پیوندهای مفید
اخبار و اعلانات
آمار
| تعداد نشریات | 43 |
| تعداد شمارهها | 1,682 |
| تعداد مقالات | 13,762 |
| تعداد مشاهده مقاله | 32,223,397 |
| تعداد دریافت فایل اصل مقاله | 12,752,459 |
تعیین و مدل سازی شرایط بهینه کاتالیتیکی آنزیم بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| زیست شناسی میکروبی | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مقاله 2، دوره 5، شماره 17، خرداد 1395، صفحه 1-14 اصل مقاله (850.03 K) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| نوع مقاله: پژوهشی- فارسی | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| شناسه دیجیتال (DOI): 10.22108/bjm.2016.20364 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| نویسندگان | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| شعله ده پهلوان1؛ جلیل خارا2؛ مریم موسیوند3؛ مریم هاشمی* 4 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1کارشناس ارشد فیزیولوژی گیاهی، دانشگاه ارومیه، ایران | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2دانشیار فیزیولوژی گیاهی، دانشگاه ارومیه، ایران | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 3کارشناسی ارشد بیماری شناسی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، کرج، ایران | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 4استادیار بیوتکنولوژی غذایی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، کرج، ایران | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| چکیده | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مقدمه: اندو-بتا-1و4 گلوکاناز میکروبی از جمله آنزیمهای کلیدی در تجزیه گلوکان است. در میان باکتریها، گونههای مربوط به جنس باسیلوس یکی از منابع اصلی تولید کننده گلوکانازهای صنعتی هستند. هدف پژوهش حاضر، با توجه به تأثیر متقابل شاخصهای محیطی بر خواص کاتالیتیکی آنزیمها، بررسی توانایی تولید آنزیم بتاگلوکوناز توسط سویه بومی باسیلوس سابتیلیس B5d جدا شده از فیلوسفر باغات سیب و تعیین شرایط بهینه کاتالیتیکی آن است. مواد و روش ها: در بررسی حاضر، پتانسیل تولید آنزیم بتاگلوکاناز از جدایه باسیلوس B5d به روش کیفی تایید شد. جدایه یاد شده با روشهای بیوشیمیایی و مولکولی شناسایی شد. تعیین شرایط بهینه فعالیت آنزیم بتاگلوکوناز تولیدی توسط باسیلوس سابتیلیس B5d به روش سطح پاسخ و با استفاده از طرح مرکب مرکزی انجام شد. متغیرهای مورد بررسی شامل دما (20 تا80 درجه سانتیگراد) ٬ اسیدیته (5/3 تا 8) و غلظت سوبسترا (1/0 تا 1 درصد) بودند. نتایج: مطالعات بیوشیمیایی و مولکولی مبتنی بر ژن 16 S rDNA نشان داد که جدایه یاد شده به گونه باسیلوس سابتیلیس متعلق است. بر اساس نتایج به دست آمده از طرح مرکب مرکزی، مدل درجه دوم مناسبترین مدل برای پیشبینی فعالیت آنزیم بتاگلوکاناز در دامنه دمایی، اسیدیته و غلظت سوبسترای مورد بررسی تعیین شد. همچنین، نتایج بهینهسازی فعالیت آنزیم نشان داد که بتاگلوکوناز تولید شده توسط سویه B5d اپتیمم فعالیت کاتالیتیکی را در دامنه اسیدیته 5/5 تا 7و دمای 50 تا 65 درجه سانتیگراد و غلظت بالای سوبسترا داراست. اگرچه در دماهای 80 و 20 درجه سانتیگراد و همچنین، غلظتهای کم سوبسترا فعالیت آنزیم کاهش مییابد. نتایج تعیین صحت مدل حاصل از بهینهسازی به روش سطح پاسخ مطابقت خوبی را بین اعداد پیشبینی شده توسط مدل و دادههای واقعی نشان داد. بحث و نتیجه گیری: با توجه به ویژگیهای بهینه کاتالیتیکی، آنزیم بتاگلوکاناز تولید شده توسط باسیلوس سابتیلیس B5d قابلیت کاربرد در صنایع خوراک دام و طیور را داراست. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| کلیدواژهها | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| فعالیت بتاگلوکاناز؛ روش سطح پاسخ؛ باسیلوس سابتیلیس؛ خوراک دام و طیور | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| اصل مقاله | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
مقدمه. سلولز، همی سلولز و لیگنین بخشهای اصلی دیواره سلولی گیاهان بوده که به ترتیب 40، 33 و 23 درصد از وزن خشک گیاه را تشکیل میدهند. گلوکان یکی از اجزای اصلی سلولزها در دیواره سلولی گیاهان و دومین پلیساکارید به لحاظ فراوانی پس از سلولز است. از این رو میکروارگانیسمهای تجزیهکننده گلوکان در محیطهای طبیعی بسیار زیادی مانند خاک، کمپوست (کود)، روده حیوانات گیاهخوار، حشرات و بیمهرگان توزیع شده اند (1). گلوکان از هموپلیمرهای خطی حاوی مونومرهای دی- گلوکز با پیوندهای بتا 1و4 گلیکوزیدی تشکیل شده است. با این حال در طبیعت بیشتر حاوی زنجیرههای جانبی استیل، 4-O-متیل-دی گلوکورونوزیل و آرابینوفورانوزیل هستند که یک کمپلکس ناهمگن را تشکیل میدهند (2). هیدرولیز کامل گلوکان نیاز به عملکرد هماهنگ آنزیمهای گلوکونولیتیک متفاوت دارد که شامل اندوگلوکانازها، بتا-گلیکوزیداز و آنزیمهای کمکی مانند آلفا-آرابینوفورانوزیداز، استیل گلوکان استراز و آلفا-گلوکورونیداز است. در میان این آنزیمها اندو-بتا-1و4 گلوکاناز در کاتالیز و هیدرولیز زنجیرههای بلند گلوکان به گلوکوالیگوساکاریدهای کوتاه بسیار اهمیت دارند (3). اندو-بتا-1و4 گلوکاناز میکروبی از جمله آنزیمهای کلیدی پاسخگو برای تجزیه گلوکان است. گلوکز محصول اصلی تجزیه گلوکان است. بیشتر گلوکانازهای صنعتی توسط قارچهای آسپریژیلوس[1]، تریکودرما[2]، کاندیدا آلبیکنس[3] و باکتریهای مربوط به جنس باسیلوس تولید میشوند (4). مشتقات محلول سلولز مانند کربوکسیمتیل سلولز، هیدروکسیاتیلسلولز و یا سلولز تیمار شده با اسید فسفریک، سوبستراهای مناسبی برای آنزیم اندوبتا 1و 4گلوکاناز هستند. نقش اصلی آنزیم اندوگلوکاناز شکستن زنجیره سلولزی و تبدیل آن به قندهای کوچکتر همچون گلوکز و سلودکسترین است (5). گلوکانازها بر اساس شباهتهای توالی اسیدهای آمینه، ساختار، نوع فعالیت، ویژگیهای سوبسترا و ویژگیهای فیزیکی- شیمیایی به چند گروه تقسیم میشوند که گروههای 5، 16و 17 گلیکوزیدهیدرولازها از مهمترین آنها هستند که از نظر ساختار مولکولی، ویژگیهای کاتالیزوری و وزن مولکولی تمایز دارند (6). با توجه به جایگاه و اهمیت روز افزون بتاگلوکانازها در صنایع مختلف مانند رنگبری خمیرکاغذ، صنایع آبمیوه، خوراک دام و طیور و صنایع غذایی، بررسی پتانسیلهای ملی به منظور تولید این آنزیمها کاملاً ضروری به نظر میآید. شایان ذکر است که برای رفع هر کدام از نیازهای صنعتی خاص، آنزیم باید ویژگیهای خاصی مانند پایداری مناسب در برابر حرارت و اسیدیته، فعالیت اختصاصی بالا و مقاومت در برابر کاتیونهای فلزی و مواد شیمیایی را دارا باشند (7-8). به عنوان نمونه بتاگلوکانازهای ایده آل برای صنایع کاغذ، آنزیمهای فعال در دماهای بالا و اسیدیتههای قلیایی هستند (9). همچنین، فعالیت قابل توجه بتاگلوکاناز در غلظتهای پایین سوبسترا نیز از جمله خواص مهم در صنایع کاغذسازی و تولید بیواتانول است (10). جیره غذایی غنی شده با آنزیم بتاگلوکاناز از طریق افزایش قابلیت هضم فیبر، بهبود تغذیه دام و افزایش راندمان رشد و همچنین، افزایش تولید شیر در گاوهای شیری و دیگر نشخوار کنندگان را به همراه داشته است (11). به طور کلی اعتقاد بر این است که بتاگلوکاناز یکی از آنزیمهای مناسب برای تکمیل علوفه دام است و برای این منظور داشتن فعالیت بهینه در اسیدیته 6 از ویژگیهای مناسب برای کاربرد آنزیم بتاگلوکاناز به عنوان مکمل خوراک دام میباشد (10). مطالعات گستردهای در زمینه شناسایی و تعیین ویژگیهای کاتالیتیکی آنزیمهای بتاگلوکاناز تولید شده توسط سویههای مختلف باکتریایی با هدف یافتن آنزیمهای مناسب مورد استفاده در صنایع مرتبط همچنان در حال انجام است. برای مثال در بررسی ویژگیهای آنزیم بتاگلوکاناز تولید شده توسط باسیلوس سابتیلیس[4] A4، نشان داده شد که اسیدیته 5 تا 6 برای دستیابی به بیشنه فعالیت آنزیم مورد مطالعه لازم است. همچنین، بتاگلوکاناز تولید شده توسط سویه یاد شده در دمای 50 درجه سانتیگراد و اسیدیته 6 پایداری در خور توجهی داشته است. به همین علت آنزیم یاد شده به عنوان گزینه مناسبی برای کاربرد در صنعت خوراک دام معرفی شد (12). در مطالعه دیگری مشخص شد که آنزیم بتاگلوکاناز تولید شده توسط باسیلوس سابتیلیس LN در اسیدیته 6 و دمای 60 درجه سانتیگراد بیشترین فعالیت کاتالیتیکی داشته است (13). اپتیمم دما و اسیدیته فعالیت بتاگلوکاناز مقاوم به حرارت باسیلوس برویس[5] به ترتیب 65 تا 70 درجه سانتیگراد و 8 تا 10 گزارش و به عنوان گزینه مناسب برای استفاده در صنایع کاغذسازی معرفی شد (9). با توجه به تأثیر متقابل شاخصهای محیطی بر خواص کاتالیتیکی آنزیمها هدف این مطالعه بررسی توانایی تولید آنزیم بتاگلوکوناز توسط سویه بومی باسیلوس سابتیلیس B5d جدا شده از فیلوسفر باغات سیب، و تعیین شرایط بهینه کاتالیتیکی آن با مدلسازی تاثیرات دما، اسیدیته و غلظت سوبسترا بر فعالیت آنزیم به روش سطح پاسخ است تا ضمن تعیین شرایط بهینه عملکرد آنزیم بتاگلوکاناز تولید شده توسط سویه مورد مطالعه، آثار متقابل متغیرهای محیطی بر فعالیت کاتالیتیکی آن نیز مشخص شود. طراحی مناسب آزمایشها، مهمتر از تجزیه و تحلیل آماری مفصل است. در نظر گرفتن مجموعه متغیرهای مهم در طراحی آماری آزمایشها با استفاده از روش سطح پاسخ (RSM)[6]، که برای ارزیابی اهمیت نسبی متغیرها در حالت وجود برهمکنشهای پیچیده به کار میرود، شیوه مناسبی برای غلبه بر محدودیت بهینهسازی به روش یک عامل در هر زمان به شمار میآید.
مواد و روشها. میکروارگانیسم و شرایط نگهداری: جدایه باکتریایی باسیلوس سابتیلیس B5d از فیلوسفر باغات سیب استان کرمان جمع آوری و با استفاده از روش سری رقت و بر روی محیط کشت NBY[7] (نوترینت براث 8 گرم بر لیتر، دیپتاسیمهیدروژن فسفات 1 گرم بر لیتر، عصاره مخمر 1 گرم بر لیتر، پتاسیم دی هیدروژن فسفات 25/0 گرم بر لیتر، گلوکز 2 گرم بر لیتر، 12/0 گرم بر لیتر، آگار 18 گرم بر لیتر) جدا و خالصسازی شد. سپس، جدایه باکتریایی به منظور استفاده در بخشهای بعدی مطالعه در بانک ژن میکروبی پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی نگهداری شد به منظور فعالسازی سویه باکتریایی مورد نظر محیط کشت NBY تلقیح و به مدت 48 ساعت در دمای 28 درجه سانتیگراد گرمخانهگذاری شد (14). .ارزیابی کیفی و اندازهگیری فعالیت آنزیم بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d: برای تعیین توانایی تولید آنزیم بتاگلوکاناز از محیط کشت LB حاوی 02/0 درصد لچینن[8] (1,3:1,4-ß-D-Glucan) به عنوان سوبسترای آنزیم استفاده شد. شایان ذکر است که لچینن مورد استفاده (Megazyme, Lot N:70901c) از گلسنگ Cetraria islandica استخراج شده بود. باسیلوس سابتیلیس B5d به شکل نقطهای روی محیط کشت یاد شده تلقیح و به مدت 48 ساعت در دمای 28 درجه سانتیگراد گرمخانهگذاری شد (15). مشاهده هاله زرد رنگ در حضور معرف کنگو رد به منزله مثبت بودن این آزمون تلقی شد. پس از تایید تولید آنزیم توسط جدایه یاد شده اندازهگیری آنزیم تولیدی با استفاده از روش دی نیتروسالیسیلیک اسید انجام شد. بدین منظور ابتدا محلول لچینن 1 درصد در بافر مورد (فسفات یا سیترات) نظر تهیه و 100 میکرولیتر از آن به مدت 5 دقیقه در دمای مورد نظر قرار داده شد. برای تهیه اسیدیتههای مختلف نیز از بافرهای سیترات و فسفات با غلظت 2/0 مولار استفاده شد. سپس، 100 میکرولیتر محلول آنزیم به سوبسترا اضافه و به مدت 30 دقیقه در دمای مورد نظر قرار داده شد و در نهایت، 600 میکرولیتر از معرف دینیترو سالیسیلیک اسید به نمونهها اضافه و به مدت 10 دقیقه در حمام آب جوش قرار داده شد. در پایان و پس از رسیدن دمای نمونه به دمای محیط جذب نمونهها با استفاده از دستگاه میکروپلیت ریدر[9] در طول موج 540 نانومتر خوانده و با استفاده از منحنی استاندارد گلوکز غلظت قندهای آزاد شده محاسبه شد (16). استخراج DNA ژنومی: استخراج دی ان ا[10] ژنومی با استفاده از کیت DNeasy Blood &Tissue Kit[11] و با توجه به دستورالعمل مربوطه از باسیلوس B5d انجام شد. کیفیت و غلظت دی ان ا استخراج شده با استفاده از نانودراپ اسپکتوفتومتر[12] و در طول موج 260 نانومتر سنجش شد. .شناسایی بیوشیمیایی و مولکولی باسیلوس سابتیلیس B5d مبتنی بر 16S rDNA : با استفاده از آزمونهای ریختشناختی، بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی شناسایی مقدماتی باکتری باسیلوس سابتیلیس B5d انجام شد. به منظور شناسایی مولکولی و پس از استخراج دی ان ا، تکثیر ژن 16S rDNA با استفاده از پرایمر Paf و Par انجام شد. واکنش PCR در حجم 50، شامل 5 میکرولیتر بافر PCR (10x)، 3 میکرولیتر کلرید منیزیم 25 میلیمولار، 25/1 میکرولیتر DNTPs 10 میلیمولار، 5 میکرولیتر آغازگر پیش رو[13] 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 5 میکرولیتر آغازگر پس رو[14] 5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'، 5/0 میکرولیتر (حاوی 5/2 واحد) از آنزیم Taq DNA Polymerase، 1 میکرولیتر DNA الگو و 25/29 میکرولیتر آب مقطر تهیه شد. واکنش در دستگاه ترموسایکلر[15] با برنامه دمایی شامل 3 دقیقه واسرشته سازی اولیه در 94 درجه سانتیگراد و 35 چرخه به شکل 40 ثانیه در 94 درجه سانتیگراد، 40 ثانیه در54 درجه سانتیگراد، 1 دقیقه در72 درجه سانتیگراد و مرحله گسترش نهایی در 72 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه انجام شد. محصول PCR با استفاده از کیت PCR purification kit; Roch بازیافت و پس از تعیین توالی و انجام تحلیلهای [16]BLAST در پایگاه اطلاعاتی NCBI ثبت شد. تولید آنزیم بتاگلوکاناز: ابتدا سویه باسیلوس سابتیلیس B5d در محیط کشت NBY به شکل خطی تلقیح و در دمای 28 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت گرمخانهگذاری شد. سپس، یک لوپ از باکتری رشد کرده برای تهیه مایه تلقیح از محیط کشت جامد به محیط کشت نوترینت براث منتقل و به مدت 18 ساعت در انکوباتور شیکردار با دمای 28 درجه سانتیگراد و سرعت 180 دور بر دقیقه قرار داده شد. سپس، 2 درصد مایه تلقیح آماده شده به محیط کشت تولید آنزیم (10 گرم بر لیتر بتاگلوکان[17]، 3 گرم بر لیتر عصاره گوشت، 4 گرم بر لیترعصاره مخمر، 5/0 گرم بر لیتر کلرید کلسیم، 3/0گرم بر لیتر سولفات منیزیم و 1 گرم بر لیتر دی پتاسیم هیدروژن فسفات) افزوده و به مدت 48 ساعت در انکوباتور شیکردار با دمای 28 درجه سانتیگراد و سرعت 180 دور بر دقیقه گرمخانهگذاری شد (17). به منظور جداسازی آنزیم، محیط کشت تخمیر شده به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد و با سرعت 10000 دور بر دقیقه سانتریفوژ[18] و فاز روماند به عنوان منبع آنزیم خام تا زمان انجام آزمونهای مربوطه در دمای منفی 20 درجه سانتیگراد نگهداری شد. .تعیین شرایط بهینه عملکرد بتاگلوکاناز تولیدی باسیلوس سابتیلیس B5d: به منظور تعیین شرایط بهینه کاتالیتیکی آنزیم تولید شده، تاثیر سه متغییر دما، اسیدیته و غلظت سوبسترا به ترتیب در دامنههای (20 تا 80 درجه سانتیگراد)، (اسیدیته 5/3 تا 8) و غلظت 1/0 تا 1 درصد لچینن بر فعالیت بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d به روش سطح پاسخ و در پنج سطح (-α, -1, 0, +1, +α) بررسی شد (جدول 1). طرح آزمایشی مرکب مرکزی سه متغیره برای بهینهسازی شاخصهای اسیدیته، دما و غلظت سوبسترا متشکل از 20 آزمایش، شامل 6 تکرار نقطه مرکزی برای تعیین خطای آزمایشی به کار گرفته شد (جدول 2). پاسخهای به دست آمده با استفاده از نرم افزار دیزاین اکسپرت 7 [19] (به روش تحلیل واریانس تجزیه و تحلیل شد. بر اساس نتایج تحلیل آماری مدل درجه دوم مناسبترین مدل برای پیشبینی فعالیت آنزیم مورد بررسی در دامنه دمایی، اسیدیته و غلظت سوبسترای مورد بررسی تعیین شد.
نتایج. .ارزیابی کیفی توانایی تولید آنزیم بتاگلوکوناز توسط باسیلوس سابتیلیس B5d: هاله شفاف تولید شده بر محیط کشت غربالگری پس از افزودن معرف کنگو رد به قطر 5 سانتیمتر معرف توانایی تولید آنزیم بتاگلوکاناز توسط باسیلوس سابتیلیس B5d به روش کیفی بود (شکل 1).
شکل1- نتیجه آزمون کیفی تعیین توانایی تولید آنزیم بتاگلوکاناز توسط باسیلوس سابتیلیس B5d که به صورت هاله شفاف پس از افزودن معرف کنگو رد مشاهده میشود
جدول 1- دامنه و سطوح متغیرهای آزمایشی در طرح مرکب مرکزی
*Alpha=1.68
جدول 2- طرح مرکب مرکزی بر اساس مقادیر واقعی به همراه پاسخ تجربی
شناسایی بیوشیمیایی و مولکولی باسیلوس سابتیلیس B5d مبتنی بر 16S rDNA : بررسی ویژگیهای ریختشناسی نشان داد که جدایه یاد شده گرم مثبت، میلهای شکل، دارای اندوسپور با موقعیت مرکزی و هوازی اجباری است. همچنین، تکثیر ژن 16SrDNA، تعیین توالی و مقایسه با توالیهای موجود در پایگاه NCBI متعلق بودن جدایه مورد بررسی به گونه باسیلوس سابتیلیس را مشخص و با کد شناساییKF856736 در بانک ژن پایگاه اطلاعاتی NCBI ثبت شد.
.تعیین ویژگیهای کاتالیتیکی بهینه بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d به روش سطح پاسخ: به منظور تعیین شرایط بهینه کاتالیتیکی آنزیم بتاگلوکاناز تولید شده توسط باسیلوس سابتیلیس B5d، از روش سطح پاسخ سه متغییره شامل اسیدیته، دما و غلظت سوبسترای لچینن استفاده شد. بر اساس نتایج به دست آمده از طرح مرکب مرکزی مدل درجه دوم مناسبترین مدل برای پیشبینی فعالیت آنزیم بتاگلوکاناز تولید شده توسط باسیلوس سابتیلیس B5d در دامنه دمایی، اسیدیته و غلظت سوبسترای تعریف شده بود. بر اساس نتایج تحلیل واریانس مدل ذیل متغیر پاسخ را به شکل قابل قبولی پیشبینی میکند: (معادله 1) که در آن X1 و X2 و X3 به ترتیب نمایانگر متغیرهای مستقل اسیدیته و دما وغلظت سوبسترا و Y نشان دهنده متغیر پاسخ است. نتایج تجزیه و تحلیل واریانس نشان میدهد که مدل برازش داده شده در سطح 99 درصد معنادار است (P value<0.0001). همانگونه که در معادله 1 قابل مشاهده است اثر خطی هر سه متغیر مورد بررسی بر فعالیت آنزیم مثبت بوده است. اگرچه ضرایب بزرگتر متغیرهای اسیدیته و غلظت سوبسترا نسبت به متغیر دما حاکی از نقش بیشتر این دو متغیر در تنظیم فعالیت بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d است. نتایج تحلیل واریانس نیز گویای معنادار نبودن اثر خطی دما بر مقدار پاسخ است (جدول 3).
(معادله 1) Y= -5062.95676+1347.29473X1+70.44105X2+1483.48085X3+3.69588X1X2+169.26472X2X3+6.13058X1X3-136.02952X12-0.97183X22-1420.56035X32
جدول 3- تجزیه و تحلیل واریانس (ANOVA) سطح پاسخ مدل درجه دوم برای فعالیت آنزیم بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d
با وجود مثبت بودن ضریب اثر متقابل دو متغیر دما و اسیدیته (معادله 1)، افزایش همزمان این دو متغیر تأثیر معناداری بر فعالیت آنزیم بتاگلوکاناز مورد بررسی نداشته است (P value>0.05). بر اساس نمودار سه بعدی اثر متقابل دو متغیر دما و اسیدیته، حداقل فعالیت آنزیمی در دماهای 80 و 20 درجه سانتیگراد و کمترین اسیدیته مورد بررسی در این مطالعه ثبت شده است. در حالی که در دامنه دمایی 36 تا 65 درجه سانتیگراد و اسیدیتههای 8/4 تا4/7 افزایش فعالیت آنزیمی مشاهده شد. جمله درجه دوم دو متغیر دما و اسیدیته منفی و بیانگر آن است که افزایش بیش از حد هر کدام از این دو متغیر سبب کاهش فعالیت آنزیمی میشود (شکل 2). بر اساس نتایج تحلیل واریانس اثر خطی متغیر غلظت سوبسترا مثبت و معنادار بود (P value<0.05). اگرچه بر اساس مدل پیشنهادی (معادله 1) ضریب اثر متقابل دو متغیر غلظت سوبسترا و اسیدیته بر فعالیت آنزیم بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d نیز مثبت بود ولی تأثیر معناداری بر تغییرات پاسخ نشان نداد
شکل 2- نمودار سه بعدی اثر متقابل دما و اسیدیته بر فعالیت بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d در نقطه مرکزی غلظت سوبسترا
شکل 3- نمودار سه بعدی اثر متقابل اسیدیته و غلظت سوبسترا بر فعالیت بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5dدر نقطه مرکزی دما
همانگونه که در شکل 4 مشاهده میشود افزایش همزمان دما و غلظت سوبسترا نیز در دامنه مورد ارزیابی به افزایش فعالیت بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d منجر شد اگرچه افزایش یاد شده از نظر آماری معنادار نبود (P value>0.05). کمترین فعالیت آنزیمی نیز در دماهای 20 و 80 درجه سانتیگراد و کمترین غلظت لچینن مشاهده شد. در حالی که بیشینه فعالیت آنزیمی در دامنه دمایی 37 تا 65 درجه سانتیگراد و غلظتهای 4/0 تا 1 درصد سوبسترا ثبت شد.
شکل 4- نمودار سه بعدی اثر متقابل دما و غلظت سوبسترا بر فعالیت بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d در نقطه مرکزی اسیدیته
از آنجا که دما، اسیدیته وغلظت سوبسترا از عوامل تأثیرگذار بر فعالیت آنزیمی بهشمار میآیند و با در نظر گرفتن این موضوع که شرایط خاصی از عوامل یاد شده مطلوب کاربردهای مختلف آنزیم بتاگلوکاناز در صنایع است، بر همین اساس جدول 4 چند نمونه از شرایط بهینه عملکرد آنزیم بتاگلوکاناز تولید شده توسط باسیلوس سابتیلیس B5d را در شرایط خاصی از متغیرهای مورد بررسی نشان میدهد. بیشینه فعالیت آنزیمی بر اساس مدل پیشبینی شده توسط نرمافزار (U/L 1723) در دمای 33/51 درجه سانتیگراد، اسیدیته 27/6 و غلظت 1 درصد لچینن حاصل میشود. بهینهسازی فعالیت آنزیم مورد بررسی در بیشینه دما هدف بعدی بود که بر این اساس مدل دمای 07/65 درجه سانتیگراد، اسیدیته 46/6 و غلظت سوبسترای 1 درصد را به عنوان شرایط بهینه برای دستیابی به حداکثر فعالیت آنزیم بتاگلوکاناز (U/L 1544) پیشبینی کرد. بر اساس نتایج حاصل از بهینهسازی فعالیت کاتالیتیکی در شرایط مختلف محیطی، آنزیم بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d قابلیت کاربرد در خوراک دام و طیور به عنوان افزودنی دارد.
جدول 4- فعالیت آنزیم بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d در شرایط مختلف محیطی بر اساس مدل پیشبینی شده
نمودار تطابق (شکل 5) همبستگی قابل قبولی میان مقادیر واقعی و پیشبینی شده فعالیت بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d را نشان میدهد. تجمع نقاط پیرامون خط شیبدار، نمایانگر اختلاف قابل قبول میان مقادیر تجربی و پیشبینی شده در دامنه عملیاتی متغیرهاست. برای بررسی بسندگی مدلها نیز، نمودار توزیع باقیمانده پاسخهای پیشبینی شده رسم شده است (شکل6 ). با توجه به توزیع باقیماندهها در دو سوی محور عرضی میتوان اظهار داشت که مدل برازش شده، فعالیت آنزیم بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d را با استفاده از پاسخ سطح به طور مناسبی توصیف میکند. به منظور تعیین صحت مدلهای حاصل از بهینهسازی به روش سطح پاسخ، فعالیت آنزیم بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d در دماهای (50، 60 و70 درجه سانتیگراد)، اسیدیته (5/4، 5/5 و 6) و غلظت سوبسترای (6/0، 7/0 و 8/0 درصد) ارزیابی شد. نتایج مطابقت خوبی را بین اعداد پیشبینی شده توسط مدل و دادههای واقعی نشان داد که این موضوع درستی مدل به دست آمده را تایید میکند (جدول 5).
شکل 5- نمودار قیاس همبستگی دادههای تجربی و پیشبینی شده فعالیت آنزیم بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d
شکل 6-نمودار توزیع باقیمانده مقادیر پیشبینی شده مدل
جدول 5- تعیین صحت مدل درجه دوم پیشبینی فعالیت کاتالیتیکی آنزیم بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d در شرایط ارزیابی شده
بحث و نتیجه گیری. در پژوهش حاضر، تعیین ویژگیهای بهینه فعالیت آنزیم بتاگلوکاناز سویه باسیلوس سابتیلیس B5d به روش سطح پاسخ انجام و بهترین شرایط فعالیت آنزیم منتخب مشخص شد. منظور از بهینهسازی به روش سطح پاسخ، یافتن نقاط مطلوب در فضای طراحی است. در مطالعهای، پژوهشگران پس از بررسی ویژگیهای آنزیم اندو بتا 1و 3-1 و4 گلوکاناز باسیلوس سابتیلیس 168، اپتیمم دمای 40 تا 60 درجه سانتیگراد و اسیدیته 5 تا 7 را به عنوان شرایط بهینه عملکرد آنزیم مورد مطالعه گزارش کردند. بیشینه فعالیت بتاگلوکانازی آنزیم یاد شده در دمای 50 درجه سانتیگراد و اسیدیته 6 ثبت شد (2). در پژوهش دیگری به منظور بررسی ویژگیهای عملکردی آنزیم بتاگلوکاناز تولید شده توسط باسیلوس لچنیفورمیس[xx] EGW039 بررسی ویژگیهای بهینه فعالیت کاتالیتیکی آنزیمها در تعیین حوزه مناسب کاربرد صنعتی آنها اهمیت ویژهای دارد (20). با توجه به دامنه دمایی و اسیدیته بهینه، آنزیم مورد بررسی قابلیت استفاده در صنعت خوراک دام و طیور را دارد. اگرچه بهینهسازی محیط و شرایط کشت به منظور افزایش بهرهوری و کاهش هزینه تولید ضروری به نظر میآید. [1]- Aspergillus [2]- Trichoderma [3]- Candida albicas [4]- Bacillus subtilis [5]- Bacillus brevis [6]- Response Surface Methodology [7]- Nutrient Broth Yeast Extract [8]- Lichenan [9]- Tecan, pro M200, Switzerland [10]- DNA [11]- QIAGEN. Cat. No. 69504 [12]- Spectrophotometr (Thermo Scientific 2000C) [13]- Forward [14]- Revese [15]- Bio-Rad, Canada [16]- Basic Local Alignment Search Tool [17]- Brewer spent grain [18]- Tommy, Japan [19]- Stat-Ease Inc. Minneapolis, MN, USA ( Design Expert 7.0.0) [xx]- Bacillus licheniformis | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مراجع | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
(1) Klemm D., Heublein B., Fink H P., Bohn A. Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material. Angewandte. Chemie International Edition. 2005; 44 (22): 3358- 93. (2) FurtadoG P., RibeiroL F., SantosC R., TonoliC C., de SouzaA R., OliveiraR R., et al. Biochemical and structural characterization of a β-1,3-1,4-glucanase from Bacillus subtilis 168. Process Biochemistry 2011; 46 (5): 1202- 06. (3) Aggarwal R., Purwar S., Kharbikar L., Gupta S.Induction of a wheat β-1,3-Glucanase gene during the defense response to Bipolaris sorokiniana. Acta Phytopathologica Entomologica Hungarica. 2011; 46 (1): 39- 47. (4) Vuong T V., Wilson D B.Glycoside hydrolases: Catalytic base/ nuclephile diversity. Biotechnology & Bioengineering 2010; 107 (2): 195- 205. (5) Xia L., Shen X.Production and immobilization of cellobiase from Aspergillus niger ZU-07. Process Biochemistry 2004; 39 (11): 1363- 7. (6) Song J.,Nam K., Sun Y U.,Kang M., Kim C H., Kwon S K.,et al.Molecular andbiochemical characterization of a novel arthropod endo-β-1,3-glucanase from the Antarctic springtail, Cryptopygus antarcticus horizontally acquired from bacteria. Comparative Biochemistry & Physiology.Part B 2010; 155 (4): 403- 12. (7) Beshay U., Enshasy H E., Ismail I., Moawad H., Wojciechowska E., Ghany S A.β-glucanase production from genetically modified recombinant Esherichia coli: Effect of growth substrates and development of a culture Murmedium in shake flasks and stirred tank bioreactor. Process Biochemistry 2003; 39 (3): 307- 13. (8) Rajoka M I.Influence of various fermentation variables on exo-glucanase production in Cellulomonas flavigena.Electronic Journal of Biotechnology 2004; 7 (3): 256- 63. (9) Louw M E., Reid S H., Watson T J.Characterization, cloning and sequencing of a thermostable endo- (1,3-1,4)β- glucanase- encoding gene from an alkalophilic Bacillusbrevis. Applied Microbiology & Biotechnology 1993; 38 (4): 507- 13. (10) Kuhad R C., Gupta R., Singh A.Microbial Cellulases and Their Industrial Applications. Enzyme Research 2011; 1- 10. (11) Bedford M R., Partidge G G., Enzyme in Farm Animal Nutrition, 2nd edition Marlborough: CABI Publishing; 2001. (12) IbrahimA M., Abdel-Aziz A A., Mahrous H.,Abdulraouf U M.Cloning and sequencing of cellulose- encoding gene (cel2)fromlocally isolated Bacillus sp.strain A4.Journal of Biotechnology.2009; 6 (1-2): 75- 88. (13) Aftab S., Aftab M N., Haq I., Javad M M., Zafar A.,Iqbal I.Cloning and expression of endo-1,4-B-Glucanase gene from Bacilluslicheniformis ATCC14580 into Escherichiacoli BL21 (DE3). African Journal of Biotechnoogyl 2012; 11 (12): 2846- 54. (14) Lindemann J., Arny DC., Upper CD.Epiphytic populations of Pseudomonas syringae pv.Syringae on snap bean and non host plants and the incidence of bacterial brown spot disease in relation to cropping patterns. Phytopathology 1998. 74 (11): 1329- 33.(15) Walter J., Mangold M.,Tannock G W.Construction, Analysis, and Glucanase Screening of a Bacterial Artificial Chromosome Library from the Large-Bowel Microbiota of Mice. Applied Environmental Microbiology 2005; 71 (5): 2347- 54. (16) Bailey M., Biely P., Poutanen K.Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity. Journal of Biotechnology 1992; 23 (3): 257- 70. (17) Hashemi M., Shojaosadati SA., Razavi SH., Mousavi SM.The potential of brewer’s spent grain to improve the production of α-amylase by Bacillus sp.KR-8104 in submerged fermentation system. New Biotechnology 2011; 28 (2): 165- 72. (18) Teng D., WangJ., Fan Y., Yang Y., TianZ., Luo J., et al.Cloning of β-1,3-1,4-glucanase gene from Bacillus licheniformis EGW039 (CGMCC 0635)and its expression in Escherichia coli BL21 (DE3). Applied Microbiology & Biotechnology 2006; 72 (4): 705- 712. (19) Apiraksakorn J., Buwjoom T., Nitisinprasert S.Characterization of Grass Degrading Bacteria Active on β-1,3-1,4-D-glucans from Bacillus subtilis GN156 PotentialUse for Grass Silage-Making.Kasetsart Journal (Nat.Sci.) 2006; 40 (1): 136- 47. (20) Naghavi N S., Naderi S, Shahanipoor K, Zia M A., Rastegari Esfahani A A. Optimization of exopectinase activity of the fungus Monilia isolated from tangerine in submerged fermentation. Biological Journal of Microorganisms 2012; 1 (1): 23- 30.
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
آمار تعداد مشاهده مقاله: 1,647 تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 767 |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||