استاندارد کردن PCR تشخیصی به‏ وسیله اینترنال کنترل تکثیری

شاه حسینی, محمد حسن; قهری, مریم; محمودی, محمد امین; مسلمی, الهام

تعداد نشریات	43
تعداد شماره‌ها	1,646
تعداد مقالات	13,379
تعداد مشاهده مقاله	30,117,224
تعداد دریافت فایل اصل مقاله	12,062,896

استاندارد کردن PCR تشخیصی به‏ وسیله اینترنال کنترل تکثیری

زیست شناسی میکروبی

مقاله 7، دوره 4، شماره 15، آذر 1394 اصل مقاله (753.12 K)

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

محمد حسن شاه حسینی^* ¹؛ مریم قهری²؛ محمد امین محمودی²؛ الهام مسلمی³

¹دانشیار بیوتکنولوژیست، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهر قدس، تهران، ایران

²کارشناس ارشد میکروبیولوژی، موسسه ایرانیان ژن فناور (IGF)، تهران، ایران

³استادیار سلولی و مولکولی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شرق، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: بروز نتایج متفاوت در آزمایشگاه‏ها به علت استاندارد نبودن، از معایب روش‏‏‏‏های تکثیر مولکولی است. در بیشتر مقالات چاپ شده در زمینه تشخیص PCR عوامل عفونی، ‏اینترنال کنترل تکثیری (IC) وجود ندارد. هدف از پژوهش حاضر، طراحی و توسعه یک روش ساده و سریع، برای‏‏‏‏‏‏ ساخت اینترنال کنترل آزمون‏‏ PCR ‏در آزمایشگاه‏های ‏تشخیصی است. ‏
مواد و روش‏‏ ها: در پژوهش حاضر، برای ساخت اینترنال کنترل رقابتی، از پرایمرهای مرکب و روش PCR-Cloning استفاده شد‏‏. بدین ترتیب که پرایمرهای جلویی و عقبی تشخیص PCR ویروس هپاتیت) ‏(HBV، ویروس هرپس سیمپلکس ‏HSV))، مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (MTB)،‏‏ مایکوپلاسما پنومونیه (Mpn)،‏‏ کریپتوکوکوس نئوفورمنس ‏(Cne)،‏‏ جنس سالمونلا (Sal. sp) و جنس مایکوپلاسما (M. sp) را در بخش '5 پرایمرهای ژن کینتوپلاست لیشمانیا، به شکل‏‏ دم طراحی و سنتز شد. اینترنال کنترل‏های تکثیری با پلاسمید pTZ57R الحاق و در باکتری اشریشیاکلی JM107 ترانسفورم شد‏‏. تعداد حداقل IC در هر واکنش PCR از طریق رقیق‏سازی ‏‏‏‏و همین‏طور طیف پاسخ PCR همراه با IC بررسی شد‏‏‏‏‏‏‏‏‏. ‏
نتایج: HBV–HSV–MTB–MPN–Cne–Sal. sp– و M. sp با پرایمر‏های اختصاصی به ترتیب برابر با 272bp-284bp-415bp-345bp-245bp-454bp-262bp و محصول اینترنال کنترل هم به ترتیب
672bp-668bp-661bp-669bp-660bp-662bp-660bp جفت باز بود، که از نظر اندازه، اختلاف مطلوبی بین محصول PCR و IC وجود دارد و به آسانی در ژل قابل تفکیک است. تعداد حداقل IC در هر واکنش، 1000 عدد تعیین شد. حداقل و حداکثر حساسیت آزمون‏‏ PCR همراه با IC برای همه عوامل در حد مطلوبی به دست آمد. در آزمون‏‏ ویژگی با عوامل مختلف هم، هیچ محصول ناخواسته‏ای ‏مشاهده نشد. ‏
بحث و نتیجه گیری: نتایج منفی و مثبت کاذب که به علت‏های‏‏‏ مختلف در روش‏‏‏ PCR رخ می‏دهد از مشکلات مهم این روش‏‏‏ جذاب است‏‏‏. استفاده از یک اینترنال کنترل در تشخیص مولکولی به عنوان کنترل داخلی، می‏‏تواند این خطاها را شناسایی کند.

کلیدواژه‌ها

PCR؛ اینترنال کنترل؛ PCR-Cloning

اصل مقاله

مقدمه.

پیشرفت‏های شگرف بیوتکنولوژی و زیست‏شناسی‏‏‏‏‏‏‏‏‏ مولکولی در سال‏های گذشته موجب تغییر روش‏های تشخیصی عوامل میکروبی، از روش‏های بر پایه کشت به روش‏های مولکولی و بیشتر بر اساس تکثیر اسید‏های نوکلئیک شد‏‏ه است (1). کاربرد روش‏های مولکولی بر پایه PCR برای‏‏‏‏‏‏ شناسایی و تعیین مقدار اسید‏های نوکلئیک در پژوهش‏‏‏‏‏‏‏‏‏ و درمان، روز به روز گسترده‏‏‏‏تر می‏‏شود‏‏. از دهه 90 یک افزایش انفجاری در تعداد مقالات چاپ شده در زمینه روش‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏های تکثیر اسید نوکلئیک به ویژه‏‏‏‏‏‏‏‏‏ روش PCR در شناسایی عوامل بیماری‏زا اتفاق افتاده است. شایان ذکر است، متغیرهایی مانند‏‏‏: نوع آزمایشگاه، دستگاه‏های مورد استفاده، نوع و بازده DNA پلیمراز مورد استفاده، کارکنان و سطح آموزش و مهارت‏‏‏‏ها، حضور ممانعت کننده‏ها، هدف‏‏های ژنی متفاوت در عامل مورد شناسایی، سطح بهینه‏سازی ‏‏‏‏آزمون‏‏ با توجه به مهارت‏ها در آزمایشگاه‏ها، روش هایPCR خانگی [1] و شاخص‏های دیگر، باعث شده که ‏در برخی موارد جواب‏های صحیح و قابل تکرار گزارش نشده و فقط برخی از پروتکل‏های چاپ شده در مقالات به طور عملی در آزمایشگاه‏ها تکرار شود (2- 8).

با وجود حساسیت بالا در PCR، موانع و مسایلی نیز در تکثیر قطعات DNA وجود دارد که به عنوان یک سد، مانع از تکثیر و ایجاد جواب‏‏های منفی کاذب می‏‏شود‏‏. حضور مواد بازدارنده در نمونه‏‏های مرضی مانند مایع پلور [2]، مایع مغزی/ نخاعی [3]، خلط [4]، خون محیطی [5]، و دیگر نمونه‏ها مانع از تکثیر می‏‏شود‏‏ (9- 11). روش‏های متعددی برای‏‏‏‏‏‏ نظارت بر حضور مواد ممانعت کننده در PCR گزارش شده است (12- 14) که مهم‏ترین آن‏ها به کارگیری اینترنال کنترل در یک آزمون‏‏ PCR است‏‏‏.

در بیشتر مقالات چاپ شده در زمینه تشخیص PCR عوامل عفونی، ‏اینترنال کنترل تکثیری [6] (IAC) وجود ندارد. بر خلاف کنترل مثبت، اینترنال کنترل بیشتر یک توالی‏‏ DNA غیر هدف حاضر در نمونه است که به طور هم‏زمان با توالی‏‏ هدف تکثیر می‏شود‏‏. در یک PCR بدون IAC، یک پاسخ منفی یعنی این‏که توالی‏‏ هدف حضور ندارد. اما، آن می‏تواند در عین حال به معنای این باشد که واکنش به علتی مانند: اختلال در دستگاه ترموسایکلر، مخلوط PCR غلط، فعالیت آنزیم DNA پلیمراز، یا حداقل حضور مواد بازدارنده در ماتریکس نمونه، ممانعت شده است. به طور بر عکس، در یک PCR با IAC، یک سیگنال کنترل همیشه تولید می‏شود‏‏ که تکثیر اینترنال کنترل است. این کنترل داخلی حتی در عدم حضور توالی هدف مورد آزمایش تکثیر می‏شود‏‏ و اگر تکثیر نشود یعنی اشکالی در تکثیر (به علت‏های متفاوت) وجود دارد (2 و 6- 8).

هدف از پژوهش حاضر، معرفی استراتژی سریع و ساده برای‏‏‏‏‏‏ طراحی و ساخت اینترنال کنترل آزمون‏‏ PCR تشخیصی، برای عواملی مانند ویروس هپاتیت B (HBV) – ویروس هرپس سیمپلکس 1 و 2 (HSV) – مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (MTB) – کریپتوکوکوس نئوفورمنس (Cne) – جنس سالمونلا (Sal. sp) – و جنس مایکوپلاسما (M. sp) به روش رقابتی و از طریق PCR-Cloning، و همین‏طور تعیین حداقل و حداکثر حساسیت آزمون‏‏ به جهت حد تشخیص LOD [7] است.

‏‏مواد و روش‏ها.

تهیه سوش‏‏های استاندارد: در این پژوهش گونه‏های متعلق به مولیکوتس به کار رفته برای‏‏‏‏‏‏ آزمون‏‏ PCR مایکوپلاسما پنومونیه[8] و جنس مایکوپلاسما[9] عبارت بودند از: مایکوپلاسما پنومونیه (NCTC 10119)،‏‏ مایکوپلاسما گالیسپتیکوم[10] (رازی 1355)،‏‏ مایکوپلاسما گالیناروم[11] (رازی 1350 و 1346)، مایکوپلاسما اویاپنومونیه[12] (رازی 1364)، مایکوپلاسما آگالاکتیا[13] (رازی 1343)، اوره آپلاسما اوره آلیتیکوم[14] (رازی 1369) مایکوپلاسما آرجینینی[15]، مایکوپلاسما هیورینیس[16]، مایکوپلاسما ارال[17]، مایکوپلاسما سینوویه[18] و اکول پلاسما لیدلاوی[19] (تهیه شده از انستیتو رازی). سوش استانداردکریپتوکوکوس نئوفورمنس[20] از مرکز کلکسیون قارچ و باکتری سازمان پژوهش‏های علمی و صنعتی ایران به شکل لیوفلیزه (ATCC number: 13690) تهیه ودر محیط کشت yeast malt agar حاوی کلرامفنیکل به میزان 400 (میلی‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏گرم در لیتر) به طور‏‏ اسلنت کشت و سپس، روی آن با محیط کشت سابورو دکستروز براث پوشانده شد. لوله‏ها به مدت 72 ساعت تا یک هفته در دمای 34 تا 37 درجه سانتی‏گراد‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏ گرمخانه‏‏‏‏گذاری شد. ایجاد کلونی‏‏‏‏‏‏‏‏‏ روی سطح شیبدار و کدورت در بخش مایع نشانه رشد مناسب بود.

سوش استاندارد باسیل سل [21] از آزمایشگاه مایکوباکتریولوژی بیمارستان مسیح دانشوری تهیه شد. همین‏طور DNA‏‏ چندین گونه مختلف مایکوباکتریوم مانند مایکوباکتریوم چلونی‏‏‏– آویوم – گوردونه – اینتراسلولار – سزولگای و گزنوپی نیز از دکتر جیم ورنگرن و دکتر سیون هافنر از انستیتو کنترل بیماری‏های عفونی سوئد[22] تهیه شد. سالمونلا تیفی موریومATCC 14028 و چندین نوع سالمونلای دیگر و همین‏طور ویروس هپاتیت B و ویروس هرپس سیمپلکس I و II نیز از بخش ویروس‏شناسی انستیتو پاستور ایران تهیه شد.

استخراج DNA: برای استخراج DNA از میکروارگانیسم‏های مورد مطالعه، ‏از کیت استخراج DNA تولید شرکت سیناکلون بنام DNG با شماره کاتالوگ (DN8118C) استفاده شد. مراحل کاری به طور‏‏ خلاصه عبارت بود از:قرار دادن محلول DNG Plus در ۳٧ درجه و آرام تکان دادن آن، تا به شکل‏‏ یک محلول هم دما و یکنواخت در آید. سپس، ۱۰۰ میکرولیتر از سوسپانسیون عامل با ۴۰۰ میکرولیترمحلول DNG Plus مخلوط ‏و به مدت 15 تا 20 ثانیه ورتکس شد‏‏. نمونه در این مرحله باید به طور کامل به شکل سوسپانسیون درآید و هر گونه تجمع و یا توده‏‏‏‏ای، تخریب شده و از بین رود. سپس، ۳۰۰ میکرولیتر ایزوپروپانول اضافه شده، 10 مرتبه وارونه و متعاقب آن، لوله‏ها در فریزر به مدت ۲۰ دقیقه قرار داده شد. سپس، در rpm۱۲۰۰۰ برای مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ شد‏‏. مایع رویی به آرامی خالی ‏و تیوب به طور‏‏ واژگون بر روی دستمال کاغذی قرار داده شد. 1 میلی‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏لیتر اتانول سرد ٧۵ درصد ‏به رسوب اضافه، به مدت 3 تا 5 ثانیه ورتکس و سپس، در دور rpm ۱۲۰۰۰ برای مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ شد. اتانول ‏کاملاً خالی و رسوب ‏در ۶۵ درجه خشک شد. رسوب که محتوی DNA است در ۵۰ میکرولیترآب همراه با تکان دادن آرام و قرار دادن در ۶۵ درجه خوب حل شد‏‏.

پرایمرها و شرایط PCR: بهینه نمودن آزمون‏‏ PCR برای تشخیصHBV–HSV–MTB–MPN–Cne–Sal. sp– و M. sp، از طریق بهینه نمودن غلظت اجزایی که در واکنش PCR به کار می‏‏روند و همچنین، طراحی و انتخاب برنامه حرارتی مناسب در دستگاه ترموسایکلر انجام شد‏‏ (جدول 1 و 2). پرایمر‏های مورد استفاده در تشخیص کریپتوکوکوس نئوفورمنس، از مطالعات انجام گرفته توسط لویتز[23] در سال 1991 و وون چانگ [24] در سال 1992 به دست آمده‏‏‏‏اند، که توالی آن‏ها در جدول 1 آمده است (15- 18). پرایمر‏های مورد استفاده در تشخیص ویروس هپاتیت B، پرایمر‏های مخصوص ژن آنتی‏ژن سطحی این ویروسHBS است‏‏‏ (19- 21). برای‏‏‏‏‏‏ تشخیص HSV از ژن DNA-Polymerase استفاده و پرایمرها طراحی شد‏‏ (22). درتشخیص MTB ژن هدف IS6110 (23- 27)، و در مایکوپلاسما پنومونیه P1 adhesin ‏(28)، در جنس مایکوپلاسما ‏‏‏‏‏‏‏‏‏16S rRNA(29- 30) و در جنس سالمونلا ژن invA (31) در نظرگرفته شد.

واکنش PCR با مقادیر زیر انجام شد‏‏: ۵ میکرولیتر از DNA استخراج شده با استفاده از پرایمر‏های جلویی و عقبی با غلظت نهایی ٤/٠ میلی‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏مول (یک میکرولیتر از غلظت 10 میلی‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏مولار)، ‏٥/٢ میکرولیتر از بافر PCR (X‏‏‏۱۰)، ‏٧٥/٠ میکرولیتر کلرید منیزیم (₂MgCl) ‏‏‏‏(از غلظت ۵۰ میلی‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏مولار)، ‏٥/٠ میکرولیتر مخلوط dNTP (۱۰ میلی‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏مولار) و 5/1 واحد آنزیم Taq DNA Polymerase (بیوفلوکس)، در حجم نهایی ٢٥ میکرولیتر تکثیر شد. پروفایل حرارتی هر آزمون‏‏ در جدول 2 آمده است. پس از به پایان رسیدن سیکل‏های حرارتی، برای مشاهده DNA تکثیر شده از روش‏‏‏ الکتروفورز استفاده شد. محصولات PCR در کنار سایز مارکر و کنترل‏ها، در ژل آگاروز 5/1 درصد و با استفاده از سایبرگرین و نور UV در دستگاه ژل داکومنتیشن بررسی شد‏‏.

حساسیت و ویژگی: برای‏‏‏‏‏‏ بررسی حساسیت جفت پرایمرهای مورد استفاده، رقت‏هایی از سوسپانسیون عوامل با تعداد مشخص تهیه شد و استخراج DNA از این رقت‏ها به روش DNG-Plus (سیناکلون) انجام و سپس، آزمون PCR برای رقت‏های تهیه شده انجام شد. آزمون ویژگی هم با استفاده از گونه‏های مختلف آزمایش و ارزیابی شدند.

ساخت اینترنال کنترل (IC)‏‏‏: برای‏‏‏‏‏‏ ساخت اینترنال کنترل رقابتی به روش PCR-Cloning، پرایمرهای جلویی و عقبی هر عامل در بخش '5 پرایمرهای ژن کینتوپلاست لیشمانیا (32- 33) با اندازه محصول 620 جفت باز، به شکل‏‏ دم (Tail) طراحی و سنتز شد (جدول 1).

برای انجام واکنش PCR برای‏‏‏‏‏‏ تکثیر قطعه اینترنال کنترل، ۵ میکرولیتر از DNA استخراج شده لیشمانیا با استفاده از پرایمرهای جلویی و عقبی IC با غلظت نهایی ٤/٠ میکرومول، ٥/٢ میکرولیتر از بافر 10X PCR، ٧٥/٠ میکرولیتر کلرید منیزیم (₂MgCl) ‏(از غلظت ۵۰ میلی‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏مولار)، ٥ /٠ میکرولیتر مخلوط dNTP (۱۰ میلی‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏مولار) و 5/1 واحد آنزیم Taq DNA Polymerase، در حجم نهایی ٢٥ میکرولیترتکثیر شد. چرخه‏های حرارتی شامل 35 سیکل متوالی (شامل: ٩۴ درجه سانتی‏گراد‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏ ۳۰ ثانیه، ۶0 درجه سانتی‏گراد‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏ ۳۰ثانیه و ٧۲ درجه سانتی‏گراد‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏ ۱دقیقه) و یک سیکل پلیمریزاسیون نهایی ٧۲ درجه سانتی‏گراد‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏ به مدت 25 دقیقه بود. پس از به پایان رسیدن سیکل‏های حرارتی، برای مشاهده DNA تکثیر شده از روش‏‏‏ الکتروفورز استفاده شد. قطعه حاصل با پلاسمید pTZ57R کمپانی فرمنتاس به مدت 60 دقیقه در 22 درجه سانتی‏گراد لایگیت و سپس، در باکتری اشریشیا کلی JM107 ترانسفورم و کانستراکت حاصل از طریق غربال‏گری سفید/ آبی [25] در محیط حاوی آمپی‏سیلین، X-GAL و IPTG انتخاب شد‏‏. کلون‏های مناسب از طریق استخراج پلاسمید با کیت استخراج پلاسمید
‏‏‏(Thermo scientific Inc.‏‏‏) ‏‏‏و آزمون‏‏ PCR، تأیید شد‏‏ند.

کلونینگ محصول PCR و اینترنال کنترل: پس از خالص‏سازی ‏‏‏‏محصولات PCR و IC‏ها که در جدول 1 آمده است، با استفاده از کیت T/A cloning کمپانی Thermo scientific، محصولات PCR در وکتور pTZ57/R کلون شد‏‏ند. پلاسمید‏های حاوی محصولات PCR حاصل با GeneJET Plasmid Miniprep Kit (K0502) کمپانی Thermo Scientific استخراج شد‏‏. سپس، با روش PCR، پلاسمید‏های حاوی محصولاتPCR و ICها با استفاده از پرایمر‏های تشخیصی تأیید شد‏‏ند.

تعیین غلظت ایده آل IC: هدف از تعریف غلظت DNA ایده آل IC برای PCR، تأیید غلظت بهینه IC است که با ژن هدف، کم‏ترین رقابت در تکثیر را انجام دهد (9). برای‏‏‏‏‏‏ به دست آوردن غلظت بهینه، غلظت‌‏های متفاوت پلاسمید حاویIC و DNA‏های استاندارد آزمایش شد‏‏. غلظت DNA عوامل مورد استفاده در آزمون‏‏ و همچنین IC، به وسیله اسپکتروفتومتر در طول موج260 نانومترتعیین شد. رقت‏های حاوی مقادیر DNA متفاوت عوامل میکروبی که از طریق رقت‏‏های سری [26] تهیه شده بود با مقادیر ثابت IC، آزمون‏‏ شد‏‏. برای PCR، 5 میکرولیتر از DNA ‏عامل میکروبی با 1 میکرولیتر از IC مخلوط و در میکس PCR استفاده شد‏‏. ‏

توالی‏یابی: تعیین توالی DNAها در دو جهت با استفاده از روش ختم زنجیره [27] و به وسیله کمپانی ماکروژن کره انجام شد‏‏. ‏

جدول ۱- توالی پرایمر‏های مورد استفاده برای‏‏‏‏‏‏ تشخیص DNA عوامل و تکثیر اینترنال کنترل

عامل	آغازگر	توالی (5´………..3´)	ژن هدف	سایز محصول ‏(جفت باز)
کریپتوکوکوس نئوفرمنس	ITS1	TCC GTA GGT GAA CCT GCG G	Internal transcribed spacer (ITS) regions	415
	CN4	ATC ACC TTC CCA CTA ACA CAT T
	ICFCneo	TCC GTA GGT GAA CCT GCG GTCgCAgAACgCCCCTACC		661
	ICRCneo	ATC ACC TTC CCA CTA ACA CAT TAGGGGTTGGTGTAAAATAGGC
ویروس هپاتیت B	HBVF	CAA ggT ATg TTg CCC gTT Tg	HBS	262
	HBVR	AAA gCC CTg CgA ACC ACT gA
	ICFHBV	CAA ggT ATg TTg CCC gTT TgT CgC AgA ACg CCC CTA CC		660
	ICRHBV	AAA gCC CTg CgA ACC ACT gAA ggg gTT ggT gTA AAA TAg gC
هرپس سیمپلکس ویروس	HSV-F	ACC TAC Cgg CAT ACA AgC TCA	DNA polymerase	454
	HSV-R	AAg Tgg CTC Tgg CCT ATg TCC
	ICFHSV	ACC TAC Cgg CAT ACA AgC TCATCg CAg AAC gCC CCT ACC		662
	ICRHSV	AAg Tgg CTC Tgg CCT ATg TCCAgg ggT Tgg TgT AAA ATA ggC
مایکوباکتریوم توبرکلوزیس	MTBF	CgT gAg ggC ATC gAg gTg gC	IS61110	245
	MTBR	gCg TAg gCg TCg gTg ACA AA
	ICFMTB	CgT gAg ggC ATC gAg gTg gCT CgC AgA ACg CCC CTA CC		660
	IICRMTB	gCg TAg gCg TCg gTg ACA AAA ggg gTT ggT gTA AAA TAg gC

ادامه جدول ۱- توالی پرایمر‏های مورد استفاده برای‏‏‏‏‏‏ تشخیص DNA عوامل و تکثیر اینترنال کنترل

مایکوپلاسما پنومونیه	MPNF	Agg CTC Agg TCA ATC Tgg CgT ggA	P1 adhesin	345
	MPNR	ggA TCA AAC AgA TCg gTg ACT ggg T
	ICFMPN	Agg CTC Agg TCA ATC Tgg CgT ggA TCg CAg AAC gCC CCT ACC		669
	ICRMPN	ggA TCA AAC AgA TCg gTg ACT ggg TAg ggg TTg gTg TAA AAT Agg C
جنس مایکوپلاسما	MspF	ggg AgC AAA CAg gAT TAg ATA CCC T	16 S rRNA	272
	MspR	TgC ACC ATC TgT CAC TCT gTT AAC CTC
	ICFMsp	ggg AgC AAA CAg gAT TAg ATA CCC TTC gCA gAA CgC CCC TAC C		672
	ICRMsp	TgC ACC ATC TgT CAC TCT gTT AAC CTC Agg ggT Tgg TgT AAA ATA ggC
جنس سالمونلا	SalspF	gTg AAA TTA TCg CCA CgT TCg ggC AA	invA	284
	SalspR	TCA TCg CAC CgT CAA Agg AAC C
	ICFSal	gTg AAA TTA TCg CCA CgT TCg ggC AAT CgC AgA ACg CCC CTA CC		668
	ICRSal	TCA TCg CAC CgT CAA Agg AAC CAg ggg TTg gTg TAA AAT Agg C

جدول 2- پروفایل حرارتی و سایز محصولات بعد از تکثیر

عامل	پروفایل حرارتی	سایزمحصول (جفتباز)
کریپتوکوکوس نئوفرمنس	Pre-Denaturation ‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏6 دقیقه، 94 درجه سانتی‏گراد Denaturation ‏‏‏‏‏‏‏‏‏30 ثانیه، 94 درج
مراجع
(1) Shahhosseiny MH., Tehrani R. Polymerase Chain Reaction (PCR). Ed 2. Shahre Ghods: Islamic Azad University; 2011: 89- 105. (2) Hoorfar j., Malorny B., Abdulmawjood A., Cook N., Wagner M., Fatch P. Practical considerations in design of internal amplification controls for Diagnostic PCR assays. Journal of Clinical Microbiology 2004; 42 (5): 1863- 8. (3) Protocol for the validation of alternative microbiological qualitative methods 2001. Document NV- DOC. D- 2001 -04 -25 (http://nmkl.org/NordVal/NodVal.htm). NordVal, Oslo, Norway. (4) Microbiology of food and animal feeding stuffs. Protocol for the validation of alternative methods (EN ISO 16140) 2002. European Committee for Standardization, AFNOR; Paris, France. (5) Microbiology of food and animal feeding stuffs. Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of foodborne pathogens. General method and specific requirements. 2002. Draft international standard ISO/DIS 22174. DIN, Berlin, Germany. 4. Hoorfar, J. 1999. EU seeking to validate and standardize PCR testing of food pathogens. ASM News (41) 65: 799. (6) Hoorfar J., and Cook N. Critical aspects of standardization of PCR. Methods Molecular Biology 2002; 216 (69): 51- 64. (7) Malorny B., Tassios PT., Ra°dstro¨m P., Cook N., Wagner M., and Hoorfar J. Standardization of diagnostic PCR for the detection of foodborne pathogens. Int. J. Food Microbiol. 2003; 83 (2): 39- 48. (8) Schoder DA., Schmalwieser G., Schauberger M., Kuhn J., Hoorfar M. Physical characteristics of six new thermocyclers. Clinical Chemistry 2003; 49 (43): 960- 3. (9) Cortez-Herrera E., Sperhacke RD., Becker D., Kritski A., Zaha A., Rosa-Rosetti., ML. Internal control in PCR for Mycobacterium tuberculosis: Usefulness and improvement of the diagnosis. Braz. Arch. Biology and Technology 2008; 51 (4): 685- 91. (10) Kolk AHJ., Noordhoek GT., De Leeuw O., Kuijper S., Van Embden JDA. Mycobacterium smegmatis strain for detection of Mycobacterium tuberculosis by PCR used as internal control for inhibition of amplification and for quantification of bacteria. Journal of Clinical Microbiology 1994; 32 (10): 1354- 6. (11) Wilson IG. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. Applied and Environmental Microbiology 1997; 63(10): 3741- 51. (12) Brightwell G., Pearce M., Leslie D. Development of internal controls for PCR detection of Bacillus anthracis. Molecular and Cellular Probes 1998; 12 (353): 367- 77. (13) Osaki M., Adachin H., Gomyo Y., Yoshida H., Ito H. Detection of mycobacterial DNA in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue specimens by duplex polymerase chain reaction: Application to histopathologic diagnosis. Modern Pathology 1997. 10 (51): 78- 83. (14) Picard FJ., Gagnon M., Bernier MR., Parham NJ., Bastien M., Boissinot M., et al. Internal control for nucleic acid testing based on the use of purified Bacillus atrophaeus sub sp. Globigii spors. Journal of Clinical Microbiology 2009; 47 (2): 751- 7. (15) Levitz S. M. The ecology of Cryptococcus neoformans and the epidemiology of Cryptococcosis. Review of Infectious Diseases 1991; 13 (6): 1163- 9. (16) Kwon-Chung KJ., Edman JC., Wickes BL. Genetic association of mating types and virulence in Cryptococcus neoformans. Infection and Immunity 1992; 60 (6): 602- 5. (17) Chen J., Varma A., Diaz MR., Litvintseva AP., Wollenberg KK., Kwon-Chung KJ. Cryptococcus neoformans Strains and Infection in Apparently Immunocompetent Patients, China. Emerging Infectious Diseases 2008; 14 (5): 755- 62. (18) Kwon- Chung KJ., Varma A. Do major species concepts support one, two or more species within Cryptococcus neoformans? FEMS Yeast Research 2006; 6 (6): 574- 87. (19) Pawlotsky JM., Bastiec A., He´zodec Ch., Lonjon I., Darthuy F., Re´mire´ J., et al. Routine detection and quantification of hepatitis B virus DNA in clinical laboratories: performance of three commercial assays. Journal of Virological Methods 2000; 85 (34): 11- 21. (20) Weber B., Berge A. Molecular detection of hepatitis B virus: recent developments. Journal of Laboratory Medicine 2005; 29 (1): 33- 43. (21) Moslemi E., Shahhosseiny MH., Javadi G., Parivar K., Sattari TN., Keyvani-Amini H. Loop mediated isothermal amplification (LAMP) for rapid detection of HBV in Iran. African Journal of Microbiol Research 2009; 3 (8): 439- 45. (22) Bahrami A., Shahhosseiny M.H., Azadmanesh K., Moslemi E., Noormohamadi Z., Jadali F. Optimization of Loop- Mediated Isothermal Amplification (LAMP) method for detection of herpes simplex virus type 1 and 2. Scientific Journal of Kurdestan University of Medical Sciences 2011; 16 (59): 56- 63. (23) Greenaway C., Menzies D., Fanning A., Grewal R., Yuan L., FitzGerald JM. Canadian Collaborative Group in nosocomial Transmission of Tuberculosis. Delay in diagnosis among hospitalized patients with active tuberculosis predictors and outcomes. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine 2002; (165): 927- 33. (24) Aryan E., Makvandi M., Farajzadeh A., Huygen K., Bifani P., Mousavi SL., et al. A novel and more sensitive loop-mediated isothermal amplification assay targeting IS6110 for detection of Mycobacterium tuberculosis complex. Microbiology Research 2010; 165 (5): 211- 20. (25) Su WJ. Recent advances in the molecular diagnosis of tuberculosis. Journal of Microbiology and Immunology Infection 2002; 35 (4): 209- 14. (26) Green C., Huggett JF. Talbot E., Mwaba P., Reither K., Zumla AI. Rapid diagnosis of tuberculosis through the detection of mycobacterial DNA in urine by nucleic acid amplification. Lancet Infectious Diseases 2009; 9 (3): 505- 11. (27) Kohan L., Shahhosseiny MH., Razavi MR., Parivar K., Moslemi E., Verngren J. Evaluation of loop mediated isothermal amplification for diagnosis of Mycobacterium tuberculosis complex in clinical samples. African Journal of Biotechnology 2011; 10 (26): 5096- 101. (28) Shahhosseiny MH., Mardani M., Hosseini Z., Khoramkhorshid HR., Rahimi AA., Vande-yusefi J. Comparison of PCR and culture tests for diagnosis of Mycoplasma pneumoniae respiratory tract infections. Journal of Zanjan University of Medical Sciences & Health Services 2006; 14 (56): 12- 23. (29) Shahhosseiny MH., Hosseini Z., Khoramkhorshid HR., Azari S., Shokrgozar MA. Rapid and sensitive detection of Mollicutes in cell culture by polymerase chain reaction. Journal of Basic Microbiology 2010; 50 (56): 171- 8. (30) Shahhosseiny MH., Gharibdust F., Allahyari E., Khoramkhorshid HR., Vande-Yusefi J. Detection of Mycoplasmal DNA in rheumatoid arthritis patients serum by PCR. Journal of Medical Council of Islamic Republic of IRAN 2007; 25 (2): 178- 91. (31) Soltani-Banavandi MJ., Shahhosseiny MH., Shahbazzadeh V., Karimi H., Mirzahosseiny F., Mahboudi D., et al. Selective amplification of prt., tyV and invA genes by multiplex PCR. Iranian Biomedical Journal 2005; 9 (3): 135- 8. (32) Mahboudi F., Abolhassan M., Yaran M., Mobtaker H., Azizi M. Identification and differentiation of Iranian Leishmania species by PCR amplification of kDNA. Scandinavian Journal of Infectious Diseases 2001; 33 (8): 596- 8. (33) Mahboudi F., Abolhassani M., T ehrani S.R., A zimi M., A smar M. Differentiation of old and new world leishmania species at complex and species levels by PCR. Scandinavian Journal of Infectious Diseases 2002; 34 (10): 756- 8. (34) Burkardt H.J. Standardization and Quality control of PCR analyses. Clinical Chemistry Laboratory Medicine 2000; 38 (2): 87- 91. (35) Sachadyn P., Kur J. The construction and use of a PCR internal control. Molecular and Cellular Probes 1998; 12 (5): 259- 62. (36) Siebert P.D., W. Larrick J. Competitive PCR. Nature 1992; 359 (26): 557- 8. (37) Rosenstraus M., Wang Z., Chang S.Y., DeBonville D., Spadoro J.P. An internal control for routine diagnostic PCR: design, properties, and effect on clinical performance. Journal of clinical and Microbilogy1993; 36 (8): 191- 7. (38) Ra dstro¨m P., fstro¨m C. Lo., Venklev M., Knutsson R., Wolffs P. Strategies for overcoming PCR inhibition, In C. W. Diefenbach and G.S. Dveksler (ed.), PCR primer: a laboratory manual. Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor, N. Y. 2003. P. 149- 61. (39) Lu¨beck P.S., Wolffs P., Ra dstro m P., Hoorfar J. Toward an international standard for PCR-based detection of food-borne thermotolerant campylobacters: assay development and analytical validation. Apply Environmental Microbiology 2003; 69 (2): 5664- 69. (40) Brightwell G., Pearce M., Leslie D. Development of internal controls for PCR detection of Bacillus anthracis. Molecular and Cellular Probes 1998; 12 (22): 367- 77. (41) Abdulmawjood A., Roth S., Bu lte M. Two methods for construction of internal amplification controls for the detection of Escherichia coliO157 by polymerase chain reaction. Molecular and Cellular Probes 2002; 16 (5): 335- 9. (42) Belotserkovskii B P., Johnston BH. Polypropylene tube surfaces may include denaturation and multimerisation of DNA. Science 2003; 271 (42): 222- 3.
آمار تعداد مشاهده مقاله: 21,219 تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 944

سامانه مدیریت نشریات علمی. قدرت گرفته از سیناوب

پیوندهای مفید

اخبار و اعلانات

آمار

استاندارد کردن PCR تشخیصی به‏ وسیله اینترنال کنترل تکثیری

(17) Chen J., Varma A., Diaz MR., Litvintseva AP., Wollenberg KK., Kwon-Chung KJ. Cryptococcus neoformans Strains and Infection in Apparently Immunocompetent Patients, China. Emerging Infectious Diseases 2008; 14 (5): 755- 62.