
تعداد نشریات | 43 |
تعداد شمارهها | 1,685 |
تعداد مقالات | 13,846 |
تعداد مشاهده مقاله | 32,782,260 |
تعداد دریافت فایل اصل مقاله | 12,963,417 |
استفاده از مایع تخمیر UTMC 5040 Aspergillus westerdijkiae در کنترل زیستی علف هرز جودره (Hordeum spontanum) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
زیست شناسی میکروبی | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
مقاله 3، دوره 4، شماره 15، آذر 1394، صفحه 9-20 اصل مقاله (633.13 K) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
نوع مقاله: پژوهشی- فارسی | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
نویسندگان | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
جواد حامدی* 1؛ حمید چراغیان رادی2؛ حمید مقیمی3 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1دانشیار میکروبیولوژی، مرکز پژوهشی فنآوری و فرآورده های میکروبی، دانشگاه تهران، ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2کارشناس ارشد میکروبیولوژی، مرکز پژوهشی فن آوری و فرآورده های میکروبی، دانشگاه تهران، ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3استادیار میکروبیولوژی، مرکز پژوهشی فن آوری و فرآورده های میکروبی، دانشگاه تهران، ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
چکیده | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
مقدمه: علف هرز جودره (Hordeum spontanum) از مهمترین علفهای هرز مزارع غلات به ویژه گندم است. هدف از انجام پژوهش حاضر، معرفی قارچهای بیماریزای گیاهی جدا شده از خاکهای مناطق مختلف ایران برای کنترل زیستی این علف هرز است. مواد و روشها: ابتدا 150 نمونه قارچ جدا شده از نقاط مختلف ایران طی دو مرحله متوالی با غربالگری اولیه و ثانویه روی برگ آفتابگردان و جودره قرار گرفتند. به این منظور، 200 میکرولیتر از مایع تخمیر هر کدام از قارچهای کشت داده شده در محیط PDB روی برگ گیاهان یاد شده اسپری شد. در ادامه، توانایی جدایههای منتخب برای ایجاد نکروز در علف هرز جودره رشد داده شده در گلدان و نیز توانایی آنها در مهار جوانهزنی و ریشهزایی علف هرز و همچنین، طیف میزبانی جدایههای منتخب بررسی شد. نتایج: پس از انجام غربالگری اولیه و ثانویه مشخص شد که جدایه Aspergillus westerdijkiae UTMC 5040 بیشترین توانایی را در ایجاد نکروز در علف هرز جودره دارد. پس از اسپری 5/1 میلیلیتر از مایع تخمیر سانتریفوژ شده این جدایه قارچی بر برگهای بالغ علف هرز جودره کشت داده شده در گلدان، و پس از گذشت 3 هفته نکروز شدیدی در گیاه مشاهده شد. بررسی توانایی جدایه منتخب برای مهار جوانهزدن و ریشهزایی علف هرز، نشان داد که پس از گذشت 10 روز قوه نامیه جودره به میزان 75 درصد و قدرت ریشهزایی به طور میانگین از 60 میلیمتر به 35 میلیمتر کاهش یافت. بررسی طیف میزبانی جدایه مورد نظر نشان داد که از بین 25 گیاه مختلف، این جدایه توانایی ایجاد علایم بیماری را در سه گیاه هرز جودره، گارس و پیچک صحرایی دارد. بحث و نتیجهگیری: پژوهش حاضر، نخستین گزارش از کنترل زیستی علف هرز جودره توسط مایع تخمیر UTMC5040 A. westerdijkiae است و نتایج به دست آمده میتواند در یافتن علفکشهای زیستی جدید استفاده شود. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
کلیدواژهها | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
علف هرز جودره؛ قارچهای بیماریزای گیاهی؛ کنترل زیستی؛ UTMC5040 Aspergillus westerdijkiae | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
اصل مقاله | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
مقدمه. هر ساله علفهای هرز به کاهش بیش از 7/9 درصد بازده محصولات کشاورزی در سرتاسر جهان منجر میشوند (1). کنترل علفهای هرز بخش قابل توجهی از فعالیتهای لازم برای تولید محصولات کشاورزی را به خود اختصاص داده است. علفهای هرز بازده محصولات کشاورزی را در اثر رقابت با گیاه اصلی برای آب، مواد غذایی و نور خورشید کاهش میدهند (2). همچنین، میتوانند به طور مستقیم عملیات جمعآوری محصول را با تأخیر مواجه کرده، کیفیت محصول را کاهش داده و مواد شیمیایی زیانبار تولید کنند.در ایالات متحده امریکا با وجود کوشش زیاد برای مقابله با علفهای هرز، خسارت سالانه ناشی از این عوامل مزاحم بیش از 8 میلیارد دلار تخمین زده شده است (3). علف هرز جودره با نام علمی برای کنترل علفهای هرز از روشهای مکانیکی، شیمیایی و زیستی استفاده میشود (7). امروزه استفاده از علفکشهای شیمیایی به عنوان روش اصلی برای مقابله با علفهای هرز در نظر گرفته میشود، اما آثار مضر این علفکشها بر سلامت انسان و حیوانات، ایجاد آلودگیهای زیست محیطی از قبیل آلودگی خاک، آبهای زیرزمینی و مواد غذایی، از بین بردن ارگانیسمهای غیرهدف و افزایش مقاومت علفهای هرز در برابر علفکشهای شیمیایی، توجه دانشمندان را به استفاده از روشهای جایگزین جلب کرده است (8 و 10). هم اکنون علفکشهای زیستی به عنوان مهمترین روش جایگزین برای علفکشهای شیمیایی در نظر گرفته میشوند. از جمله ویژگیهای مثبت این نوع از علفکشها میتوان به اختصاصی بودن نسبت به علف هرز هدف، ایمن بودن برای محیط زیست و کاهش توسعه مقاومت در بین علفهای هرز اشاره کرد (11). در روش کنترل زیستی علفهای هرز از نماتودها، حشرات، باکتریها و قارچها برای مهار رشد یا از بین بردن این عوامل مزاحم استفاده میشود. در این میان استفاده از قارچها به عنوان مهمترین عوامل بیماریزا در گیاهان، بیشترین توجه و موفقیت را در برداشته است (12). در روش کنترل زیستی علفهای هرز به وسیله قارچها یا از اسپورهای قارچی مثل اسپورهای Colletotrichumgloeosporioides و Alternariacassiو یا از فیتوتوکسینهای تولید شده توسط آنها استفاده میشود (13). در سال 1984 بیویک[1] و همکارانش گونه Alternariadestruensرا از گیاه بیمار Cuscutagronovii جداسازی کردند (14). در مطالعات بعدی، مشخص شد که این قارچ بیماریزا به میزان 92 درصد به کنترل علف هرز Cuscutagronoviiقادر است (15). با توجه به توانمندیهای زیاد قارچها در این زمینه و اهمیت کنترل زیستی جودره در کشت غلات و به ویژه گندم، در پژوهش حاضر، برای نخستین بار توانمندی قارچهای بیماریزای گیاهی در ایران به منظور معرفی یک عامل زیستی توانمند در کنترل زیستی گیاه هرز جودرهبررسی شد. مواد و روشها. کشت و خالصسازی جدایههای قارچی: در پژوهش حاضر، 150 جدایه قارچی از ریزوسفر و فیلوسفر گیاهان آلوده جمع آوری شده از سراسر کشور به دست آمد. به منظور کشت و جداسازی و همچنین خالصسازی جدایههای قارچی از محیط سیب زمینی دکستروز آگار [2] استفاده شد. پلیتهای کشت داده شده به مدت 7 تا 14 روز در دمای 28 سانتیگراد گرماگذاری شد. جدایهها پس از کشت مجدد رویPDA داخل ارلن مایرهای حاوی 50 میلیلیتر از محیط کشت مایع سیب زمینی دکستروز براث [3] تلقیح شده و به مدت 6 روز در دمای 28 درجه سانتیگراد روی شیکر با 180 دور در دقیقه گرمخانه گذاری شد. مایع تخمیر حاصل از رشد قارچی 15 دقیقه در 4000 دور در دقیقه سانتریفوژ شد. مایع رویی حاصل در مراحل بعدی برای سنجش روی گیاه استفاده شد (9). آمادهسازی گیاهان: بذر گیاهان مورد استفاده در پژوهش حاضر، از موسسه علفهای هرز ایران تهیه شد. فهرست این گیاهان در جدول 1 آورده شده است. به منظور استریل کردن بذرها قبل از کشت، در ابتدا هر بذر در محلول هیپوکلریت سدیم 1 درصد شستشو و به دنبال آن با آب مقطر دو مرحله شستشو انجام شد (16). بذرهای سترون شده به منظور جوانه زدن اولیه در محیط آب آگار کشت و به مدت 3 روز در تاریکی و در دمای 28 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. بذرهای جوانه زده و بدون آلودگی به داخل محیط کشت MS آگار [4] انتقال یافتند و در دمای 28 درجه سانتیگراد در زیر روشنایی مستقیم قرار داده شدند. گیاهان بالغ 4 هفتهای برای انجام سنجش زیستی آثار عصارههای قارچی استفاده شدند. به منظور رشد گیاهان مورد نظر در گلدان، خاک باغچه غنی شده با کود برگ که توسط اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه استریل شده بود، به گلدانهای پلاستیکی 15سانتیمتر مکعب انتقال داده شد. سپس، در هر گلدان 4 عدد بذر علف هرز قرار گرفت. آبیاری به شکل روزانه انجام گرفت و در نهایت، گلدانها در دمای 28 درجه سانتیگراد به مدت 4 تا 6 هفته قرار داده شدند. سنجش زیستی فعالیت جدایههای قارچی در پلیت: در مرحله غربالگری اولیه، 200 میکرولیتر از مایع تخمیر به دست آمده از 150 جدایه خالص شده روی برگ، ساقه و ریشه گیاه آفتابگردان در محیط MS قرار داده شد و گیاه مورد نظر به مدت 10 روز بررسی شد. طی این مرحله از گیاه آفتابگردان تیمار شده با محیط کشت به تنهایی به عنوان نمونه شاهد منفی استفاده شد. در ادامه ارزیابی بیماریزایی قارچهای منتخب از مرحله اول بر روی علف هرز جودره به ترتیبی که در بالا برای آفتابگردان یاد شد، انجام شد. طی انجام این مرحله از گیاه گندم اسپری شده با محیط کشت تلقیح نشده به عنوان نمونه شاهد استفاده شد. هر عصاره به دست آمده روی سه گیاه مستقل و در دو آزمایش به شکل جداگانه تکرار شد (17). سنجش فعالیت زیستی جدایه منتخب در گلدان: در این مرحله تاثیر مایع تخمیر جدایه منتخب در مهار رشد و ایجاد نکروز روی گیاهان بالغ جودره بررسی شد. برای این منظور 5/1 میلیلیتر از مایع تخمیر سانتریفوژ شده جدایه منتخب روی برگهای گیاهان بالغ 4 هفتهای اسپری شد. در طول مدت انکوباسیون 12روزه، تیمار مایع تخمیر قارچ منتخب روی برگها 3 بار و هر 4 روز یکبار انجام شد. در این آزمایشاز گندم و محیط کشت تلقیح نشده به عنوان نمونه شاهد منفی استفاده شد. تغییرات گیاهان شاهد و گیاه مورد آزمایش، روزانه عکسبرداری شد. به منظور تکرار آزمایش،عصاره قارچ منتخب روی سه گلدان مستقل و در دو آزمایش، جداگانه آلودهسازی شد (17). سنجش میزان مهار قدرت جوانهزنی بذر گیاه هرز: به منظور بررسی مهار قدرت جوانهزنی بذر علف هرز توسط جدایه منتخب، 50 عدد از بذر جودره در پلیتهای حاوی آب آگار قرار داده شد و سپس، 3 میلیلیتر از مایع تخمیر سانتریفوژ شده روی سطح بذرها ریخته شد. در نهایت، پلیتها در دمای 28 درجه سانتیگراد در تاریکی نگهداری شدند. از پلیتهای حاوی بذر که تنها با محیط کشت تلقیح نشده تیمار شده بودند، به عنوان شاهد استفاده شد. قوه نامیه بذرها پس از گذشت 10 روز بررسی شد (9). این آزمایش برای علف هرز مورد آزمایش 3 بار و هر بار با 3 تکرار 50 تایی از بذرها تکرار و میانگین نتایج حاصل با نمونه شاهد مقایسه شد. سنجش میزان مهار ریشهزایی بذر گیاه هرز: به منظور بررسی توانایی جدایه منتخب در جلوگیری از ریشهزایی علف هرز جودره، 50 عدد از بذرهای جوانه زده این گیاه با 3 میلیلیتر از مایع تخمیر سانتریفوژ شده قارچی تیمار شدند. سپس، بذرها در تاریکی و در دمای 28 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. پس از گذشت 10روز نتایج ثبت شد. این آزمایش برای علف هرز مورد آزمایش 3 بار و هر بار با سه تکرار 50 تایی از بذرها تکرار و میانگین نتایج حاصل با نمونه شاهد مقایسه شد. بررسی طیف میزبانی جدایه منتخب: به منظور بررسی طیف اثر جدایه منتخب، بیماریزایی آن برای 25 گونه گیاهی متعلق به 9 خانواده مختلف بررسی شد (18). در این مرحله 1 میلیلیتر از مایع تخمیر سانتریفوژ شده از جدایه منتخب در محیط PDB روی برگهای گیاهان مورد نظر تیمار شد. در ادامه، گیاهان تیمار شده در دمای 28 درجه سانتیگراد به مدت 10 روز نگهداری شدند. از گیاهان تیمار شده با آب مقطر به عنوان نمونههای شاهد منفی استفاده شد. گیاهان بر اساس میزان آسیب وارد شده به سه دسته ایمن (بدون نکروز قابل مشاهده)، مقاوم (با لکه نکروزی دارای قطر کمتر از1 میلیمتر) و یا حساس (دارای لکه نکروزی بزرگتر از 2 میلیمتر) تقسیم بندی شدند(18). این آزمایش برای هر کدام از 25 گونه گیاهی، جداگانه و به شکل 3 تکرار انجام شد. .شناسایی ریختشناسی و مولکولی جدایه منتخب: شناسایی ریختشناسی جدایه منتخب از طریق تهیه کشت روی لام و رنگ آمیزی با لاکتوفنول کاتن بلو و مشاهده میکروسکوپی و سپس، روش مولکولی انجام شد. برای این منظور جدایه منتخب در محیطPDB به مدت 48 ساعت در دمای 28 درجه سانتیگراد گرماگذاری شد. میسلیومهای قارچ با سانتریفیوژ از محیط کشت جدا و پس از شستشو با سرم فیزیولوژی در هاون ریخته و به شکل فیزیکی با روش کوبیدن زیست توده منجمد شده با ازت مایع سلولها شکسته شده و DNA آن با روش استخراج با روش فنل- کلروفرم جداسازی شد (19). PCR با پرایمرهای ITS1 و ITS4 (ITS1: 5´TCC GTA GGT GAA CCT GCG G´3وITS4:5´TCCTCCGCT TAT TGA TAT GC´3) انجام شد (20). ویال PCR حاوی 25 میکرولیتر از اجزای واکنش، شامل 5/3 میکرولیتر آب مقطر استریل، 1 میکرولیتر از هر کدام از پرایمرهای رفت و برگشت، 2 میکرولیتر DNA نمونه با غلظت 30 نانوگرم در میکرولیتر، 5 میکرولیتر بافر PCR و 5/12 میکرولیتر آنزیم TaqDNApolymerasemastermix، شرکت آمپلیکون [5] بود. تکثیر قطعه مورد نظر در شرایط زیر انجام شد: 5 دقیقه واسرشتی ابتدایی در 96 درجه سانتیگراد، 30 چرخه PCR شامل واسرشتی اولیه 45 ثانیهای در دمای 96 درجه سانتیگراد، 30 ثانیه در دمای 50 درجه سانتیگراد برای اتصال پرایمر و پلیمریزاسیون برای 5/1 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد. پلیمریزاسیون نهایی در 72 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه انجام شد. محصول به دست آمده پس از خالصسازی از روی ژل، برای تعیین توالی استفاده شد. به منظور توالییابی، باند مورد نظر از ژل با کمک کیت استخراج از ژل ساخت شرکت ژن آل-کره جنوبی [6] استخراج و به شرکت ماکروژن-کره جنوبی ارسال شد. تعیین ترادف بر اساس روش تغییر یافته سنگر انجام شد و نتایج تعیین ترادف در بانک ژن و از طریق همردیفی توالی ارزیابی شد. تحلیل آماری نتایج: دادههای به دست آمده با نرمافزار SPSS نسخه 20 تجزیه و تحلیل شد. آزمون نرمال سنجی برای آزمایشهای پتانسیل جوانهزنی، ریشهزایی و میزان آسیب وارد شده به برگها پس از اسپری کردن مایع تخمیر با استفاده از آزمون شاپیرو- ویلک [7] انجام شد. همچنین، معنادار بودن این دادهها به کمک آزمون تی [8] ارزیابی شد.
نتایج. .غربالگری جدایهها بر اساس سنجش سمیت بر آفتابگردان و جودره: با توجه به حساسیت بالای گیاه آفتابگردان به متابولیتهای ضد گیاهی تولید شده توسط میکروارگانیسمها (17)، به منظور غربالگری اولیه جدایهها از این گیاه استفاده شد. براساس نتایج به دست آمده پس از گذشت 10 روز مشخص شد که از میان 150 جدایه مورد آزمایش، 30 جدایه توانایی ایجاد نکروز و مرگ در برگهای گیاه آفتابگردان را دارند (شکل 1). ایجاد نکروز و کلروز، رشد قارچ در سطح گیاه، مهار رشد برگ و از بین رفتن ساقه و ریشه معیارهای انتخاب جدایههای مثبت در این مرحله بود.
شکل 1- سنجش زیستی جدایههای قارچی روی گیاه آفتابگردان. راست: گیاه تیمار شده با 1 میلیلیتر مایع تخمیر به دست آمده از جدایه HC99، چپ: گیاه شاهد تیمار شده با عصاره محیط کشت PDB
شکل 2- سنجش زیستی جدایههای قارچی بر روی برگهای جودره A: برگ گیاه جودره تیمار شده با عصاره تخمیر سانتریفوژ شده جدایه HC99،B: برگ گیاه جودره تیمار شده با عصاره محیط کشت PDB و C: برگهای گندم تیمار شده با مایع تخمیر حاصل از HC99) (P value<0.05.
در غربالگری ثانویه 30 جدایه منتخب در مرحله قبل که در کوتاهترین زمان بیشترین آثار تخریبی را روی آفتابگردان به همراه داشتند، به منظور بررسی اثر روی گیاه جودره آزمایش شدند. از بین 30 جدایه یاد شده 6 جدایه توانایی در خور توجهی در ایجاد علایم بیماری در علف هرز مورد آزمایش داشتند، که از بین آنها جدایه HC99 به علت داشتن بیشترین اثر سمی در کمترین زمان نسبت به سایر جدایهها انتخاب و برای انجام آزمایشهای بعدی استفاده شد (شکل 2). شناسایی ریختشناسی و مولکولی جدایه HC99: برای شناسایی جدایههای قارچی، ویژگیهای ریختشناسی آنها از قبیل شکل میسلیوم، آرایش اسپورها، آرایش و رنگ کلونی و پیگمانهای تولیدی از طریق رنگ آمیزی با لاکتوفنل کاتن بلو و تهیه اسلاید کالچر و نیز با توجه به کلیدهای شناسایی ریختشناسی مرجع بررسی شد (21). در جدول 1 ویژگیهای میکروسکوپی و ماکروسکوپی جدایه HC99 مشاهده میشود. ساختار کنیدیهای گرد در انتهای کلوملای مربوط به جنس Aspergillus مشاهده میشود. PCR با استفاده از پرایمرهای ITS انجام شده یک باند حدود 700 جفت بازی ایجاد کرد که در شکل 3 مشاهده میشود. توالی تعیین ترادف شده برای جدایه مورد نظر با شماره دسترسی [9] 1773510 در بانک ژنی NCBI ثبت شد. نتیجه حاصل از تعیین ترادف این باند مشخص کرد که جدایه HC99 به میزان 100 درصد با گونه Aspergilluswesterdijkiae خویشاوندی دارد.
شکل 3- تصویر ژل الکتروفورز آگارز 1درصد حاصل از PCR منطقه ITS درA. Westerdijkae UTMC 5040
جدول 1- ویژگیهای میکروسکوپی و ماکروسکوپی کلونیهای جدایه A. westerdijkiae UTMC5040
رنگ و چروکیدگی کلونیها از جمله ویژگیهای متمایز کننده سویه یاد شده از سایر گونههای این جنس از قبیل Aspergillusniger و Aspergillusfumigatus است. جدایه مورد نظر با شماره UTMC5040 در کلکسیون میکروارگانیسمهای دانشگاه تهران نگهداری شد. .سنجش زیستی فعالیت مایع تخمیر جدایه UTMC5040. A. westerdijkiae در کشت گلدانی جودره: عصاره قارچ A.westerdijkiaeUTMC5040 روی برگهای گیاهان بالغ 6 تا 8 هفتهای تیمار شد. تیمار زیستی گیاهان با عصاره در 3 مرحله و هر 4 روز یکبار انجام گرفت. نتایج به دست آمده از سنجش زیستی عصاره روی گیاه در شکل 4 مشاهده میشود. بر اساس نتایج به دست آمده، نکروز و بافت مردگی برگها پس از 3 هفته در گیاهان تیمار شده با عصاره تخمیر قارچی به طور کامل مشاهده شد (شکل 4). در این مرحله از گیاه گندم به عنوان شاهد استفاده شد که بر اساس نتایج ارایه شده در شکل 4، مایع تخمیرقارچتأثیری روی گیاه شاهد پس از 21 روز نداشت.
شکل 4- سنجش زیستی آثار نکروزی مایع تخمیر UTMC5040 A. westerdijkiae در گیاهان بالغ A: علف هرز جودره تیمار شده با عصاره تخمیر سانتریفوژ شده UTMC5040 A. westerdijkiae، B: علف هرز جودره تیمار شده با عصاره محیط کشت PDB و C: گیاه گندم تیمار شده با مایع تخمیر سانتریفوژ شده جدایه UTMC 5040A. westerdijkiae(P value<0.05)
.ارزیابی توان مایع تخمیر قارچی در جلوگیری از جوانه زدن علف هرز جودره: در این آزمایش در هر تکرار 50 عدد از بذر علف هرز با مایع تخمیر قارچی تیمار شد و نتایج پس از گذشت 10 روز ثبت شد. نتایج به دست آمده نشان داده که قوه نامیه بذرها بدون هیچگونه تیمار 90 درصد بود. در ادامه قوه نامیه بذرهای تیمار شده با محیط کشت تلقیح نشده به عنوان شاهد و بذرهای تیمار شده با مایع تخمیر قارچی اندازهگیری شد. نتایج به دست آمده نشان داد که مایع تخمیر
شکل 5- A: درصد جوانهزنی بذرهای علف هرز جودره اسپری شده با عصاره محیط کشت تلقیح نشده و B: درصد جوانهزنی بذرهای علف هرز جودره اسپری شده با مایع تخمیر
ارزیابی توان مایع تخمیر قارچی در مهار ریشهزایی علف هرز جودره: در این آزمایش در هر تکرار 50 عدد از بذر علف هرز تیمار شد. پس از گذشت 10روز از زمان اسپری مایع تخمیر قارچی روی بذرها، نتایج ثبت شد. نتایج به دست آمده نشان داد که اندازه ریشه گیاه جودره به طور میانگین از 60 میلیمتر در نمونههای شاهد به 35 میلیمتر در نمونههای تیمار شده کاهش یافت. نتایج به دست آمده نشان داد که مایع تخمیر
شکل 6- A: میزان ریشهزایی بذرهای جوانه زده جودره اسپری شده با عصاره محیط کشت تلقیح نشده و B: میزان ریشهزایی بذرهای جوانه زده جودره اسپری شده با مایع تخمیرA. westerdijkiae UTMC 5040(P value<0.05) .
بررسی طیف میزبانی UTMC5040 westerdijkiae A. :به منظور ارزیابی دامنه میزبانی، سنجش زیستی مایع تخمیر جدایه A. westerdijkiae UTMC5040روی گیاهان زراعی و گیاهان هرز مختلف بررسی شد. جدول 2 فهرست گیاهان هرز و جدول 3 فهرست گیاهان زراعی مورد استفاده در این آزمایش را نشان میدهد. در انتخاب این گیاهان خویشاوندی دور و نزدیک به جودره و همچنین، میزان انتشار و گسترش علفهای هرز مورد توجه قرار گرفته است. جدول 2- پاسخ علفهای هرز مختلف در برابر تیمار با 1 میلیلیتر مایع تخمیر سانتریفوژ شده جدایه UTMC 5040A. westerdijkiae.گیاهان براساس میزان آسیب وارد شده به سه دسته ایمن (بدون نکروز قابل مشاهده)، مقاوم (با لکه نکروزی دارای قطر کمتر از 1 میلیمتر) و یا حساس (دارای لکه نکروزی بزرگتر از 2 میلیمتر) تقسیمبندی شدند (18) (P value<0.05).
بر اساس نتایج ارایه شده در جدول 2 و 3، آثار نکروزی ناشی از عصاره قارچ منتخب در 4 گونه گیاهی از 24 گونه گیاهی مورد آزمایش مشاهده شد. همچنین، در نمونههای شاهد هیچگونه اثر نکروزی دیده نشد. علاوه بر جودره که بیشترین علایم نکروزی در آن مشاهده شد، در 2 گیاه هرز گارس [x] و علف هرز پیچک صحرایی [xi] آثار نکروزی ایجاد شد. شایان ذکر است جودره و گارس به هم نزدیک بوده و در خانوده پواسه [xii]قرار میگیرند. همچنین، در سایر اعضای متعلق به خانواده پواسه، آثار نکروزی کم و بدون از بین بردن گیاه در جوموشک، چچم و ذرت دیده شد. از میان گیاهان زراعی آثار نکروزی تنها در گیاه کدو [xiii] مشاهده شد. جدول 3- پاسخ گیاهان زراعی مختلف در برابر تیمار با 1 میلیمتر مایع تخمیر جدایه UTMC 5040A. westerdijkiae (P value<0.05)
بحث و نتیجه گیری. علف هرز جودره یکی از علفهای هرز رایج و مخرب در مزارع گندم است که هر ساله خسارات در خور توجهی را به مزارع وارد میکند (6). امروزه به منظور مقابله با این گیاه از علفکشهای شیمیایی استفاده میشود. سولفوسولفورون [xiv] با نام تجاری آپیروس و مت سولفورون متیل به همراه سولفوسولفورون [xv] با نام تجاری توتال مهمترین علفکشهای شیمیایی مورد استفاده برای کنترل جودره هستند (22). ماندگاری بالای این ترکیبات در خاک و همچنین، سمیت ناشی از آن از جمله معایب استفاده از این علف کشهای شیمیایی است (23). نتایج به دست آمده در پژوهش حاضر نشان داد که مایع تخمیر جدایه A. westerdijkiae UTMC5040 آثار نکروزی بالایی را در جودره ایجاد کرده و توانمندی زیادی برای کنترل این گیاه دارد (شکل 2 و 4). نتایج آزمون گلدانی نشان داد که در شرایط کنترل شده، عصاره سانتریفوژ شده مایع تخمیر این قارچ بیماریزایی در خور توجهی برای علف هرز جودره ایجاد میکند. نتایج همچنین نشان داده که این جدایه به خوبی قدرت جوانهزنی این علف هرز را مهار میکند. اطلاعاتی که از آزمایش طیف میزبانی حاصل شد نشان میدهد که جدایه A. westerdijkiae UTMC5040 در سطح خانواده دارای طیف اثر اختصاصی است و میتواند به عنوان یک عامل زیستی توانمند در کنترل جودره استفاده شود. از جمله عواملی که کنترل زیستی علفهای هرز به وسیله اسپورهای قارچی را با مشکل مواجه میکند، نیاز اسپورهای قارچی به رطوبت بالا برای تندش است. بیشتر اسپورها برای تندش به رطوبت نزدیک به حالت اشباع نیاز دارند (24). ولی این مقدار رطوبتی در بسیاری از مواقع به ویژه در مزارع غلات مثل گندم قابل تأمین نیست. از جمله راههای جایگزین برای کنترل زیستی علفهای هرز، استفاده از متابولیتهای قارچی است. اعضای جنس Aspergillus توانمندی بسیار زیادی در تولید متابولیتهای زیستی دارند. از 200 گونه مختلف این جنس تاکنون بیش از 500 متابولیت کشف شده است. این در حالی است که عدد در مورد مخمرها با بیش از 1500 گونه شناخته شده مخمر و بیش از 30 هزار گونه بازیدیومیست، به ترتیب حدود 50 و 300 متابولیت کشف شده است (25). به تازگی نیز کاظمزاده [xvi] و همکاران نیز از مایع تخمیر A. awamori به منظور کنترل زیستی بیماری شانکر مرکبات ایجاد شده توسط Xanthomonascitri استفاده کردهاند (29). بر اساس بررسیهای انجام شده پژوهش حاضر، نخستین گزارش از توانمندیهای متابولیتهای زیستی جنس Aspergillus در کنترل علفهای هرز است. ولی با توجه به ایجاد حساسیت اسپورهای برخی از گونههای جنس Aspergillus مانند A. nigerو نیز امکان تولید آفلاتوکسین توسط این گونهها (26 و 27)، استفاده مستقیم از سویهها در مزرعه، فقط پس از اطمینان از حذف این موارد میسر است. البته میتوان این متابولیتها را در فرمانتور تولید، استخراج و برای اهداف کنترل زیستی استفاده کرد. ولی در این کار باید هزینه حاصل از کشت انبوه قارچ در فرمانتور، استخراج و خالصسازی محصول را در نظر گرفت (25 و 26)، به نحوی که از نظر اقتصادی محصول قابل رقابت با سموم شیمیایی باشد. راه حل دیگر خاموش کردن ژنهای مضر در سویه مولد و استفاده مستقیم از آن در مزرعه است. A. westerdijkiaeبه دست آمده در پژوهش حاضر، قادر به تولید متابولیتهای زیستی زیادی از قبیل پنیسیلینیک اسید، 4- هیدروکسیمیلین، زانتومگنین، ویومیلین، ویوزانتین، سیرکامداتین (A- G)، آسپرولوگزینها و آسپرگامیدهاست(28). اما تاکنون گزارشی مبنی بر فعالیت علف کشی در جنس Aspergillus و استفاده از آن ارایه نشده است. نتایج پژوهش حاضر میتواند در معرفی این قارچ و متابولیتهای تولیدی توسط آن به عنوان یک عامل زیستی کنترل کننده علف هرز جودره استفاده شود. [1]- Bewick [2]- Potato Dextrose Agar [3]- Potato Dextrose Broth [4]- Murashinge and Skoog Agar [5]- Amplicon [6]- Gene all, South Korea [7]- Shapiro- wilk test [8]- T-test [9]- Accession Number [x]- Eremopyrum bonaepartis [xi]- Convolvulus arvensis [xii]- Poaceae [xiii]- Cucurbita moschata [xiv]- Sulfosulfuron [xv]- Metsulfuron methyl + Sulfosulfuron [xvi]- Kazemzadeh | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
مراجع | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(1) Li Y., Sun Z., Zhuang X., Xu L., Chen S., Li M. Research progress on microbial herbicides. Crop Protection 2003; 22 (4): 247- 52. (2) Zimdahl R. Weed-Crop competition. 2nd. ed. UK: Blackwell publishing Ltd Oxford; 2004. (3) Pimentel D., McLaughlin L., Zepp A., Lakitan B., Kraus T., Kleinman P., et al. Environmental and economic impacts of reducing U.S. agricultural pesticide use. In: Pimentel D., editor. Handbook of Pest Management in Agriculture. 2nd. ed. Florida, CN: CRC Press, Boca Raton; 1991. 679- 720. (4) Blattner F. Progress in phylogenetic analysis and a new infrageneric classification of the barley genus Hordeum (Poaceae: Triticeae). Breeding Science 2009; 69 (5): 471- 80. (5) Baghestani M., Saiedipor H., Minbashi M., Lashkari A. Integrated management of H.spontanuem in wheat fields.1st. ed. Tehran: Agricaltural ecology; 2009. (6) Ellis R., Nevo E., Beiles A. Milling energy polymorphism in Hordeum spontaneum Koch in Israel and its potential utilization in breeding for malting quality. Plant Breeding 1993; 111 (6): 78- 81. (7) Kennedy G., Sutton T. Emerging Technologies for Integrated Pest Management: Concepts., Research and Implementation. 1st. ed. Minnesota: The American phytopathological society; 2000. (8) Watson AK. The classical approach with plantpathogens. In: TeBeest DO, editor. Microbial Control ofWeeds. 1st. ed. New York, CN: Chapman and Hall;1991. 3- 23. (9) Charudattan R., Dinoor A. Biological control of weedsusing plant pathogens: accomplishments andlimitations. Crop Protection 2000; 19 (4- 9): 691- 5. (10) Charudattan R. Ecological, practical, and politicalinputs into selection of weed targets: what makes agood biological control target. Biological Control 2005; 35 (5):183- 96. (11) Saxena S., Pandey A. Microbial metabolites as eco-friendly agrochemicals for the next millennium. Application of Microbial Biotechnology 2001; 55 (9): 395- 403. (12) Holm L., Pancho J., Holm E., Pancho J., Herberger J. The worst world weeds: Distribution and biology. 1st. ed. Honolulu: University of Hawaii press; 1977. (13) Hoagland R., Boyette C., Weaver M., Abbas H. Bioherbicides: research and risks. Toxin Review 2007; 26 (7): 313- 42 (14) Bewick T., Binning L., Stevenson W. Discovery of two fungal pathogens of swamp dodder (Cuscuta gronovii Willd). Weed Science Society 1986; 3 (5): 26- 7. (15) Bewick TA., Binning LK., Stevenson WR., Stewart J. A mycoherbicide for control of swamp dodder (Cuscuta gronovii Willd.). In: Weber H., Forstreuter W., editor. Parasitic flowering plants. 2nd. ed. Marburg, CN: Federal and Republic; 1987. 93- 104. (16) Sauer D., Burroughs R. Disinfection of seed surfaces with sodium hypochlorite. Phytopathology 1986; 76 (5): 745- 9. (17) Hamedi J., Papiran R., Moghimi H., Mohammadipanah F. Screening of phytotoxic activity and nlp genes from rhizosphere actinomycetes. Annals of Microbiology 2014; 3 (9): 1- 6. (18) Wapshere A. A strategy for evaluating the safety of organisms for biological weed control. Annals Application of Biology 1974; 77 (3): 201- 11. (19) Sambrook J., David W., Russell D. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd. ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001. (20) Hassanshahian M., Emtiazi G., Cappello S., Isolation and characterization of crude-oil- degrading bacteria from the Persian Gulf and the Caspian Sea. Marine. Pollution. Bulletin 2012; 64 (1); 7- 12. (21) Watanabe T. Pictorial Atlas of Soil and Seed Fungi: Morphologies of Cultured Fungi and Key to Species. 3rd. ed. NewYork: Taylor and Francis; 2011. (22) Zand A., Baghestani M., Bitarafan M., Shimi P. Iranian rigistrated herbicides guideline. 1st. ed. Mashhad: Jahad daneshgahi; 2007. (23) Moyer J., Hamman W. Factors affecting the toxicity of MON 37500 residues to following crops. Weed Technology 2001; 15 (2): 42- 7. (24) Amsellem Z., Cohen B., Gressel J. Engineering hypervirulencein a mycoherbicidal fungus for efficient weed control. Natural Biotechnology 2002; 20 (4): 1035- 9. (25) Jůzlová P., Martínková L., Křen V. Secondary metabolites of the fungus Monascus: A review. Journal of Industrial Microbiology. 1996; 16 (3): 163- 70. (26) Schuster E., Dunn-Coleman N., Frisvad J., Van Dijck P. On the safety of Aspergillus niger a review. Applied Microbiology and Biotechnology 2001; 59 (4): 2650- 2. (27) Abarca M., Bragulat M., Castellá G., Cabañes F. Ochratoxin A production by strains of Aspergillus niger. Applied Environmental Microbiology1994; 60 (7): 2650- 2. (28) Frisvad JC., Frank JM., Houbraken JAMP, Angelina F.A. Kuijpers AFA, Samson RA. New ochratoxin A producing of Aspergillus section Circumduction. Studies in Mycology 2004; 50 (6): 23- 43. (29) Kazemzadeh S., Farrokhi N., Aminzadeh S., Alavi SM., Mamarabadi M., Gudarzi T. Biocontrol of Causative Agent of Citrus Canker Disease Using Antimicrobial Substances Produced by Aspergillus awamori K-03. Biological Journal of Microorganism 2014; 3 (11): 91- 8. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
آمار تعداد مشاهده مقاله: 1,192 تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 835 |