در ‏مسیر ‏دیگر ‏نیتریل ‏هیدراتاز ‏(E.C.4.2.1.84)، ‏یک ‏نیتریل ‏را ‏به ‏آمید‏های ‏مربوطه ‏تبدیل ‏می‏کند ‏(6). ‏این ‏آنزیم ‏در ‏باکتری‏ها ‏معمولا ‏به‏‏طور ‏همزمان ‏با ‏یک ‏آمیداز ‏بیان ‏می‏شود ‏که ‏آمید ‏تولید ‏شده ‏را ‏با ‏آزادسازی ‏آمونیاک ‏به ‏یک ‏اسید ‏تبدیل ‏می‏کند. ‏

نیتریل‏هیدراتاز ‏به ‏عنوان ‏جزیی ‏از ‏مسیر ‏متابولیکی ‏تجزیه ‏نیتریل ‏در ‏میکروب‏ها ‏برای ‏نخستین ‏بار ‏در ‏تولید ‏نیکوتینآمید^{^[13]} ‏و ‏5-سیانو‏والرآمید^{^[14]} ‏شناسایی ‏شد ‏و ‏بیشتر ‏در ‏تولید ‏صنعتی ‏واسطه‏های ‏دارویی ‏و ‏کشاورزی ‏و ‏تولید ‏000/30 ‏تن ‏آکریلآمید^{^[15]} ‏در ‏سال ‏نقش ‏دارد ‏(7). ‏نیتریلاز ‏(نیتریل‏آمینو‏هیدرولاز^{^[16]}) ‏نخستین ‏آنزیم ‏متابولیزه‏کننده ‏نیتریل‏هاست ‏که ‏در ‏سال ‏1960 ‏با ‏تخلیص ‏از ‏گیاه ‏جو ‏و ‏باکتری ‏سودوموناس^{^[17]} ‏کشف ‏شد ‏(8 ‏و ‏9). ‏نخستین ‏واکنشی ‏که ‏در ‏آن ‏این ‏آنزیم ‏شناسایی ‏شد، ‏تولید ‏ایندول ‏3 ‏استیک‏اسید^{^[18]} ‏(اکسین^{^[19]}) ‏از ‏ایندول ‏‏3‏-استونیتریل ‏در ‏گیاهان ‏بود ‏(10). ‏نیتریلاز‏ها ‏آنزیم‏هایی ‏قابل ‏القا ‏با ‏یک ‏یا ‏دو ‏زیر‏ واحد ‏در ‏اندازه ‏و ‏تعداد ‏متنوع ‏هستند ‏و ‏به‏طور معمول ‏یک ‏گروه ‏سولفیدریل ‏دارند ‏که ‏برای ‏فعالیت ‏آن‏ها ‏ضروری ‏است. ‏

از ‏جمله ‏کاربردهای ‏صنعتی ‏مهم ‏نیتریلاز‏ها ‏علاوه ‏بر ‏شرکت ‏در ‏پاک‏سازی ‏زیستی ‏خاک ‏و ‏آب‏های ‏حاوی ‏ترکیبات ‏سمی ‏نیتریلی ‏می‏توان ‏به ‏مواردی ‏همچون ‏سنتز ‏کربوکسیلیک‏اسیدهای ‏مهم ‏صنعتی، ‏تولید ‏نیکوتینیک‏اسید^{^[20]} ‏(نیاسین^{^[21]}) ‏از ‏3-سیانوپیریدین^{^[22]} ‏با ‏مصارف ‏کاربردی ‏در ‏پزشکی ‏و ‏تغذیه ‏و ‏تولید ‏تجاری ‏R-‏ماندلیک‏اسید^{^[23]} ‏از ‏ماندلونیتریل^{^[24]} ‏به ‏عنوان ‏واسطه ‏و ‏عوامل ‏حل‏کننده ‏برای ‏تولید ‏بسیاری ‏از ‏محصولات ‏دارویی ‏و ‏کشاورزی ‏و. ‏. ‏. ‏اشاره کرد ‏(11). ‏فعالیت ‏تجزیه ‏نیتریل‏ها ‏به ‏ندرت ‏در ‏طبیعت ‏دیده ‏می‏شود. ‏میزان ‏کم ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏فقط ‏در ‏سه ‏خانواده ‏از ‏21 ‏خانواده ‏گیاهی ‏و ‏شمار ‏محدودی ‏از ‏جنس‏های ‏قارچی ‏مشاهده ‏شده ‏است. ‏این ‏فعالیت ‏در ‏باکتری‏ها ‏غالب‏تر ‏است. ‏برخی ‏از ‏آن‏ها ‏مانند: ‏اسینتوباکتر^{^[25]}، ‏رودوکوکوس^{^[26]}، ‏کلبسیلا^{^[27]}، ‏سودوموناس، ‏آرتروباکتر^{^[28]}، ‏کورینه‏باکتریوم^{^[29]} ‏و ‏نوکاردیا^{^[30]} ‏می‏توانند ‏از ‏نیتریل‏ها ‏به ‏عنوان ‏منابع ‏نیتروژن ‏و ‏کربن ‏استفاده ‏کنند ‏(12). ‏یکی ‏از ‏مشکلات ‏سال‏های ‏اخیر ‏شهر ‏کرمان ‏بالا ‏آمدن ‏سطح ‏آب‏های ‏زیر ‏زمینی ‏است ‏که ‏متاسفانه ‏باعث ‏آلودگی ‏شدید ‏اماکن ‏و ‏ابنیه ‏تاریخی ‏از ‏جمله ‏آب ‏انبارهای ‏قدیمی، ‏توسط ‏فاضلاب ‏شهری ‏و ‏خانگی ‏شده ‏است. ‏

در پژوهش حاضر، ‏سه ‏باکتری ‏مولد ‏نیتریل‏هیدرولاز ‏با ‏توانایی ‏تجزیه ‏استونیتریل^{^[31]} ‏از ‏آب ‏آلوده ‏آب‏انبار‏های ‏قدیمی ‏شهر ‏کرمان ‏جداسازی ‏و ‏توسط ‏روش‏های ‏بیوشیمیایی ‏و ‏مولکولی ‏شناسایی شد ‏و ‏پتانسیل ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏جدایه ‏برتر ‏سودوموناس ‏اوتیتیدیس ‏FA8^{^[32]}^‏در ‏حضور ‏ترکیبات ‏مختلف ‏بررسی ‏و ‏بهینه‏سازی ‏شد. ‏

‏‏مواد ‏و ‏روش‏ها. ‏

مواد ‏شیمیایی: ‏تمامی ‏ترکیبات ‏محیط ‏کشت ‏غربال‏گری ‏از ‏شرکت ‏سیگما ‏آلدریچ[33] ‏و ‏مرک ‏خریداری ‏شد. ‏مواد ‏مورد ‏نیاز ‏برای ‏واکنش ‏زنجیره‏ای ‏پلیمراز[34] ‏از ‏شرکت ‏سیناژن ‏و ‏سایر ‏مواد ‏شیمیایی ‏مورد ‏نیاز ‏از ‏شرکت ‏مرک[35] ‏(آلمان) ‏خریداری ‏شد. ‏همین ‏طور ‏پرایمر‏های ‏مورد ‏نیاز ‏توسط ‏شرکت ‏بیونیر‏[36] ‏(کره ‏جنوبی) ‏سنتز ‏شد. ‏حلال‏های ‏آلی ‏مورد ‏نیاز ‏نیز ‏از ‏شرکت ‏مرک ‏خریداری ‏شدند. ‏

. ‏جداسازی ‏باکتری‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریل: ‏نمونه‏برداری ‏از ‏آب‏انبار‏های ‏قدیمی ‏شهر ‏کرمان ‏که ‏سطح ‏فاضلاب ‏شهری ‏کرمان ‏بسیار ‏بالا ‏آمده ‏بود، ‏انجام ‏شد. ‏پس ‏از ‏انتقال ‏نمونه‏ها ‏در ‏شرایط ‏استریل ‏به ‏آزمایشگاه، ‏برای ‏غنی‏سازی ‏باکتری‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریل، ‏حجم ‏5 ‏میلی‏لیتر ‏از ‏نمونه ‏آب ‏به ‏محیط ‏کشت ‏مایع ‏حداقل ‏نمک‏های ‏معدنی ‏(MM1)‏[37] ‏(حاوی: ‏8/6 ‏گرم ‏دی ‏پتاسیم ‏هیدروژن ‏فسفات[38]، ‏2/1 ‏گرم ‏پتاسیم ‏دی ‏هیدروژن ‏فسفات[39]، ‏1/0 ‏گرم ‏سولفات ‏منیزیم[40]، ‏1/0 ‏گرم ‏سولفات ‏منگنز[41]، ‏1/0 ‏گرم ‏کلسیم ‏دی‏کلرید[42]، ‏1/0 ‏گرم ‏سولفات ‏آهن[43] ‏و ‏006/0 ‏گرم ‏سدیم ‏مولیبدات[44] ‏در ‏یک ‏لیتر ‏آب ‏مقطر ‏و ‏یک ‏درصد ‏سوبسترای ‏استونیتریل) ‏افزوده ‏شد ‏(13). ‏محیط ‏کشت ‏به‏‏وسیله ‏کلریدریک اسید[45] ‏و ‏سدیم ‏هیدروکسید[46] ‏یک ‏مولار، ‏در ‏اسیدیته ‏7 ‏تنظیم ‏شد. ‏ارلن‏ها ‏در ‏دمای ‏30 ‏درجه ‏سانتی‏گراد ‏و ‏160 ‏دور ‏در ‏دقیقه، ‏به ‏مدت ‏48 ‏ساعت ‏گرماگذاری ‏شدند. ‏پس ‏از ‏3 ‏کشت ‏متوالی ‏در ‏محیط ‏کشت ‏حداقل ‏نمک‏های ‏معدنی، ‏غنی‏سازی ‏میکروارگانیسم‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریل ‏انجام ‏شد. ‏برای ‏جداسازی ‏باکتری‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریل ‏‏100 ‏میکرولیتر ‏از ‏کشت ‏غنی‏شده ‏به ‏محیط ‏کشت ‏جامد ‏حداقل ‏حاوی ‏5/1 ‏درصد ‏آگار[47] ‏و ‏02/0 ‏درصد ‏فنل‏رد[48] ‏به ‏عنوان ‏شناساگر ‏و ‏100 ‏میکرولیتر ‏استونیتریل، ‏تلقیح ‏شد. ‏پلیت‏ها ‏به ‏مدت ‏24 تا 72 ‏ساعت ‏در ‏دمای ‏30 ‏درجه ‏سانتی‏گراد ‏گرماگذاری ‏شدند. ‏پس ‏از ‏سه ‏دوره ‏کشت ‏از ‏میان ‏سه ‏جدایه ‏با ‏فعالیت ‏تجزیه ‏استونیتریل، ‏جدایه ‏FA8 ‏که ‏بیش‏ترین‏ ‏هاله ‏و ‏میزان ‏شدت ‏رنگ ‏در ‏محیط ‏جامد ‏و ‏مایع ‏حاوی ‏سوبسترا ‏و ‏فنل‏رد، ‏پس ‏از ‏48 ‏ساعت ‏انکوباسیون ‏را ‏نشان ‏داد، ‏به ‏عنوان ‏جدایه ‏برتر ‏مولد ‏نیتریل‏هیدرولاز ‏تجزیه ‏کننده ‏استونیتریل ‏برای ‏مطالعات ‏آنزیمی ‏انتخاب ‏شد ‏(13). ‏

. ‏شناسایی ‏بیوشیمیایی ‏باکتری‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریل: ‏شناسایی ‏باکتری‏های ‏جدا ‏شده، ‏بر ‏اساس ‏صفات ‏ریخت‏شناسی، ‏فیزیولوژیکی، ‏بیوشیمیایی ‏و ‏مولکولی ‏انجام ‏شد. ‏ویژگی‏های ‏ریخت‏شناسی ‏هر ‏یک ‏از ‏جدایه‏ها ‏روی ‏محیط ‏کشت ‏تریپتیکال ‏سوی ‏آگار ‏ (TSA[49])‏ ‏(مرک، ‏آلمان) ‏بررسی ‏شد. ‏پس ‏از ‏رنگ‏آمیزی ‏گرم[50]، ‏شکل ‏باکتری‏ها ‏و ‏واکنش ‏گرم ‏آن‏ها ‏مطالعه ‏شد. ‏همچنین، ‏آزمون‏های ‏بیوشیمیایی ‏شامل: ‏فعالیت ‏کاتالازی، ‏اکسیدازی، ‏مصرف ‏گلوکز ‏از ‏مسیر ‏تخمیر ‏اسید‏های ‏مخلوط ‏(متیل‏رد‏[51]) ‏یا ‏مسیر ‏تخمیر ‏بوتاندیول ‏(وژز ‏پروسکوئر[52])‏، ‏تولید ‏پیگمان، ‏مصرف ‏سیترات، ‏احیای ‏نیترات، ‏هیدرولیز ‏اوره، ‏ژلاتین ‏و ‏کازئین، ‏انجام ‏و ‏حرکت ‏باکتری ‏مطابق ‏جداول ‏شناسایی ‏کتاب ‏سیستماتیک ‏باکتریولوژی ‏برگی[53]، ‏بررسی ‏شد ‏(14). ‏تمام ‏آزمایش‏ها ‏با ‏سه ‏بار ‏تکرار ‏انجام ‏شدند. ‏

.شناسایی ‏مولکولی ‏باکتری‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریل: ‏به ‏منظور ‏شناسایی ‏مولکولی، ‏ابتدا ‏باکتری‏ها ‏روی ‏محیط ‏نوترینت ‏آگار[54] ‏کشت ‏چمنی ‏داده ‏و ‏به ‏مدت ‏24 ‏ساعت ‏در ‏دمای ‏30 ‏درجه ‏سانتی‏گراد ‏گرماگذاری ‏شدند. ‏باکتری‏های ‏رشد ‏یافته ‏به ‏کمک ‏لوپ ‏از ‏سطح ‏محیط ‏کشت ‏جمع‏آوری ‏و ‏سوسپانسیونی ‏از ‏آن‏ها ‏در ‏آب ‏مقطر ‏استریل ‏تهیه ‏شد. ‏با ‏سانتریفیوژ[55] ‏سوسپانسیون ‏حاصل ‏در ‏دمای ‏4 ‏درجه ‏سانتی‏گراد ‏به ‏مدت ‏10 ‏دقیقه ‏و ‏در ‏دور ‏g8000 ‏رسوب ‏باکتری ‏به ‏دست ‏آمد. ‏جداسازی ‏DNA ‏ژنومی ‏با ‏استفاده ‏از ‏کیت ‏استخراج ‏DNA ‏سیناژن ‏انجام ‏شد. ‏به ‏منظور ‏تخمین ‏کیفیت ‏و ‏کمیت ‏DNA ‏ژنومی ‏استخراج ‏شده، ‏جذب ‏محلول ‏رقیق ‏شده ‏DNA ‏(با ‏رقت ‏100) ‏در ‏طول ‏موج‏های ‏260 ‏و ‏280 ‏نانومتر ‏اندازه‏گیری ‏شد. ‏با ‏استفاده ‏از ‏رابطه ‏Conc.DNA (µg/ml)= 50.d.A₂₆₀ و ‏نسبت ‏A₂₆₀/A₂₈₀ ‏به ‏ترتیب ‏غلظت ‏DNA ‏و ‏میزان ‏خلوص ‏آن ‏تخمین ‏زده ‏شد. ‏پرایمر‏ها ‏مطابق ‏با ‏پرایمر‏های ‏عمومی ‏برای ‏تکثیر ‏ژن ‏16S rRNA‏‏ ‏به ‏شکل ‏زیر ‏با ‏استفاده ‏از ‏نرم‏‏افزار ‏‏Gene runner ‏طراحی ‏شدند ‏(15). ‏پرایمر ‏Forward: 5'-AGTTTGATCCTGGCTCCAG-3' ‏با T_m= 53.7‏درجه ‏سانتی‏گراد ‏و ‏پرایمر
‏5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'Reverse: ‏با ‏T_m= 53.4 ºC‏واکنش^‏زنجیره‏ای ‏پلیمراز ‏مطابق ‏با ‏برنامه ‏ذیل ‏انجام ‏شد. ‏دمای ‏اولیه ‏برای ‏جداشدن ‏دو ‏رشته ‏DNA، ‏94 ‏درجه ‏سانتی‏گراد ‏به ‏مدت ‏5 ‏دقیقه ‏بود. ‏باز ‏شدن ‏دو ‏رشته ‏در ‏دمای ‏94 ‏درجه ‏به ‏مدت ‏45 ‏ثانیه، ‏اتصال ‏پرایمرها ‏در ‏دمای ‏54 ‏درجه ‏به ‏مدت ‏45 ‏ثانیه، ‏طویل ‏شدن ‏رشته ‏هدف ‏در ‏72 ‏درجه ‏به ‏مدت ‏90 ‏ثانیه ‏و ‏مرحله ‏طویل ‏شدن ‏نهایی ‏در ‏دمای ‏72 ‏درجه ‏به ‏مدت ‏8 ‏دقیقه. ‏محصول ‏واکنش^‏زنجیره‏ای ‏پلیمراز ‏پس ‏از ‏الکتروفورز ‏ژل ‏آگاروز[56] ‏یک ‏درصد ‏با ‏استفاده ‏از ‏کیت ‏استخراج ‏DNA ‏خالص‏سازی ‏شد. ‏سپس، ‏توالی ‏DNA ‏با ‏استفاده ‏از ‏توالی‏یاب ‏DNA ‏توسط ‏شرکت ‏بیونیر ‏(کره ‏جنوبی) ‏تعیین ‏شد. ‏شباهت ‏توالی ‏نوکلئوتید‏های ‏ژن
16S rRNA‏‏ ‏جدایه‏های ‏تجزیه‏کننده ‏به ‏کمک ‏نرم‏افزار ‏BLAST ‏با ‏توالی‏های ‏ثبت ‏شده ‏در ‏پایگاه ‏اطلاعاتی ‏ژنوم ‏بانک ‏ژنی[57] ‏مقایسه ‏شد ‏(16). ‏به ‏این ‏ترتیب ‏نزدیک‏ترین ‏جدایه‏ها ‏با ‏ترادف ‏16S rRNA‏‏ ‏جدایه‏های ‏FA11، ‏FA8 ‏و ‏AB19 ‏تعیین ‏شد. ‏همچنین، ‏توالی‏های ‏به ‏دست ‏آمده ‏در ‏این ‏پژوهش ‏در ‏بانک ‏ژنی ‏مرکز ‏ملی ‏بیوتکنولوژی[58] ‏ثبت ‏و ‏شماره ‏دستیابی^‏[59] ژنی ‏مربوطه ‏دریافت ‏شد. ‏درخت ‏فیلوژنی ‏توالی ‏جدایه‏ها ‏با ‏توالی ‏حاصل ‏از ‏جستجو ‏در ‏پایگاه ‏اطلاعاتی ‏بانک ‏ژنی ‏به ‏کمک ‏نرم‏افزار ‏مگا ‏4[60] ‏با ‏روش‏ ‏neighbour joining ‏رسم ‏شد ‏(17). ‏

سنجش ‏فعالیت ‏آنزیمی: ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏جدایه ‏برتر ‏FA8 ‏بر ‏اساس ‏مقدار ‏آمونیاک ‏تولیدی ‏با ‏استفاده ‏از ‏روش ‏فنل- ‏هیپوکلریت[61] ‏سنجیده ‏شد ‏(18). ‏به ‏100 ‏میکرولیتر ‏محلول ‏رویی ‏محیط ‏مایع ‏حاوی ‏باکتری، ‏100 ‏میکرولیتر ‏استونیتریل ‏25 ‏میلی‏مولار ‏و ‏200 ‏میکرولیتر ‏بافر ‏فسفات ‏50 ‏میلی‏مولار ‏با ‏اسیدیته ‏7 ‏اضافه ‏شد. ‏مخلوط ‏حاصل ‏به ‏مدت ‏30 ‏دقیقه ‏در ‏دمای ‏30 ‏درجه ‏سانتی‏گراد ‏گرماگذاری ‏شد. ‏پس ‏از ‏آن، ‏مقادیر ‏400 ‏میکرولیتر ‏محلول A ‏(فنل[62] ‏59/0 ‏مولار ‏و ‏سدیم‏نیتروپروساید[63] ‏1 ‏میلی‏مولار) ‏و ‏400 ‏میکرولیتر ‏محلولB ‏(سدیم‏هیپوکلریت[64] ‏11/0 ‏مولار ‏و ‏سدیم ‏هیدروکسید ‏2 ‏مولار) ‏به ‏آن ‏اضافه ‏شد ‏(18). ‏پس ‏از ‏پدیدار ‏شدن ‏رنگ ‏آبی ‏مقدار ‏جذب ‏نمونه‏ها ‏در ‏طول ‏موج ‏600 ‏نانومتر ‏توسط ‏دستگاه ‏اسپکتروفتومتر[65] ‏خوانده ‏شد. ‏پس ‏از ‏رسوب ‏دادن ‏باکتری‏ها ‏علاوه ‏بر ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏محیط ‏کشت ‏فاقد ‏باکتری، ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏عصاره ‏باکتری ‏لیز ‏شده ‏نیز ‏سنجش شد. ‏در ‏تمامی ‏واکنش‏ها ‏از ‏محلول ‏شاهدی ‏که ‏در ‏آن ‏آنزیم ‏پس ‏از ‏انکوباسیون ‏مخلوط ‏واکنش ‏به ‏آن ‏اضافه ‏شده ‏بود ‏استفاده ‏شد. ‏از ‏این ‏رو، ‏یک ‏واحد ‏فعالیت ‏آنزیم ‏عبارت ‏است ‏از ‏مقدار ‏آنزیمی ‏که ‏قادر ‏است ‏1 ‏میکرو‏مول ‏آمونیاک ‏به ‏ازای ‏1 ‏دقیقه ‏در ‏شرایط ‏استاندارد ‏واکنش ‏آزاد ‏کند. ‏آزمایشات ‏3 ‏بار ‏تکرار ‏و ‏منحنی ‏استاندارد ‏توسط ‏آمونیوم ‏کلراید[66] ‏رسم ‏شد ‏(11 ‏و ‏13). ‏

.‏بهینه‏سازی ‏شرایط ‏تولید ‏آنزیم ‏در ‏حضور ‏منابع ‏مختلف: ‏برای ‏بهینه‏سازی ‏شرایط ‏تولید ‏آنزیم، ‏جدایه ‏FA8 ‏به ‏مدت ‏48 ‏ساعت ‏در ‏محیط ‏تولید ‏حداقل ‏نمک‏های ‏معدنی ‏حاوی ‏استونیتریل ‏در ‏حضور ‏منابع ‏مختلف ‏کربن ‏(گلوکز[67]، ‏مالتوز[68]، ‏فروکتوز[69] ‏و ‏نشاسته[70])، ‏منابع ‏مختلف ‏نیتروژن ‏(پپتون[71]، ‏عصاره ‏مخمر[72]) ‏و ‏اسیدیته‏های ‏مختلف ‏(5، ‏6، ‏7 و ‏8) ‏انکوبه ‏شد. ‏از ‏محیط ‏تولید ‏بدون ‏منابع ‏به ‏عنوان ‏شاهد ‏سنجش ‏استفاده ‏شد. ‏سنجش ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏بر ‏اساس ‏آمونیاک ‏تولیدی ‏طبق ‏روش ‏فنل- ‏هیپوکلریت ‏در ‏زمان‏های ‏24 ‏و ‏48 ‏ساعت ‏انجام ‏شد ‏و ‏میزان ‏جذب ‏در ‏طول ‏موج ‏600 ‏نانومتر ‏نیز ‏اندازه‏گیری ‏شد ‏(19). ‏

. ‏بررسی ‏مقدار ‏استیک‏‏اسید ‏تولیدی ‏توسط ‏جدایه ‏FA8: ‏ابتدا ‏جدایه ‏FA8 ‏درون ‏ارلن‏های ‏محیط ‏غنی‏سازی ‏حاوی ‏(گلوکز ‏10 ‏گرم، ‏عصاره ‏مخمر ‏5 ‏گرم، ‏پتاسیم ‏دی ‏هیدروژن ‏فسفات ‏2 ‏گرم، ‏سدیم ‏کلرید ‏1 ‏گرم، ‏سولفات ‏منیزیم ‏2/0 ‏گرم ‏در ‏یک ‏لیتر ‏آب ‏مقطر) ‏و ‏20 ‏میلی‏مولار ‏استونیتریل، ‏در ‏دمای ‏30 ‏درجه ‏سانتی‏گراد ‏و ‏160 ‏دور ‏در ‏دقیقه ‏به ‏مدت ‏48 ‏ساعت ‏گرماگذاری ‏شد. ‏پس ‏از ‏آن ‏سلول‏های ‏باکتری ‏توسط ‏سانتریفیوژ ‏برداشته ‏و ‏سوسپانسیونی ‏از ‏آن‏ها ‏در ‏بافر ‏فسفات ‏100 ‏میلی‏مولار، ‏اسیدیته ‏5/7 ‏تهیه ‏شد. ‏در ‏مخلوط ‏واکنش، ‏به ‏20 ‏میلی‏گرم ‏رسوب ‏باکتریایی، ‏استونیتریل ‏20 ‏میلی‏مولار ‏و ‏بافر ‏فسفات ‏100 ‏میلی‏مولار ‏با ‏اسیدیته ‏5/6 ‏اضافه ‏شد ‏و ‏به ‏مدت ‏48 ‏ساعت ‏در ‏دمای ‏30 ‏درجه ‏سانتی‏گراد ‏با ‏160 ‏دور ‏در ‏دقیقه ‏گرما‏گذاری ‏شد. ‏100 ‏میکرولیتر ‏نمونه ‏در ‏فواصل ‏معین ‏از ‏مخلوط ‏واکنش ‏برداشته ‏و ‏سپس، ‏سانتریفیوژ ‏شد. ‏سنجش ‏مقدار ‏آمونیاک ‏تولیدی ‏طبق ‏روش یاد شده ‏سنجیده ‏شد. ‏تحلیل ‏مقدار ‏استیک‏‏اسید ‏تولید ‏شده ‏از ‏فعالیت ‏نیتریل‏هیدرولازی ‏FA8 ‏با ‏تزریق ‏5 ‏میکرولیتر ‏محلول ‏رویی ‏حاصل ‏از ‏واکنش ‏مربوطه ‏در ‏بافر ‏فسفات ‏حاوی ‏استونیتریل، ‏به ‏دستگاه ‏کروماتوگرافی ‏گازی[73] ‏‏دارای ‏ستون ‏موئینه[74] ‏FFAP ‏‏و ‏شناساگر ‏یونیزاسیون ‏شعله‏ای‏FID ‏[75] ‏در ‏محدوده ‏دمایی ‏150 ‏تا ‏220 ‏درجه ‏سانتی‏گراد ‏انجام ‏شد. ‏گاز ‏نیتروژن ‏به ‏عنوان ‏گاز ‏حامل[76] ‏در ‏دستگاه ‏استفاده ‏شد ‏(20). ‏

نتایج. ‏

.غربال‏گری ‏باکتری‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریل: ‏آب‏انبار‏های ‏نمونه‏برداری ‏شده ‏در ‏قسمت ‏مرکزی ‏شهر ‏کرمان ‏و ‏در ‏مجموعه ‏گنجعلی‏خان ‏واقع ‏شده ‏است. ‏پس ‏از ‏بررسی ‏اولیه ‏توانایی ‏جدایه‏ها ‏در ‏تجزیه ‏استونیتریل، ‏جدایه ‏سودوموناس ‏FA8 ‏با ‏ایجاد ‏بیش‏ترین‏ ‏شدت ‏رنگ ‏صورتی ‏در ‏محیط ‏مایع ‏حاوی ‏فنل‏رد ‏برای ‏ادامه ‏مطالعات ‏انتخاب ‏شد ‏(شکل 1). ‏

. ‏شناسایی ‏بیوشیمیایی ‏باکتری‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریل: ‏برای ‏شناسایی ‏باکتری‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریل ‏FA8، ‏FA11 ‏و ‏AB19 ‏رنگ‏آمیزی ‏گرم ‏انجام ‏و ‏ویژگی‏های ‏میکروبیولوژیکی، ‏فیزیولوژیکی ‏و ‏بیوشیمیایی ‏جدایه‏ها، ‏بررسی ‏شد ‏(جدول 1). ‏

شکل 1- ‏تغییر ‏رنگ ‏محیط ‏مایع ‏حاوی ‏فنل‏رد ‏و ‏استونیتریل ‏از ‏زرد ‏به ‏شکلی ‏توسط ‏جدایه ‏FA8. ‏لوله ‏1 ‏(محیط ‏پایه)، ‏لوله ‏‏2 ‏(محیط ‏پایه ‏+ ‏فنل‏رد)، ‏لوله ‏‏3 ‏(محیط ‏پایه ‏+ ‏سوبسترا ‏+ ‏فنل‏رد)، ‏لوله ‏‏4 ‏(محیط ‏پایه ‏+ ‏سوبسترا ‏+ ‏فنل‏رد ‏+ ‏باکتری ‏فاقد ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏نیتریل ‏هیدرولاز) و ‏لوله ‏‏5 ‏(محیط ‏پایه ‏+ ‏سوبسترا ‏+ ‏فنل‏رد ‏+ ‏جدایه ‏FA8). ‏

جدول 1- ‏نتایج ‏میکروبیولوژیکی، ‏فیزیولوژیکی ‏و ‏بیوشیمیایی ‏باکتری‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریل

آزمون	FA11	FA8	AB19	آزمون	FA11	FA8	AB19
شکل ‏باکتری	کوکوباسیل	کوکوباسیل	کوکوباسیل	هیدرولیز ‏کازئین	+	+	+
واکنش ‏گرم	-	-	-	گاز	-	-	-
ویژگی‏های ‏کلونی	متوسط ‏مقعر ‏سفید	متوسط ‏مقعر ‏سفید	کوچک ‏محدب ‏زرد	اندول	-	-	-
اوره‏آز	-	-	+	سولفید ‏هیدروژن	-	-	-
اسپور	-	-	-	متیل‏رد	-	-	-
پیگمان	-	-	-	وژز ‏پروسکوئر	-	-	-
احیا ‏نیترات	+	+	-	مصرف ‏نشاسته	-	-	-
حرکت	+	+	+	هیدرولیز ‏ژلاتین	+	+	+
تریپل ‏شوگر ‏آیرون	قلیا/ قلیا	قلیا/ قلیا	قلیا/ قلیا	مصرف ‏سیترات	+	+	+
فعالیت ‏کاتالازی	+	+	+	مصرف ‏گلوکز	+	+	+
فعالیت ‏اکسیدازی	+	+	+	رشد ‏در ‏4 درصد ‏نمک	+	+	+

. ‏شناسایی ‏جدایه‏ها ‏با ‏استفاده ‏از ‏تعیین ‏توالی ‏ژن
‏16s rRNA‏: ‏شناسایی ‏جدایه‏ها ‏با ‏استفاده ‏از ‏تعیین ‏توالی ‏ژن ‏16s rRNA‏ ‏انجام ‏شد. ‏برای ‏تهیه ‏DNA ‏ژنومی ‏باکتری ‏از ‏کیت ‏استخراج ‏DNA ‏سیناژن ‏استفاده ‏شد ‏و ‏DNA ‏تکثیر ‏یافته ‏با ‏استفاده ‏از ‏واکنش ‏زنجیره‏ای ‏پلیمراز ‏توسط ‏کیت ‏تخلیص ‏DNA ‏از ‏شرکت ‏سیناژن ‏تخلیص ‏شد ‏و ‏سپس، ‏برای ‏تعیین ‏توالی ‏به ‏شرکت ‏بیونیر ‏(کره ‏جنوبی) ‏ارسال ‏شد. ‏

پس ‏از ‏تعیین ‏توالی ‏محصول ‏واکنش ‏زنجیره‏ای ‏پلیمراز ‏سه ‏جدایه ‏و ‏مقایسه ‏با ‏سایر ‏ژن‏های ‏16s rRNA‏، ‏درخت ‏فیلوژنتیکی ‏برای ‏آن‏ها ‏رسم ‏شد ‏(شکل 2). ‏رسم ‏درخت ‏فیلوژنتیک ‏با ‏استفاده ‏از ‏نرم‏افزار ‏مگا ‏4 ‏انجام ‏شد. ‏نتایج به دست آمده ‏از ‏تطبیق ‏توالی ‏و ‏درخت ‏فیلوژنتیکی ‏نشان ‏دادند ‏که ‏جدایه‏های ‏FA11 ‏و ‏FA8 ‏به ‏گونه ‏سودوموناس ‏اوتیدیس ‏و ‏جدایه ‏AB19 ‏نیز ‏به ‏گونه ‏سودوموناس ‏جنیکولاتا[77] ‏با ‏میزان ‏شباهت ‏نوکلئوتیدی ‏99 ‏و ‏100 ‏درصد ‏به ‏ترتیب ‏نزدیک ‏هستند. ‏توالی ‏نوکلئوتیدی ‏جدایه‌های ‏FA11، ‏FA8 ‏و ‏AB19 ‏به ‏ترتیب ‏با ‏شماره ‏دسترسی KM229752.1، KM229748.1 و KM229753.1 ‏در ‏بانک ‏ژن ‏ثبت ‏شد. ‏

شکل 2- ‏درخت ‏فیلوژنی ‏جدایه‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریل، ‏سودوموناس ‏FA8، ‏سودوموناس ‏FA11 ‏و ‏سودوموناس ‏AB19 ‏جداشده ‏از ‏آب‏انبار. ‏اعداد ‏یاد ‏شده ‏در ‏محل ‏انشعاب ‏نشانگر ‏درصد ‏نمونه‏گیری ‏bootstrape ‏از ‏1000 ‏نمونه ‏است. ‏لیزینی ‏باسیلوس ‏اسفاریکوس ‏نیز ‏به عنوان ‏outgroup ‏در ‏نظر ‏گرفته ‏شد. ‏

. ‏بررسی ‏میزان ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏در ‏طی ‏زمان: ‏مقایسه ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏پس ‏از ‏72 ‏ساعت ‏در ‏حضور ‏و ‏عدم ‏حضور ‏سوبسترا ‏در ‏سودوموناس ‏FA8 ‏در ‏جدول 2 ‏نشان ‏داده ‏شد. ‏در ‏حالت ‏سنجش ‏با ‏سوبسترا ‏علاوه ‏بر ‏میزان ‏آمونیاک ‏تولیدی ‏حاصل ‏از ‏تجزیه ‏استونیتریل، ‏فعالیت ‏نیتریل‏هیدرولازی ‏نیز ‏سنجیده ‏می‏شود. ‏این ‏در ‏حالی‏ ‏است ‏که ‏در ‏حالت ‏بدون ‏سوبسترا ‏فقط ‏میزان ‏آمونیاک ‏تولیدی ‏سنجیده ‏می‏شود. ‏این ‏موضوع ‏در ‏نتایج ‏به ‏دست ‏آمده ‏از ‏سودوموناس ‏FA8 ‏کاملا ‏صدق ‏می‏کند. ‏. ‏بررسی ‏شرایط ‏تولید ‏آنزیم ‏در ‏حضور ‏منابع ‏مختلف: ‏ اثر‏منابع ‏مختلف ‏کربن: ‏اثر ‏منابع ‏مختلف ‏کربن ‏به ‏میزان ‏10 ‏گرم ‏بر ‏لیتر ‏(گلوکز، ‏فروکتوز، ‏مالتوز ‏و ‏نشاسته)، ‏بر ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏سودوموناس ‏FA8 ‏در ‏جدول 3 ‏نشان ‏داده ‏شد. ‏نتایج ‏نشان ‏دادند ‏که ‏مالتوز ‏در ‏مقایسه ‏با ‏شاهد ‏باعث ‏کاهش ‏تولید ‏آنزیم ‏شده ‏است. ‏در ‏مقابل ‏گلوکز، ‏نشاسته ‏و ‏تا ‏حدودی ‏فروکتوز ‏موجب ‏افزایش ‏تولید ‏آنزیم ‏شده ‏است. ‏در ‏بین ‏منابع ‏مورد ‏بررسی ‏گلوکز ‏اثر در خور ‏توجهی ‏بر ‏تولید ‏آنزیم ‏دارد. ‏

اثر ‏منابع ‏نیتروژن: ‏اثر ‏منابع ‏نیتروژن ‏عصاره ‏مخمر ‏و ‏پپتون ‏(5 ‏گرم ‏بر ‏لیتر)، ‏بر ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏سودوموناس ‏FA8 ‏درجدول ‏4 ‏نشان ‏داده ‏شد. ‏نتایج ‏نشان ‏دادند ‏که ‏عصاره ‏مخمر ‏در ‏مقایسه ‏با ‏کنترل ‏و ‏پپتون ‏اثر در خور ‏توجهی ‏بر ‏تولید ‏آنزیم ‏دارد. ‏

اثر ‏اسیدیته ‏بر ‏تولید ‏آنزیم: ‏بررسی ‏تاثیر ‏اسیدیته ‏بر ‏روی ‏تولید ‏آنزیم ‏سودوموناس ‏FA8 ‏با ‏انتخاب ‏اسیدیته‏های ‏های ‏مختلف ‏5 ‏تا ‏8 ‏در ‏محیط ‏کشت ‏انجام ‏شد ‏(جدول ‏5). ‏نتایج ‏پس ‏از ‏48 ‏ساعت ‏رشد ‏باکتری ‏در ‏دمای ‏30 ‏درجه ‏سانتی‏گراد ‏نشان ‏داد ‏که ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏در ‏محدوده ‏6 ‏تا ‏7 ‏افزایش ‏و ‏سپس، ‏به ‏آرامی ‏در ‏اسیدیته ‏8 ‏دچار ‏کاهش ‏شده ‏است. ‏اسیدیته ‏بهینه برای ‏تولید ‏آنزیم ‏7 ‏است، ‏به ‏این ‏ترتیب ‏قبل ‏از ‏انجام ‏استریلیزاسیون ‏محیط، ‏اسیدیته ‏آن ‏بین ‏6 تا 7 ‏تنظیم ‏شد. ‏

جدول 2- ‏مقایسه ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏پس ‏از ‏72 ‏ساعت ‏در ‏حضور ‏و ‏عدم ‏حضور ‏سوبسترا ‏در ‏جدایه ‏FA8

72	0	زمان ‏(ساعت) ‏
2/0± ‏365/0	2/0 ‏± ‏125/0	عدم ‏حضور ‏سوبسترا
2/0± ‏515/0	2/0 ‏± ‏135/0	در ‏حضور ‏سوبسترا

جدول 3- ‏اثر ‏منابع ‏مختلف ‏کربن ‏بر ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏سودوموناس ‏FA8

جذب ‏600 ‏نانومتر	تولید ‏آمونیاک ‏(درصد) ‏	منبع ‏کربن
610/0± ‏3/0	100	کنترل
678/1 ‏± ‏3/0	443	گلوکز
217/1 ‏± ‏3/0	137	فروکتوز
910/0 ‏± ‏3/0	93	مالتوز
504/1 ‏± ‏3/0	387	نشاسته

جدول 4- ‏اثر ‏منابع ‏مختلف ‏نیتروژن ‏بر ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏سودوموناس ‏FA8

جذب ‏600 ‏نانومتر	تولید ‏آمونیاک ‏(درصد) ‏	منبع ‏نیتروژن
215/1 ‏± ‏2/0	100	کنترل
428/1 ‏2/0±	118	پپتون
921/1 ‏2/0±	427	عصاره ‏مخمر

جدول 5- ‏اثر ‏منابع ‏مختلف ‏اسیدیته ‏بر ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏سودوموناس ‏FA8

جذب ‏600 ‏نانومتر	تولید ‏آمونیاک ‏(درصد)‏	اسیدیته
774/0 ‏± ‏03/0	62	5
933/0 ‏± ‏03/0	74	6
953/0 ‏± ‏03/0	100	7
141/1 ‏± ‏03/0	65	8

.بررسی ‏میزان ‏استونیتریل ‏و ‏استیک‏‏اسید ‏با ‏کروماتوگرافی ‏گازی: ‏کروماتوگرافی ‏گازی^‏به‏‏طور ‏مستدل ‏از ‏دقیق‏ترین ‏و ‏حساس‏ترین ‏روش‏های ‏کروماتوگرافی ‏است. ‏با ‏این ‏روش ‏می‏توان ‏اجزای ‏موجود ‏در ‏یک ‏مخلوط ‏را ‏از ‏نظر ‏کیفی ‏و ‏کمی، ‏البته ‏با ‏در ‏دست ‏داشتن ‏شاهد ‏جداسازی کرد ‏(21). ‏در ‏یک ‏کروماتوگرام[78] ‏حاصل ‏از ‏جداسازی، ‏به‏طور معمول ‏مساحت ‏زیر ‏منحنی ‏به ‏دست ‏آمده ‏که ‏به ‏شکل ‏درصد ‏نشان ‏داده ‏می‏شود ‏که ‏مقدار ‏ماده ‏موجود ‏در ‏مخلوط ‏را ‏نشان ‏می‏دهد. ‏به‏‏طور ‏کلی ‏تجزیه ‏ترکیبات ‏نیتریل ‏توسط ‏دو ‏مسیر ‏آنزیمی ‏انجام می‏شود. ‏در ‏مسیر ‏اول، ‏آنزیم ‏نیتریلاز ‏به ‏شکل ‏مستقیم ‏ترکیبات ‏نیتریلی ‏را ‏به ‏اسید‏های ‏مربوطه ‏تبدیل ‏می‏کند ‏و ‏مقدار ‏زیادی ‏آمونیاک ‏نیز ‏به ‏عنوان ‏محصول ‏اصلی ‏تولید ‏می‏شود. ‏در ‏مسیر ‏دوم، ‏آنزیم ‏نیتریل ‏هیدراتاز ‏با ‏همکاری ‏آنزیم ‏آمیداز، ‏ترکیبات ‏نیتریلی ‏را ‏با ‏تولید ‏حد واسط ‏آمید ‏مربوطه ‏به ‏اسید ‏تبدیل ‏می‏کند. ‏

کروماتوگرام ‏به ‏دست ‏آمده ‏از ‏فعالیت ‏سودوموناس ‏FA8 ‏در ‏شکل 3 ‏نشان ‏داده ‏شده ‏است. ‏در ‏‏پژوهش حاضر، ‏محلول ‏رویی ‏حاصل ‏از ‏واکنش ‏تغییر ‏شکل ‏زیستی ‏سودوموناس ‏FA8 ‏در ‏حضور ‏سوبسترای ‏استونیتریل ‏در ‏زمان‏های ‏16، ‏30 ‏و ‏48 ‏ساعت ‏تحلیل شد ‏و ‏کروماتوگرام ‏به ‏دست ‏آمده ‏با ‏نمونه‏های ‏استاندارد ‏استونیتریل، ‏استامید[79] ‏و ‏استیک‏‏اسید[80] ‏مقایسه ‏شد. ‏نتایج ‏نشان ‏داد ‏که ‏سودوموناس ‏FA8 ‏دارای ‏توانایی ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏موجود ‏در ‏محیط ‏کشت ‏به ‏استیک‏‏اسید ‏است. ‏البته ‏این ‏نکته شایان ‏توجه ‏است ‏که ‏مقداری ‏از ‏محصول ‏تولیدی، ‏پس ‏از ‏یک ‏بازه ‏زمانی ‏و ‏به ‏علت ‏کمبود ‏منابع ‏انرژی ‏در ‏محیط ‏توسط ‏باکتری ‏مصرف ‏می‏شود. ‏کاهش ‏مساحت ‏زیر ‏منحنی ‏استونیتریل ‏در ‏زمان ‏69/3 ‏دقیقه ‏پس ‏از ‏تزریق، ‏نشان‏دهنده ‏مصرف ‏تدریجی ‏این ‏ماده ‏در ‏طی ‏زمان ‏انکوباسیون ‏و ‏از ‏طرفی ‏افزایش ‏مساحت ‏زیر ‏منحنی ‏استیک‏‏اسید ‏در ‏زمان ‏39/5، ‏تولید ‏این ‏محصول ‏را ‏به ‏شکل ‏تدریجی ‏نشان ‏می‏دهد. ‏به‏‏طور ‏کلی، ‏در ‏طی ‏یک ‏تحلیل ‏فعالیت ‏آنزیمی، ‏کاهش ‏مساحت ‏زیر ‏منحنی ‏در ‏مورد ‏سوبسترا ‏و ‏افزایش ‏مساحت ‏زیر ‏منحنی ‏در ‏مورد ‏محصول ‏تولیدی ‏در ‏مقایسه ‏با ‏زمان ‏خروج ‏مواد ‏استاندارد ‏تزریق ‏شده، ‏از ‏روند ‏درست ‏تجزیه ‏خبر ‏می‏دهد ‏که ‏این ‏امر ‏در ‏مورد ‏سودوموناس ‏FA8 ‏طبق ‏نتایج ‏به ‏دست ‏آمده ‏در ‏16 ‏ساعت ‏اولیه ‏سنجش ‏به ‏دست ‏آمده ‏است ‏و ‏تا ‏زمان ‏48 ‏ساعت ‏ادامه ‏دارد. ‏سودوموناس ‏FA8 ‏در ‏زمان ‏16 ‏ساعت ‏اولیه، ‏به ‏میزان ‏5 ‏درصد ‏استیک‏‏اسید ‏از ‏تجزیه ‏7 ‏درصد ‏استونیتریل ‏تولید ‏کرده ‏است ‏که ‏در ‏زمان ‏30 ‏ساعت ‏این ‏مقدار ‏به ‏16 ‏درصد ‏محصول ‏از ‏73 ‏درصد ‏سوبسترا ‏رسیده ‏است. ‏در ‏پایان، ‏بررسی ‏فعالیت ‏آنزیم ‏و ‏تولید ‏محصول ‏تنها ‏23 ‏درصد ‏استونیتریل ‏باقی ‏مانده ‏است ‏و ‏باکتری ‏توانسته ‏است ‏با ‏تجزیه ‏77 ‏درصد ‏استونیتریل، ‏58 ‏درصد ‏استیک‏‏اسید ‏تولید ‏کند ‏که ‏به ‏نوبه ‏خود ‏عدد در خور ‏توجهی ‏است ‏و ‏توانایی ‏بالقوه ‏باکتری ‏در ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏را ‏نشان ‏می‏دهد ‏(شکل ‏3). ‏بنابراین، ‏باکتری ‏در ‏بازه‏ ‏زمانی ‏30 تا 48 ساعت ‏بیش‏ترین‏ ‏فعالیت ‏تغییر ‏شکل ‏زیستی ‏استونیتریل ‏را داشته است. ‏

شکل 3- ‏کروماتوگرام ‏حاصل ‏از ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏و ‏تولید ‏استیک‏‏اسید ‏توسط ‏سویه ‏سودوموناس ‏FA8. ‏الف) ‏استونیتریل ‏استاندارد ‏در ‏زمان ‏خروج ‏69/3 ‏دقیقه. ‏ب) ‏استیک‏‏اسید ‏استاندارد ‏در ‏زمان ‏خروج ‏39/5 ‏دقیقه. ‏پ) ‏نمونه ‏16 ‏ساعت، ‏استونیتریل ‏92 ‏درصد ‏و ‏استیک‏‏اسید ‏5 ‏درصد. ‏ج) ‏نمونه ‏30 ‏ساعت، ‏استونیتریل ‏27 ‏درصد ‏و ‏استیک‏‏اسید ‏16 ‏درصد. ‏د) ‏نمونه ‏48 ‏ساعت، ‏استونیتریل ‏23 ‏درصد ‏و ‏استیک‏‏اسید ‏58 ‏درصد. ‏

بحث ‏و ‏نتیجه‏‏گیری. ‏

در ‏این ‏پژوهش ‏از ‏میان ‏سه ‏جدایه، ‏سودوموناس ‏FA8 ‏با ‏ایجاد ‏بیش‏ترین‏ ‏قطر ‏هاله ‏و ‏شدت ‏رنگ ‏حاصل ‏از ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏به ‏آمونیاک ‏و ‏استیک‏‏اسید ‏در ‏محیط ‏حداقل ‏نمک‏های ‏معدنی، ‏جداسازی ‏و ‏شناسایی ‏شد. ‏آمونیاک ‏محصول ‏اصلی ‏تجزیه ‏ترکیبات ‏نیتریلی ‏است. ‏اگر ‏باکتری ‏قادر ‏به ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏باشد ‏با ‏تبدیل ‏آن ‏به ‏استیک‏اسید ‏و ‏آمونیاک، ‏باعث ‏تجمع ‏آمونیاک ‏در ‏محیط ‏و ‏قلیایی ‏شدن ‏اسیدیته ‏و ‏تغییر ‏رنگ ‏معرف ‏فنل ‏رد ‏از ‏زرد ‏به ‏صورتی ‏می‏شود ‏(13). ‏مقدار ‏آمونیاک ‏تولیدی ‏حاصل ‏از ‏فعالیت ‏آنزیم ‏جدایه ‏در ‏این ‏پژوهش ‏بر ‏اساس ‏روش ‏فنل- هیپوکلریت ‏و ‏دستگاه ‏اسپکتروفتومتر ‏بررسی ‏شد. ‏این ‏مطلب ‏واضح ‏است ‏که ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏آغاز ‏تجمع ‏آمونیاک ‏در ‏محیط ‏کشت ‏است. ‏آمونیاک ‏اضافی ‏در ‏محیط، ‏‏به ‏افزایش ‏اسیدیته ‏محیط ‏از ‏مقدار ‏اولیه ‏آن ‏منجر می‏شود. ‏ناگشوار[lxxxi] ‏و ‏همکاران ‏از ‏تغییر ‏میزان ‏اسیدیته ‏محیط ‏در ‏اثر ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏در ‏60 ‏ساعت ‏اول، ‏از ‏مقدار ‏7 ‏به ‏2/9 ‏اشاره کردند ‏(13). ‏این ‏مورد ‏در ‏مورد ‏جدایه ‏FA8 ‏در ‏48 ‏ساعت ‏اولیه‏ ‏رشد ‏از ‏مقدار ‏7 ‏به ‏28/9 ‏به‏دست ‏آمده ‏است. ‏افزایش ‏میزان ‏جذب ‏که ‏در ‏زمان ‏استفاده ‏از ‏سوبسترا ‏در ‏زمان ‏72 ‏ساعت ‏سنجش ‏مشاهده ‏می‏شود، ‏نشانگر ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏علاوه ‏بر ‏تولید ‏آمونیاک ‏است ‏که ‏در ‏حالت ‏عدم ‏حضور ‏سوبسترا ‏دیده ‏نمی‏شود. ‏

بیش‏ترین‏ ‏فعالیت ‏نیتریل ‏هیدرولازی ‏جدایه، ‏در ‏محیط ‏خنثی ‏حاوی ‏گلوکز ‏به ‏عنوان ‏منبع ‏کربن ‏و ‏عصاره ‏مخمر ‏به ‏عنوان ‏منبع ‏نیتروژن ‏است. ‏اسیدیته ‏خنثی ‏به ‏عنوان ‏مناسب‏ترین ‏اسیدیته ‏برای ‏تولید ‏آنزیم ‏در ‏بیشتر ‏باکتری‏ها ‏گزارش ‏شده ‏است ‏(22). ‏دانگ[lxxxii] ‏و ‏همکاران ‏گزارش ‏کردند ‏که ‏عصاره ‏مخمر ‏و ‏پپتون ‏از ‏جمله ‏منابع ‏نیتروژن ‏مناسب ‏در ‏جهت ‏افزایش ‏تولید ‏فعالیت ‏آنزیم ‏باکتری ‏رودوکوکوس ‏اریتروپولیس[lxxxiii] ‏ZJB-0910^‏ هستند ‏(23). ‏ناگشوار ‏و ‏همکاران ‏نیز ‏گزارش ‏کردند ‏که ‏مناسب‏ترین ‏تولید ‏آنزیم ‏آلکالیژنز ‏فکالیس ‏MTCC10757[lxxxiv]، ‏در ‏زمان ‏استفاده ‏از ‏گلوکز ‏به ‏عنوان ‏منبع ‏کربن ‏است ‏(19). ‏کروماتوگرافی ‏گازی^‏یکی ‏از ‏روش‏های ‏فیزیکی برای ‏جداسازی ‏و ‏خالص‏سازی ‏مواد ‏فرار ‏است. ‏استونیتریل ‏و ‏محصولات ‏حاصل ‏از ‏تجزیه ‏آن ‏از ‏جمله ‏مواد ‏فرار ‏محسوب ‏می‏شوند ‏که ‏سنجش ‏دقیق ‏مقدار ‏مصرفی ‏و ‏تولیدی ‏آن‏ها ‏به ‏کمک ‏روش ‏کروماتوگرافی ‏بسیار ‏توصیه ‏می‏شود (21). ‏در ‏کروماتوگرام ‏حاصل ‏از ‏تحلیل، ‏کاهش ‏مساحت ‏زیر ‏منحنی ‏در ‏مورد ‏سوبسترا ‏و ‏افزایش ‏مساحت ‏زیر ‏منحنی ‏در ‏مورد ‏محصول ‏تولیدی ‏در ‏مقایسه ‏با ‏زمان ‏خروج ‏مواد ‏استاندارد ‏تزریق ‏شده، ‏از ‏روند ‏درست ‏تجزیه ‏خبر ‏‏می‏دهد ‏که ‏این ‏امر ‏در ‏مورد ‏جدایه ‏FA8 ‏طبق ‏نتایج ‏به ‏دست ‏‏آمده ‏در ‏طی ‏48 ‏ساعت ‏سنجش ‏به ‏دست ‏آمده ‏است. ‏نتایج ‏به ‏دست ‏آمده ‏از ‏کروماتوگرام ‏حاصل ‏نشان ‏می‏دهد ‏که ‏این ‏جدایه ‏بیش‏ترین‏ ‏درصد ‏تولید ‏استیک‏‏اسید ‏(58 درصد) ‏را ‏با ‏تجزیه ‏77 ‏درصد ‏استونیتریل ‏در ‏زمان ‏30 ‏تا ‏48 ‏انکوباسیون ‏را ‏نشان ‏می‏دهد ‏که ‏به ‏نوبه ‏خود ‏عدد ‏در خور ‏توجهی ‏است ‏و ‏نشان‏دهنده ‏افزایش ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏در ‏این ‏بازه ‏است. ‏

استفاده ‏باکتری ‏سودوموناس ‏FA8 ‏از ‏مواد ‏ارزان ‏و ‏قابل ‏دسترس ‏همچون ‏گلوکز ‏و ‏عصاره ‏مخمر ‏در ‏محیط ‏و ‏تولید ‏آنزیم ‏با ‏فعالیت ‏بالا ‏از ‏جمله ‏ویژگی‏هایی ‏است ‏که ‏این ‏جدایه ‏را ‏در ‏مباحث ‏بیوتکنولوژی ‏شایان ‏توجه ‏می‏سازد. ‏با ‏توجه ‏به ‏ویژگی‏های ‏باکتری ‏و ‏پتانسیل ‏بالای ‏آن ‏در ‏تولید ‏آنزیم، ‏این ‏باکتری ‏می‏تواند ‏ضمن ‏پاک‏سازی ‏آلاینده‏های ‏زیست‏محیطی ‏در ‏تولید ‏زیستی ‏ترکیبات ‏با‏ ‏ارزش ‏دارویی ‏و ‏صنعتی ‏نیز ‏استفاده ‏شود. ‏

تشکر ‏و ‏قدردانی

از ‏معاونت ‏پژوهشی ‏دانشگاه ‏شهید ‏باهنر ‏کرمان، ‏تشکر و قدردانی می‏شود.

[1]- Nitriles

[2]- Cyanoglycoside

[3]- Cyanolipid

[4]- Indole-3-acetonitrile

[5]- β-cyano-L-alanine

[6]- Ketone

[7]- Aldehydes

[8]- HCN

[9]- Nitrile hydrolases

[10]- Nitrilase

[11]- Nitrile hydratase

[12]- Amidase

[13]- Nicotinamide

[14]- 5-cyanovaleramide

[15]- Acrylamide

[16]- Nitrile aminohydrolase

[17]- Pseudomonas

[18]- Indole-3-acetic acid

[19]- Auxin

[20]- Nicotinic acid

[21]- Niacin

[22]- 3-cyanopyridine

[23]- R- (-) -mandelic acid

[24]- Mandelonitrile

[25]- Acinetobacter

[26]- Rhodococcus

[27]- Klebsiella

[28]- Arthrobacter

[29]- Corynebacterium

[30]- Nocardia

[31]- Acetonitrile

[32]- Pseudomonas otitidis FA8

[33]- Sigma Aldrich

[34]- The polymerase chain reaction

[35]- Merck

[36]- Bioneer

[37]- Mineral Salts Medium

[38]- K₂HPO₄

[39]- KH₂PO₄

[40]- MgSO₄

[41]- MnSO₄

[42]- CaCl₂

[43]- FeSO₄

[44]- Na₂MoO4

[45]- HCl

[46]- NaOH

[47]- Agar

[48]- Phenol red

[49]- Triptical Soy Agar

[50]- Gram straining

[51]- Methyl Red

[52]- Voges-Proskauer

[53]- Bergey's Manual of Systematic Bacteriology

[54]- Nutrient agar

[55]- Centrifuge

[56]- Agarose

[57]- Gene Bank

[58]- http://www.ncbi.nlm.nih.gov (NCBI)

[59]- Accession Number

[60]- MEGA4

[61]- Phenol/hypochlorite

[62]- Phenol

[63]- Sodium nitroprosside

[64]- Sodium hypochlorite

[65]- Spectrophotometer

[66]- Ammonium chloride

[67]- Glucose

[68]- Maltose

[69]- Fructose

[70]- Starch

[71]- Peptone

[72]- Yeast extract

[73]- Gas Chromatography (Agilent, Santa Clara, N6890 CA)

[74]- Capillary (FFAP (30 m, 0.25 mm,0.33 ml))

[75]- Flame Ionization Detector

[76]- Carrier Gas

[77]- Pseudomonas geniculate

[78]- Chromatogram

[79]- Acetamide

[80]- Acetic acid

[lxxxi]- Nageshwar

[lxxxii]- Dong

[lxxxiii]- Rhodococcus erythropolis ZJB-0910

[lxxxiv]- Alcaligenes faecalis MTCC 10757

مراجع

(1) Knowles CJ., Bunch AW. Microbial cyanide metabolism. Advanced microbialphysiology. London: Academic Press; 1986.

(2) Vennesland B., Conn EE., Knowles CJ., westley J., Wissing F. Biosynthesis of cyanogenic glycosides. London: Academic Press; 1981.

(3) Banergee A., SharmaR., Banerjee UC. The nitrile degrading enzymes: current status and future prospects. Journal of Applied Microbiology and Biotechnology 2002; 60 (1- 2): 33- 44.

(4) He YC., Xu JH., Su JH., Zhou L. Bioproduction of glycolic acid from glycolonitrile with a new bacterial isolate of Alcaligenes sp. ECU0401. Journal of Applied Biochemistry and Biotechnology 2010; 37 (7): 741- 50.

(5) Vogel AL. Quantitative inorganic analysis including elementary instrumental analysis. 3^rd ed. London: Lowe and Bryodne Ltd; 1969.

(6) Bestwick L., Gronning L., James D., Bones A., Rossiter J. Purification and characterization of a nitrilase from Brassicanapus. Plant Physiology 1993; 89 (43): 611- 18.

(7) Geronimo MJ., Antoine AD. Metabolism of acetonitrile and propionitrile by Nocardia rhodochrous LL100- 21. Journal of Applied and Environmental Microbiology 1976; 31 (6): 900- 06.

(8) O’Reilly C., Turner PD. The nitrilase family of CN hydrolysing enzymes a comparative study. Journal of Applied Microbiology. 2003; 95 (6): 1161- 1174.

(9) Thimann KV., Mahadevan S. Nitrilase; Occurrence, preparation and general properties of the enzyme. Archives of Biochemistry and Biophysics 1964; 105 (1): 133- 41.

(10) Hook RH., Robinson WG. Ricinine nitrilase II. Purification and properties. Journal of Biological Chemistry 1964; 239 (12): 4263- 7.

(11) Collins P., Knowles C. The utilization of nitriles and amides by Nocardia rhodochrous. Journal of General Microbiology 1983; 129 (1): 248- 54.

(12) Bhalla TC., Kumar H. Nocardia globerula NHB-2: a versatile nitrile-degrading organism. Canadian Journal of Microbiology 2005; 51 (8):705- 08.

(13) Santoshkumar M., Anand S., Nayak O., Anjaneya B. A plate method for screening of bacteria capable of degrading aliphatic nitriles. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 2010; 37 (3): 111- 15.

(14) Leavesley HB., Li L., Prabhakaran K., Borowitz JL., Isom GE. Interaction of cyanide and nitric oxide with cytochrome oxidase: implications for acute cyanide toxicity. Toxicological Sciences 2008; 101 (1): 101- 11.

(15) Badoei- Dalfard A., Amiri-Bahrami M., Riahi-Madvar A., Karami Z., Ebrahimi M A. Isolation, identification and characterization of organic solvent tolerant protease from Bacillus sp. DAF-01. Biological Journal of Microorganism 2012; 1 (2): 37- 48.

(16) Kim OS., Cho YJ., Lee K., Yoon SH., Kim M., Na H., et al. Introducing EzTaxon-e: a prokaryotic 16S rRNA gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2012; 62 (3): 716- 21.

(17) Edwards U., Rogall T., Blocker H., Emde M., Bottger EC. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes. Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA. Nucleic Acids Research 1989; 17 (19): 7843- 53.

(18) Fawcett J K., Scott JE. A rapid and precise method for the determination of urea. Journal of Clinical Pathology 1960; 13 (2): 156- 9.

(19) Nageshwar YVD., Sheelu G., Shambhu RR., Muluka H., Nooreen M., Malik MS., et al. Optimization of nitrilase production from Alcaligenes faecali MTCC 10757 (IICT-A3): effect of inducers on substrate specificity. Journal of Bioprocess and Biosystems Engineering 2011; 34 (5): 515- 23.

(20) Jin LQ., Li YF., Liu ZQ., Zheng YG., Shen YC. Characterization of a newly isolated strain Rhodococcus erythropolis ZJB-09149 transforming 2-chloro-3-cyanopyridine to 2- chloronicotinic acid. Journal of New Biotechnology 2011; 28 (6): 610- 615.

(21) Skoog DA., Holler JA., Nieman TA. Principles of Instrumental Analysis. 5th ed. London: Sanders College; 1999.

(22) Robinson WG., Hook RH. Ricinine nitrilase. I. Reaction product and substrate specificity. Journal of Biology and Chemistry 1964; 239 (1): 4257- 62.

(23) Dong HP., Liu ZQ., Zheng YG., Shen YC. Medium optimization for nitrilase production by newly isolated Rhodococcus erythropolis ZJB-0910 using statistical designs. Journal of Applied Microbiology and Biotechnology 2010; 25 (3): 351- 8.

آمار

تعداد مشاهده مقاله: 1,315

تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 836

سامانه مدیریت نشریات علمی. قدرت گرفته از سیناوب

پیوندهای مفید

اخبار و اعلانات

آمار

جداسازّی ‏و ‏شناسایی ‏سویه‏ های ‏سودوموناس ‏تجزیه‏ کننده ‏استونیتریل از ‏آب‏ انبار ‏گنجعلی ‏خان ‏کرمان