بررسی و تولید روغن امگا3 غنی از دوکوزاهگزانوئیک اسید توسط سویه بومی آئورانتیوکیتریوم TA4

مقدمه

‏ از دهه 1930 کشف شد که اسیدهای چرب امگا3 برای رشد طبیعی و سلامتی انسان ضروری هستند. ارزش اسیدهای چرب امگا3 در دهه 1970 با مطالعه و بررسی‏هایی ‏که بر روی قبایل و جمعیت‏های اسکیموهای گرینلند انجام شد، به اثبات رسید.‏ این جمعیت‏ها به علت‏ مصرف مقدار زیادی از روغن ماهی هیچ نشانه‏ای از علایم بیماری‏های قلبی-‌ عروقی در آن‏ها مشاهده نشده بود، و این سطح بالای مصرف اسید‏های چرب امگا3، از میزان تری‏گلیسرید، حمله قلبی و فشار خون و بیماری آترواسکلروزیس در جمعیت آن‏ها کاسته بود (1). همچنین، شیوع پایین بیماری‏های قلبی در دیگر جمعیت‏هایی ‏مانند نوروژی‏ها و ژاپنی‏ها که غذای ماهی زیادی مصرف می‌کنند؛ کمک کرد که پژوهش‏های ویژه و مهمی بر روی اسید‏های چرب امگا3 انجام شود (2). فایده و نقش مهم اسیدهای چرب امگا3 به ویژه دوکوزاهگزانوئیک اسید^[1] (DHA: C22: 6 n-3) ‏و ایکوزاپنتانوئیک اسید^[2]
(EPA: C20:5 n-3) با مطالعات گسترده‏ای که در این زمینه انجام شد به اثبات رسیده است. اسیدهای چرب امگا3 گروه بزرگی از اسیدهای چرب غیراشباع با زنجیره کربنی بلند و چندین باند دوگانه در ساختارشان ^[3] (PUFAs) هستند (1 و 3). این اسیدهای چرب موجب ویژگی‏های منحصر به فرد سیالیت، نفوذ‏پذیری و انعطاف پذیری در غشاهای سلولی می‌شوند (4).گیاهان توانایی سنتز ایکوزاپنتانوئیک اسیدو دوکوزاهگزانوئیک اسید را ندارند و این ترکیبات تنها از طریق منابع دریایی تامین می‏شوند. به علت‏ اینکه این اسیدهای چرب برای متابولیسم نرمال بدن، حیاتی و ضروری هستند، آن‏ها را به عنوان اسید چرب ضروری در نظر می‌گیرند (2 و 5). انسان و سایر حیوانات برای تامین مقدار کافی از دوکوزاهگزانوئیک اسید و سایر اسید‏های چرب غیر اشباع، از قبیل ایکوزاپنتانوئیک اسید، دو مسیر را طی می‏کنند. یکی این‏که آن‏ها را به طور مستقیم از طریق رژیم غذایی خود و با مصرف منابع دریایی به‏دست آورند و یا این‏که آن‏ها را از طریق مصرف رژیم غذایی گیاهی حاوی پیش ماده آلفا لینولنیک اسید^[4] (ALA:C18:3 n-3) و تبدیل ناچیز آن به ایکوزاپنتانوئیک اسید و دوکوزاهگزانوئیک اسید تأمین می‏کنند (3‏). اسید‏های چرب امگا3 به ویژه دوکوزاهگزانوئیک اسید در سلامتی انسان، رشد، توسعه و تکامل مغز و چشم نقش مهمی دارند (6‏). تجمع دوکوزاهگزانوئیک اسید در غشاهای سلول‏های عصبی به عنوان شاخص مهمی از پایداری، برد عملیاتی و توان مغزی است. آزمایش‏های کلینیکی با رژیم غذایی غنی شده از دوکوزاهگزانوئیک اسید نشان داده‏اندکه افزایش چشمگیری در سطح و ظرفیت یادگیری بچه‏ها در سنین مدرسه مشاهده می‌شود (4‏). همچنین، دوکوزاهگزانوئیک اسید در ساختار فسفاتیدیل سرین که یکی از مواد مغذی و مهم برای مغز است، حضور دارد. غشای سلول‏های نورونی دارای مقدار زیاد فسفاتیدیل سرین است. فسفاتیدیل ‏سرین ‏نقش مهمی در فعالیت‏ها و عملکرد‏هایی ‏که نیاز به هوش زیاد دارند ایفا می‌کند و از این رو دارای آثار مثبت در خلق و خوی افراد، کنترل و مدیریت استرس افراد است (4‏). همچنین شواهد زیادی وجود دارد که اسیدهای چرب غیر اشباع به عنوان رژیم غذای مکمل در تمام دوران زندگی فرد و به ویژه دوران بارداری، شیر دهی، کودکی و کهن‏سالی مورد نیاز است. امروزه توصیه‏های زیادی می‌شودکه این دو اسید چرب (EPA و به ویژه DHA) در رژیم غذایی انسان وجود داشته باشند. همچنین، دوکوزاهگزانوئیک اسید ‏تحریک کننده فرآیند آپوپتوز در سلول‏های سرطانی است (2 و 4‏). از این رو لازم است تا به دنبال منابع جدید، سالم و مناسب برای تامین آن بود. در اوایل دهه 1990 تنها منبع مصرفی دوکوزاهگزانوئیک اسید که توسط متخصصین تغذیه معرفی شده بود، روغن ماهی بود (1‏). اما روغن ماهی دارای معایبی چون مزه و بوی نامطلوب و پایداری اکسیداتیو پایین هستند. استفاده از روش‏های شیمیایی در استخراج آن، کم بودن منابع تولیدی به علت‏ صید زیاد و آلودگی دریاها با فلزات سنگین چون جیوه و به دنبال آن احتمال حضور این ترکیبات سمی در اسید‌های چرب امگا3 استخراج شده از ماهی از دیگر معایب آن بوده و از این رو پژوهشگران به دنبال منابع جایگزین روغن ماهی بوده‏اند (1، 3 و 5). پژوهش‏های جدید نشان داده‏اند که تعدادی از میکروارگانیسم‏ها توانایی تولید روغن‏های خوراکی شامل اسید‌های چرب امگا3 را به مقدار چشمگیری دارند. این سویه‏ها شامل جنس‏های ژاپونوکیتریوم^[5]، آئورانتوکیتریوم^[6]، اولکنیا^[7]، شیزوکیتریوم^[8]، ترائوستوکیتریوم^[9]و کریپتکودینیوم کوهنی^[10]بوده و بیشتر مربوط به خانواده ترائوستوکیتریدها^[11] هستند. محتوی روغن آن‏ها بیش از 50 درصد وزن خشک‌شان ‏بوده و ترکیب با ارزش دوکوزاهگزانوئیک اسید در میان کل محتویات روغن‌های تولیدی توسط آن‏ها بیش از 30 درصد است. مزیت و فایده دیگر روغن تک سلولی‏ها این است که معمولا به طور مشخص شامل مقدار زیاد آنتی اکسیدان‏های طبیعی از قبیل کاروتنوئیدها، آستازانتین و توکوفرول‏ها هستند که توانایی محافظت اسیدهای چرب امگا3 از اکسیداسیون را دارند (7‏). از این رو با توجه به ارزش بالای این سویه‏های میکروارگانیسمی در تولید اسید‏های چرب امگا‏3 و به ویژه دوکوزاهگزانوئیک اسید، هدف از انجام این پژوهش نمونه‏برداری وسیع از اکوسیستم جنگل‏های مانگرو در نواحی جنوبی ایران، جداسازی و غربال‏گری سویه‌های ‏پروتیست دریازی از خانواده ترائوستوکیتریدها و بررسی تولید اسید چرب امگا‏3 دوکوزاهگزانوئیک اسید برای نخستین بار در ایران است.

‏‏.مواد و روش‏ها

مواد مورد استفاده: ترکیبات مورد استفاده در محیط کشت شامل گلوگز، عصاره مخمر، پپتون و آگار از شرکت مرک آلمان[12] خریداری شد. رنگ فلوروسنت نایل رد از شرکت سیگما امریکا[13] خریداری شد. تمامی حلال‏های مورد استفاده نیز از شرکت مرک آلمان خریداری شد.

نمونه‏برداری: نمونه‏برداری در طی چند مرحله و از مناطق مختلف اکوسیستم‏های جنگل‏های مانگرو در مناطق جنوبی ایران، در سواحل خلیج فارس و دریای عمان شامل قشم، کیش، چابهار و بوشهر انجام شد. یک‏سری از برگ‌های درختان حرا^[14] ‏و چندل^[15] که شامل برگ‏های تازه و پوسیده و در حال فساد و تجزیه بودند جمع‏آوری شد. از آب دریا نیز چند نمونه جمع‏آوری شد. نمونه‏ها بعد از انتقال به آزمایشگاه، تا زمان استفاده در دمای 4 درجه سانتی‏گراد و در یخچال نگه داری شد.

جداسازی سویه‏ها با روش کشت مستقیم نمونه‏ها: در این روش تعدادی از نمونه‏های برگ به منظور از بین بردن آلودگی‏های سطحی به مدت 1 دقیقه توسط الکل 70 درصد ضدعفونی، با آب مقطر شسته و توسط اسکارپل به قطعات کوچکی تقسیم شد (8‏). ‏سپس آن‏ها بر روی محیط کشت گلوگز، عصاره مخمر، پپتون و آگار حاوی آنتی بیوتیک[16]،‏ قرار داده شد. ترکیبات این محیط کشت شامل ‏گلوگز 15 میلی‏گرم بر لیتر، عصاره مخمر 1 گرم بر لیتر، پپتون گرم بر لیتر 1، آگار 15 گرم بر لیتر، ‏آنتی‏بیوتیک‏های پنی‏سلین و استرپتومایسین هر کدام 3/0 گرم بر لیتر و با نسبت50 درصد از آب دریا بودند. پلیت‏های تلقیح شده در دمای 30 درجه سانتی‏گراد به مدت 3 تا 7 روز انکوبه شدند. در مدت زمان انکوباسیون، سویه‌های ترائوستوکیترید در حاشیه قطعات برگ‏ها بر روی محیط جامد آگاردار رشد کردند. سپس آن‏ها توسط لوپ استریل به یک محیط کشت جدید GYP آنتی بیوتیک‏دار انتقال داده و دوباره به مدت 48 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‏گراد انکوبه شدند. پس از رشد مناسب سویه‏ها و خالص‏سازی آن‏ها، از سویه‏های خالص اسلنت تهیه و در دمای 4 درجه به مدت یک ماه نگه‏داری شد. به علت‏ آن که محیط کشت GYP دارای آنتی‏بیوتیک‏های پنی‏سلین و استرپتومایسین بود، مانع رشد آلودگی‏های باکتریایی شده و جداسازی سویه پروتیست مورد نظر راحت‏تر انجام شد (9‏).

روش جداسازی سویه‏ها با استفاده از دانه گرده: نمونه‏هایی ‏از هر دو گروه آب دریا و برگ‏های پوسیده به ارلن‏های کوچک انتقال داده، به آن‏ها مقداری دانه استریل گرده کاج افزوده، درب ارلن‏ها با پنبه بسته و به مدت 7 روز در30 درجه سانتی‏گراد و در rpm ‏150 انکوبه شد. پس از آن مقداری از دانه‏های گرده از روی سطح محیط کشت توسط لوپ برداشته، به شکل استریک به محیط کشت GYP آنتی بیوتیک دار ‏انتقال داده و به مدت 3 تا 7 روز در 30 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد (1‏).‏ بعد از رشد سویه‏ها و خالص‏سازی آن‏ها، کشت‏های خالص از سویه‏ها در دمای 4 درجه یخچال نگه‏داری شد.

شناسایی ریخت‏شناسی سویه غربال‏گری شده: شناسایی اولیه سویه‏های غربال‏گری شده براساس آزمون‏های اولیه شامل شکل میکروسکوپی، شکل و رنگ کلونی و مشاهده مراحل مختلف چرخه زندگی سویه انجام شد و از بین آن‏ها سویه‏ای که بیش‏ترین شباهت را به ترائوستوکیتریدها را داشت، انتخاب شد (11‏).

.شناسایی مولکولی ترائوستوکیتریدها و تعیین توالی ژن 18S rRNA: DNA ژنومی با استفاده از روش فنل/ کلروفرم استخراج شد. ژن 18S rRNA با استفاده از PCR و بر طبق برنامه جدول 1 تکثیر شد. پرایمر رفتی T18S1F (5'-CAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3')

 و پرایمر برگشتی T18S5R

(5'-TCACTACGGAAACCTTGTTACGAC-3') برای تکثیر ژن، استفاده شد. سپس، محصول PCR تخلیص و تعیین توالی شد (8 و 22).

پس از انجام شدن واکنش PCR،‏ محصول تکثیر شده بر روی ژل آگاروز 1 درصد در شرایط بافری TAE و با ولتاژ 80 ولت به مدت 60 دقیقه الکتروفورز شد. در این واکنش بتائین و دی متیل سولفوکساید به عنوان افزایش دهنده کارآیی در واکنش PCR استفاده شد.

جدول 1- برنامه PCR برای جفت پرایمرهای T18S1F و T18S5R

.محیط کشت تولید دوکوزاهگزانوئیک اسید و تری‏آسیل گلیسرول‏های ذخیره‏ای: یک کشت تازه از سویه پروتیست غربال‏گری شده بر روی محیط کشت GYP آگار دار جامد شامل گلوگز 15گرم بر لیتر،‏ عصاره مخمر ‏1 گرم بر لیتر، پپتون 1 گرم بر لیتر،‏ آگار 15 گرم بر لیتر و با نسبت 50 درصد از آب دریا تهیه شد. سپس معادل نصف لوپ از کشت برداشته و به محیط کشت تولیدی (محیط کشت مایع فوق بدون آگار ) تلقیح انجام شد. ارلن‌های تلقیح شده در دمای 30 درجه و rpm 150 به مدت 72 ساعت انکوبه شد.

.غربال‏گری سویه‏های تولید کننده تری آسیل‏گلیسرول توسط میکروسکوپ فلورسنت: از سویه‌هایی که روی محیط گلوگز، ‏عصاره مخمر و پپتون کشت داده شدند یک لوپ برداشته و در روی لام شیشه‏ای پخش و بعد از خشک شدن، چند قطره از رنگ نایل رد با غلظت5/0میکروگرم در میلی‏لیتر در حلال دی‏متیل سولفوکساید[17] به سلول‏های تثبیت شده بر روی لام افزوده شد. سپس سلول‏ها توسط میکروسکوپ فلورسنتمدل Axioplan2 Imaging مشاهده شد. دانه‏های تری‏آسیل‏گلیسرول در معرض نور یووی[18] به شکل نارنجی در داخل سلول‏ها مشاهده شد (10‏).

تعیین وزن خشک سلولی: به منظور سنجش بیوماس، ‏25 میلی‏لیتر از محیط کشت در ‏rpm 4000 و به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ و سوپرناتانت دور ریخته شد. سپس، پلت سلولی برای خشک شدن در آون با دمای 105 درجه تا رسیدن به وزن ثابت (مدت 24 ساعت) قرار داده شد (9‏).

.استخراج روغن از وزن خشک و تعیین میزان تری‏آسیل گلیسرول‏های ذخیره ای به روش وزن‏سنجی: ‏استخراج روغن از بیومس خشک سلولی بر طبق پروتکل استخراجی بلایت و دایر[19] با کمی تغییرات انجام شد (12‏). در این روش ابتدا مقدار مشخصی از بیومس خشک سلولی وزن کرده و به فالکون انتقال داده شد. سپس به آن مقدار 2 میلی‏لیتر آب مقطر افزوده شد. پس از آن خورد کردن بیومس خشک سلولی توسط دستگاه التراسونیک مدل UP200S به مدت 5 دقیقه انجام گرفت. سپس، مقدار 5/2 میلی‏لیتر از محلول کلروفرم و 5 میلی‏لیتر از محلول متانول به آن اضافه شد و توسط دستگاه هموژنیزر و التراسونیک خرد شدن دیواره سلولی به مدت 4 دقیقه انجام گرفت. دوباره مقدار 5/2 میلی‏لیتر کلروفرم و 5/2 میلی‏لیتر آب مقطر اضافه شد و به دنبال آن به مدت 2 دقیقه هموژنیزر و ورتکس شدن انجام شد. سپس، آن‏ها در rpm 4000 به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژشده و به دنبال آن دو فاز تشکیل شد. لایه پایین (فاز آلی) برداشته و به فالکون تمیز از قبل وزن شده دیگر انتقال داده شد. سپس، عمل تبخیر حلال کلروفرم در زیر هود انجام شد (13 و 14). پس از آن توزین دوباره اپندورف انجام شده و از اختلاف آن با وزن اپندورف خالی، وزن روغن تولیدی توسط سویه پروتیست مورد نظر محاسبه شد. روغن تولیدی برای نگه‏داری برای انجام تحلیل‏های دیگر، به فریز منفی 20 منتقل شد (13 و 15).

.روش آماده‏سازی نمونه برای انجام تحلیل کروماتوگرافی گازی: برای آن که روغن‏های ذخیره‏ای سویه قابلیت تحلیل توسط دستگاه کروماتوگرافی گازی را داشته باشند باید به فرم متیل استر اسید چرب تبدیل شوند. زمانی که اسیدهای چرب به فرم متیل استر تبدیل می‏شوند اطلاعات کروماتوگرافی محکم‏تر و از قابلیت تکرار پذیری بالاتری برخوردار هستند (16‏). مقدار مشخصی از روغن استخراج شده، وزن شده به یک لوله آزمایش درپیچ دار منتقل شد. سپس به آن مقدار 3 میلی‏لیتر متانولیک سولفوریک اسید 4 درصد اضافه و درب لوله آزمایش محکم بسته شد. سپس، توسط دستگاه حمام التراسونیک به مدت 10 دقیقه در دمای 40 درجه التراسونیک بیومس انجام شد. پس از آن، نمونه در بن ماری و در دمای 80 درجه به مدت 90 دقیقه قرار داده شد. بعد از اتمام زمان فوق، نمونه برداشته و در دمای محیط برای سرد شدن قرار داده شد. زمانی که نمونه به مقدار کافی سرد شد به آن 1 میلی‏لیتر آب افزوده و به دنبال آن عمل ورتکس شدن به مدت 30 ثانیه انجام شد. سپس، 1 میلی‏لیتر هگزان اضافه شده و دوباره 30 ثانیه ورتکس شد. برای مدتی نمونه را ثابت گذاشته تا دو فاز تشکیل شد. پس از آن فاز رویی (فاز آلی) که شامل فاز متیل استر‏های موجود در هگزان بوده برداشته و به لوله آزمایش تمیز دیگری انتقال داده شد. به مقدار کم (نوک یک اسپاتول) از نمک سدیم سولفات[20] برای جذب آب یا اسید در محلول اضافه شد، تا آب به ستون دستگاه GC آسیبی وارد نکند (13‏). پس از افزودن نمک فوق دوباره 30 ثانیه عمل ورتکس انجام ، فاز آلی برداشته و به اپندورف تمیز دیگری منتقل شد. نمونه برای تزریق به دستگاه کروماتوگرافی رقیق شد. به این شکل که 50 ماکرولیتر از آن برداشته و در اپندرف دیگر 950 ماکرولیتر حلال هگزان به آن افزوده و پس از آن دوباره 30 ثانیه عمل ورتکس شدن انجام شد. نمونه برای تحلیل کروماتوگرافی آماده شده و تا زمان تزریق به دستگاه کروماتوگرافی در یخچال 4 درجه نگه‏داری شد. پس از تزریق نمونه به دستگاه و اتمام تحلیل برای نگه‏داری استوک، نمونه به فریز منفی 20 منتقل شد (9، 15 و 17).

.تحلیل کروماتوگرافی گازی برای تعیین تولید DHA: در این پژوهش برای بررسی تولید دوکوزاهگزانوئیک اسید، محاسبه مقدار آن و همچنین طیف اسید‏های چرب تولیدی توسط سویه پروتیست، تحلیل متیل استرهای چرب تولید شده توسط کروماتوگرافی گازی انجام شد (17‏). دستگاه کروماتوگرافی گازی مورد استفاده در این پژوهش مدل N, Agilent 6890 وساخت کشور امریکا بود. ستون دستگاه از نوع DB-23 بوده که 30 متر طول و 32/0 میلی‏متر عرض داشت. این ستون پوشیده از سیانوپروپیل با فاز ثابت مویینه بود و جداسازی خوب و تخمین مناسب از اسید‏های چرب امگا3 را انجام داد. و همچنین، قابلیت تشخیص و جداسازی ترکیبات دوکوزاهگزانوئیک اسید و ایکوزاپنتانوئیک اسید را دارا بود. تنظیمات دستگاه شامل دمای دتکتور و اینجکتور هر دو 300 درجه سانتی‏گراد، حجم تزریق نمونه 5/0 میکرو لیتر، گاز نیتروژن گاز حامل و برنامه دمایی و زمانی آون به شکل 50 درجه سانتی‏گراد به مدت 2 دقیقه، 10 درجه سانتی‏گراد در هر دقیقه تا رسیدن به 180 درجه سانتی‏گراد با زمان ماندگاری 5 دقیقه و سپس، 5 درجه سانتی‏گراد در هر دقیقه تا رسیدن به 240 درجه سانتی‏گراد با زمان ماندگاری 7 دقیقه تنظیم شد.

.نتایج

نتایج حاصل از جداسازی با کشت مستقیم: از بین کشت‌های مربوط به نمونه‏های جمع آوری شده از درختان مانگرو که شامل برگ‏های پوسیده، برگ‏های تازه و قسمت‏های ساقه و ریشه این درختان بود، بیش‏ترین رشد میکروارگانیسم‌ها مربوط به برگ‌های پوسیده بود که کلونی‌ها از نواحی حاشیه‏ای برگ‏ها رشد کردند. کلونی سویه‌های رشد یافته، جداسازی و بر روی محیط کشتGYP جامد آنتی‏بیوتیک‏دار خالص‏سازی شدند. آنتی‏بیوتیک‏های پنی‏سلین و استرپتومایسین از رشد کلونی‏ باکتری‏ها جلوگیری کرده و جداسازی و خالص‏سازی کلونی‏‏های تک سلولی ترائوستوکیتریدها راحت‏تر انجام شد. با گذشت زمان یکسری از قارچ‏های ریسه‏ای و پرسلولی با انتشار هاگ‌های خود با سرعت زیادی رشد کرده و تمام سطح پلیت را می‏پوشانند و مانع دیده شدن کلونی‏ ترائوستوکیتریدها می‏شوند. اما از آنجا که کلونی‏‏های تک سلولی ترائوستوکیتریدها زودتر از قارچ‏های ریسه دار رشد می‏کنند زودتر جداسازی شدند که مانع از پوشیده شدن آن‏ها توسط قارچ‏های ریسه‏ای شد. در این پژوهش، بیش از 20 سویه پروتیست از نمونه‏های جمع‏آوری شده، جداسازی شد. سپس، سویه‏های خالص جهت نگه‏داری و انجام سایرآزمایشات بر روی محیط کشت GYP اسلنت کشت و در یخچال با دمای 4 درجه به نگه‏داری شد.

.بررسی ویژگی‏های ریخت‏شناسی سویه‏های غربال‏گری.‏شده: از سویه‌های خالص کشت تازه 24 ساعته تهیه شد. این سویه‌ها از نظر رنگ کلونی‏، شکل، ظاهر کلونی‏ روی محیط جامد و میزان و نحوه رشد در کشت مایع مورد بررسی قرار گرفتند و از بین آن‏ها با توجه به ویژگی‏های ظاهری و بررسی‏های میکروسکوپ نوری سویه TA4 که مشابهت بیشتری به سویه‏های پروتیست تک سلولی دریازی خانواده ترائوستوکیتریدها داشته، برای آزمایشات بعدی انتخاب شد. اندازه سلولی این سویه بین 5 تا 20 میکرومتر بوده و در سیکل زندگی آن سلول‏های دوتایی، چهارتایی، هشت تایی و شکل‏های نامنظم آمیبی^[21] مشاهده شد. همچنین، تولید زئوسپورها در این سویه مشاهده شد که برای تکثیر غیر جنسی از آن استفاده می‏کند. رنگ کلونی‏ سویه TA4 بر روی محیط کشت جامد، نارنجی روشن و دارای سطح براق و لعابی بود. همچنین، این سویه در محیط کشت مایع به صورت کلامپ رشد کرد. ژن
18S rRNA (1780 bp) تکثیر شد (شکل 1) و توالی آن با داده‏های بانک ژنی و با استفاده از برنامه بلست[22] مقایسه شد. درخت فیلوژنتیکی با استفاده از روش Neighbor-joining و با استفاده از نرم افزار مگا4[23] ترسیم شد (شکل 2). سویه TA4 بیش از 97 درصد با سویه جنس آئورانتیوکیتریوم از خانواده ترائوستوکیتریدها مشابهت داشت. شماره دسترسی این سویه در سایت NCBI با کد KJ938302 قابل دسترسی است.

شکل 1- تصویر ژل رنگ آمیزی شده با اتیدیوم برماید برای محصول PCR با 1700 جفت باز

شکل 2- تحلیل فیلوژنتیکی سویه TA4. درخت فیلوژنتیکی با استفاده از روش Neighbor-joining و ‏با 1000 تکرار ترسیم شد.

فاصله تکاملی با استفاده از Kimura 2 parameter محاسبه شد.

شکل 3- A عکس میکروسکوپ نوری سویه TA4 و B: عکس میکروسکوپ فلورسانت از سلول‏ها.

دانه‏های ذخیره ای تری‏آسیل‏گلیسرول به شکل دانه‏هایی با فلورسانت زرد مشاهده شد.

.بررسی سویه TA4 توسط میکروسکوپ فلوروسنت: از سویه ‏TA4 که بر روی محیط کشت گلوگز، ‏عصاره مخمر، پپتون و آگار رشد کرده بود لام تهیه و توسط نایل رد رنگ آمیزی انجام شد. سپس لام میکروسکوپی توسط میکروسکوپ فلوروسنت مشاهده شد (شکل 3). رنگ نایل رد به تری آسیل گلیسرول‌های داخل سلول متصل شده و سلول‏ها در معرض نور UV به شکل سلول‌های حاوی گرانول‏های زرد و یا نارنجی فلورسانت مشاهده شد. هرچه سویه توانایی تولید تری‏آسیل‏گلیسرول‏های ذخیره‌ای بیشتری داشته باشد فلورسانت زرد بیشتری از خود ساطع می‏کند.

.بررسی رشد سلولی و تولید روغن در سویه TA4: نتایج رشد سلولی و تولید روغن در جدول 2 نشان داده شده است. سویه TA4 بعد از 48 ساعت 37/1 گرم بر لیتر بیومس تولید کرده که 6/46درصد آن را روغن تشکیل داده است. در این سویه مقدار 642/0 گرم بر لیتر روغن تولید شد.

جدول 2- مقدار بیومس، روغن تولیدی و درصد آن

.تحلیل کروماتوگرافی گازی متیل استرهای اسید‏های چرب تولید شده توسط سویه TA4: به منظور بررسی پروفایل اسید‏های چرب و تعیین نوع اسید‏های چرب تولید شده توسط سویه و تأیید نهایی تولید ترکیب ارزشمند دوکوزاهگزانوئیک اسید و همچنین، محاسبه مقدار آن و مقدار سایر اسید‏های چرب تولیدی و ترسیم پروفایل محصولات تولیدی، تحلیل کروماتوگرافی گازی متیل استر اسید‏های چرب انجام شد. ‏با توجه به بررسی دیاگرام به دست آمده از تحلیل گروماتوگرافی گازی سویه TA4 (شکل 4)؛ پیک و زمان خروج متیل استرها از دستگاه کروماتوگرافی گازی و نوع اسیدهای چرب اصلی که توسط سویه تولید شده بود، مشخص شد. پیک‏های مهم و شاخص که توسط سویه تولید شده هر کدام در زمان مشخصی از دستگاه خارج و با استاندارد متیل استر اسیدهای چرب مقایسه شدند. پیک اول مربوط به مریستیک اسید(C14:0)[24] بوده که در زمان 95/12 دقیقه از ستون خارج شد. پیک دوم و سوم مربوط به ترکیب پنتادکانوئیک اسید (C15:0)[25] و پالمیتیک اسید[26] (C16:0) هستند که به ترتیب در زمان‏های 78/13 دقیقه و 58/14 دقیقه از ستون خارج شدند. هر سه این ترکیبات از گروه اسید‏های چرب اشباع می‏باشند. پیک دوکوزاپنتانوئیک اسید DPA (C22:5 n-6)[27] از گروه اسیدهای چرب امگا6 در زمان 46/24 دقیقه از ستون خارج شد. EPA و DHA که مربوط به اسیدهای چرب مهم و با ارزش امگا3 هستند به ترتیب در زمان‏های 97/21 و 41/25 دقیقه از ستون خارج شدند.

شکل 4- پروفایل متیل استر اسیدهای چرب تولید شده

جدول 3- درصد اسیدهای چرب و مقدار آن‏ها در سویه آئورانتیوکیتریومTA4

با توجه به شکل 4 ترکیب پالمیتک اسید (C16:0) در سویه‌ آئورانتیوکیتریوم^[28] از خانواده ترائوستوکیتریدها به عنوان ترکیبی شاخص بوده و به مقدار زیاد تولید می‏شود. با در نظر گرفتن زمان جداسازی پیک اسیدهای چرب با پیک‏های اسیدهای چرب موجود در نمونه استاندارد، نوع آن اسیدهای چرب شناسایی شد. ترکیب اصلی DHA در زمان 41/25 دقیقه در ستون DB-23 جداسازی شده است. سویهTA4 قادر به تولید 32/178 میلی‏گرم در لیتر و 48/277 میلی‏گرم در گرم روغن اسید چرب غیر اشباع با چندین باند دوگانه از نوع DHA، EPA و DPA است (جدول 3 و شکل 5). این اسیدهای چرب غیراشباع با چند پیوند دوگانه 28 درصد از کل روغن تولید شده توسط سویه را به ‏خود اختصاص داده‏اند (شکل 6).