مطالعه‏ لایه‏ سطحی و پارا اسپورال ‏بادی ‏‏‏(‏‏‏MH14) ‏‏‏Bacillus thuringiensis Israelensis و پیش‏بینی پایدارسازی ‏‏‏(‏‏‏Cry4Ba) ‏‏‏با ایجاد جهش نقطه ‏ای بر اساس یافته‏ های بیوانفورماتیک

مقدمه

لایه ‏سطحی [1] ساختار کریستالی منظمی است که سطح بسیاری از باکتری‏ها و آرکئاها را به طور کامل می‏پوشاند، ‏‏‏ساختار پروتئینی دارد و بالغ بر 15 درصد کل پروتئین سلول را شامل می‏شود‏‏‏ ‏‏‏(‏‏‏1)‏‏‏. ‏‏‏توالی‏های ژن‏های لایه سطحی گویای‏‏‏ آن است که آن‏ها شباهت کمی با هم دارند مگر در S-layer homology domain ‏‏‏(‏‏‏slh) ‏‏‏که عامل اتصال این پروتئین به پپتید و گلیکان است ‏‏‏(‏‏‏2).‏‏‏ ‏‏‏

لایه ‏سطحی باسیلوس‏ها معمولا دارای ساختار P₄ یا P₂ است، ‏‏‏اگر چه لایه سطحی برخی‏‏‏ سویه‏های باسیلوس‏آنتراسیس[2]، ‏‏‏باسیلوس‏کواگولانس[3] و باسیلوس‏استئاروترموفیلوس[4] ساختار خطی یا مورب دارد ‏‏‏(‏‏‏3).‏‏‏ ‏‏‏سطح باسیلوس‏تورنجینسیس[5] دارای لایه سطحی با تقارن P₂ است که سطح خارجی آن صاف و سطح داخلی آن موج‏دار است ‏‏‏(‏‏‏4).‏‏‏ ‏‏‏وزن مولکولی لایه سطحی در باسیلوس‏ها بین 66 تا 255 KD است. ‏‏‏باسیلوس آنتراسیس دو نوع Slp ‏‏‏(‏‏‏Sap وEA1) ‏‏‏دارد که در طی رشد سنتز می‏شوند به این ترتیب که Sap قبل از EA1 سنتز می‏شود‏‏‏ ‏‏‏(‏‏‏5).‏‏‏ ‏‏‏در باسیلوس‏تورنجینسیس پروتئین لایه‏ ‏‏‏سطحی، ‏‏‏Slp A نامیده می‏شود‏‏‏‏‏‏ که بسیار به Sap شباهت دارد ‏‏‏(‏‏‏6).‏‏‏ ‏‏‏باسیلوس تورنجینسیس باکتری است که در فاز اسپور‏زایی، ‏‏‏سمی از جنس پروتئین تولید می‏کند که کشنده حشرات است، ‏‏‏مجتمع می‏شود‏‏‏‏‏‏ و پارا اسپورال‏بادی[6] تشکیل می‏دهد. ‏‏‏پارا اسپورال بادی‏ها معمولا به خاطر شکل کریستالی خود با نام Cry ‏‏‏(‏‏‏از کلمه کریستال آمده است) ‏‏‏پروتئین/توکسین[7] شناخته می‏شود ‏‏‏(‏‏‏7).‏‏‏ ‏‏‏عامل کشنده حشرات در Bacillus thuringiensis israelensisدلتا توکسین است که زمانی که میکروارگانیسم در حالت مرگ است تولید می‏شود‏‏‏‏‏‏ ‏‏‏(‏‏‏8). ‏‏‏Cry پروتئین‏ها ویژگی‏های شیمیایی بسیار خاصی دارند وزن مولکولی آن‏ها بالاست، در برابر پروتئولیز مقاوم هستند و در اسیدیته‏ قلیایی محلول می‏شوند ‏‏‏(‏‏‏9).‏‏‏ ‏‏‏Cry توکسین‏ها در سطح اسپور قرار دارند و توسط اگزوسپوریوم[8] محافظت می‏شود‏‏‏‏‏‏ ‏‏‏(‏‏‏10).‏‏‏ ‏‏‏به این انکلوژن بادی‏ها[9] کریستال‏های پروتئینی کشنده حشرات می‏گویند. ‏‏‏چهار کلاس اصلی از ژن‏های Cry و پروتئین‏های Cry بر اساس اختصاصیت میزبان و درجه تشابه توالی آمینو اسیدشان شناخته شده است: Cry I، ‏‏‏Cry II، ‏‏‏Cry III و Cry IV ‏‏‏(‏‏‏11).‏‏‏ ‏‏‏از آنجا که باسیلوس‏تورنجینسیس با تولید کریستال‏های پروتئینی خود مهم‏ترین‏‏‏ عامل زیستی کنترل آفات در سراسر جهان است ‏‏‏(‏‏‏12) ‏‏‏و از طرفی تولید کننده لایه سطحی است که لایه S با زیر واحد‏هایی در مقیاس نانو و خاصیت خود آرایه‏اش کاربرد وسیعی در نانوبیوتکنولوژی دارد ‏‏‏(‏‏‏13)، ‏‏‏‏‏‏استخراج و خالص‏سازی ‏‏‏لایه سطحی و
پارا اسپورال‏بادی و مطالعه‏ ‏‏‏ویژگی‏های آن‏ها دارای اهمیت است. ‏‏‏از آنجا که پروتئین Cry به عنوان سم کشنده حشرات استفاده می‏شود‏‏‏‏‏‏ افزایش مقاومت و پایداری آن در بیوتکنولوژی و کشاورزی با اهمیت است.

در این مطالعه، از دو سرور CUPSAT و MaStab برای پیش‏بینی افزایش پایداری پروتئین Cry4Ba بر اساس جهش نقطه‏ای در یک اسید‏آمینه این پروتئین استفاده شد. ‏‏‏[10]CUPSAT یک ابزار تحت وب برای تجزیه تحلیل و پیش‏بینی تغییرات پایدار پروتئین بر اساس جهش نقطه‏ای ‏‏‏(‏‏‏جهش تک اسید‏آمینه‏ای) ‏‏‏است. ‏‏‏این برنامه از پتانسیل محیط ساختاری اتم خاص و توان زاویه‏ ‏‏‏پیچش برای پیش‏بینی Delta Delta G، ‏‏‏تفاوت در انرژی آزاد آشکار بین پروتئین‏های وحشی و جهش‏یافته استفاده می‏کند و نیازمند ساختار پروتئین با فرمت Protein Data Bank و جایگاه اسیدآمینه‏ای که قرار است در آن جهش رخ دهد، است. ‏‏‏نتایج شامل اطلاعاتی در مورد جایگاه جهش، ‏‏‏ویژگی‏های ساختاری ‏‏‏(‏‏‏دسترسی حلال، ‏‏‏ساختار دوم و زاویه ‏‏‏چرخش) ‏‏‏و اطلاعات جامع در مورد تغییرات در ثبات پروتئین در شرایط 19 تعویض ممکن در یک جهش خاص اسید‏آمینه است و نتایج را بر اساس 1538 جهش از دناتوراسیون حرارتی و 1603 جهش از دناتورسیون شیمیایی آزمایش می‏کند. ‏‏‏در انتها چندین آزمایش اعتبار سنجی برای اطمینان از قابل اعتماد بودن و دقت کار انجام می‏دهد. بر این اساس بیش از 80 درصد دقت در پیش‏بینی را به همراه دارد ‏‏‏(‏‏‏14).‏‏‏ ‏‏‏MuStab نیز برای پیش‏بینی تغییرات پایداری پروتئین بر اساس جایگزینی اسید‏های آمینه طراحی شده‏است. ‏‏‏

در این مطالعه برای نخستین‏‏‏ بار لایه سطحی
Bacillus thuringiensis israelensis ‏‏‏(‏‏‏MH14) ‏‏‏استخراج، وزن مولکولی آن تعیین و با میکروسکوپ نوری ارزیابی شد. ‏‏‏همچنین، برای نخستین‏‏‏ بار
پارا اسپورال بادی از اسپور‏های این باکتری استخراج و با میکروسکوپ نوری بررسی شد و با ایجاد جهش نقطه‏ای در توالی پروتئین CRY4Ba با استفاده از دو سرور CUPSAT و MaStab افزایش پایداری پروتئین پیش‏بینی شد و برخی ویژگی‏های Slp و CRY4Ba از Bacillus thuringiensis israelensis ‏‏‏(‏‏‏MH14) ‏‏‏توسط سرور protparam بررسی شد. ‏‏‏

.مواد و روش‏ها

.سویه باکتری و شرایط کشت: باسیلوس‏تورنجینسیس MH14از آزمایشگاه میکروب‏شناسی دانشگاه اصفهان تهیه و در دمای30 درجه سانتی‏گراد در محیط BHIB [11]‏‏‏‏‏‏ ‏‏‏کشت داده شد. ‏‏‏سویه یاد شده پس از کشت در محیط NA به شکل اسپور در دمای منفی 4 درجه سانتی‏گراد نگهداری شد. ‏‏‏

.آماده‏سازی ‏‏‏نمونه کریستال/ اسپور برای بررسی با میکروسکوپ نوری: اسمیری از مخلوط اسپور/ باکتری/ کریستال به روی لام قرار داده شده با حرارت تثبیت و با محلول کوماسی‏بلو G250 به مدت 3 دقیقه رنگ آمیزی شد. ‏‏‏سپس با آب مقطر شسته، ‏‏‏خشک و با میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی X 100 مشاهده شد. ‏‏‏

.جداسازی و خالص‏سازی ‏‏‏پارا اسپورال‏بادی: مخلوط اسپور/ کریستال از محیط NA در 5 میلی‏لیتر آب مقطر استریل جمع‏آوری و به مدت 10 دقیقه دور rpm 10000 برای نشست اسپورها سانتریفیوژ[12] و مایع رویی حاوی کریستال‏های پروتئینی برای زدودن کامل اسپورها، 5 بار دیگر سانتریفیوژ شد. ‏‏‏در نهایت، کریستال‏های پروتئینی با سانتریفیوژ در دور rpm 19000 به مدت 30 دقیقه حاصل شدند ‏‏‏(‏‏‏15) ‏‏‏سپس، دو نمونه برای مشاهده میکروسکوپی تهیه شد: نمونه اول به طور مستقیم روی لام قرار داده، ‏‏‏لامل‏گذاری و با میکروسکوپ مشاهده شد. ‏‏‏نمونه دوم ابتدا با کوماسی‏بلو G250 رنگ آمیزی و پس از آن بامیکروسکوپ بررسی شد.

.تعیین غلظت پروتئین با معرف برد‏فورد [13]: برای تعیین غلظت پروتئین از روش برادفورد و از ‏‏‏(‏‏‏BSA) ‏‏‏Bovine serum albumin به عنوان استاندارد استفاده شد ‏‏‏(‏‏‏16).‏‏‏ ‏‏‏

.مطالعات بیوانفورماتیکی [14]: توالی و ساختارسه بعدی پروتئین CRY4Ba از بانک اطلاعات پروتئین ‏‏‏(‏‏‏PDB) ‏‏‏به‏دست آمد. با استفاده از سرور CUPSAT افزایش پایداری پروتئین با جهش نقطه‏ای تصادفی بر اساس دناتوراسیون حرارتی و دناتوراسیون شیمیایی در ASP موقعیت 451 پیش‏بینی شد. ‏‏‏جهش‏های یکسان برپایه ‏‏‏هر دو نوع دناتوراسیون انتخاب و با سرور MaStab نیز در رنجی از دما و اسیدیته‏ بررسی و بهترین جهشی که پایداری را افزایش می‏داد پیش‏بینی شد. ‏‏‏همچنین، جایگاه حفره در این پروتئین با استفاده از نرم افزار Molegro پیش‏بینی و جایگاه اتصال فلزات به این پروتئین بر اساس یافته‏های NCBI شناسایی شد. ‏‏‏توالی پروتئین Slp از Bacillus thuringiensis israelensis از NCBI و توالی پروتئین CRY4Ba از بانک اطلاعات پروتئین ‏‏‏(‏‏‏PDB) ‏‏‏به دست آمد و با استفاده از سرور protparam برخی ویژگی‏های آن‏ها بررسی شد.

.جداسازی لایه سطحی‏‏‏‏: هنگامی که جذب نوری سوسپانسیون حاوی باکتری در طول موج 600 نانومتر به 9/0 رسید سلول‏ها سانتریفیوژ¹¹ و دو بار توسط آب دو بار تقطیر شسته شدند و تحت تیمار 5 مولار گوانیدین هیدروکلراید به مدت 60 دقیقه در دمای اتاق قرار گرفتند. ‏‏‏سپس به مدت 10 دقیقه با دور rpm 10000 سانتریفیوژ ‏‏‏(‏‏‏15) ‏‏‏و مایع‏رویی که حاوی پروتئین لایه سطحی است علیه 10میلی‏مولار CaCl₂ دیالیز[15] شد ‏‏‏(‏‏‏17).

.تحلیل‏‏‏ پروتئین لایه ‏‏‏سطحی توسط SDS page: برای انجام این تحلیل‏‏‏ 10 میکرو‏لیتر نمونه پروتئین با 10 میکرو‏لیتر بافر نمونه مخلوط شده و به مدت 10 دقیقه در 100 درجه سانتی‏گراد جوشانده شد. آنگاه روی ژل پلی آکریل آمید 10 درصد جریان یافت؛ ‏‏‏سپس، ژل با کوماسی‏بلو G250 رنگ آمیزی و برای حذف رنگ‏های اضافی رنگ بری شد. ‏‏‏

.بررسی میکروسکوپی لایه ‏سطحی باسیلوس‏تورنجینسیس MH14: برای بررسی ریخت شناسی لایه سطحی مقداری از لایه سطحی خالص بر روی لام قرار گرفت. پس از خشک شدن در دمای اتاق ساختار آن توسط میکروسکوپ نوری مشاهده شد. ‏‏‏

.نتایج

با توجه به این‏که باسیلوس‏تورنجینسیس می‏تواند سم ضد حشرات تولید کند، ‏‏‏غربال‏گری سویه‏های تولیدکننده ‏‏‏کریستال پارااسپوررال‏بادی و مطالعه ‏‏‏ساختار آن‏ها از اهمیت خاصی برخوردار است. ‏‏‏برای بررسی اطلاعات بیشتر در مورد Cry toxin با استفاده از سرورهای موجود اطلاعاتی در مورد این سم حاصل شد. ‏‏‏در این پژوهش‏‏‏ ساختار و ویژگی‏های سم Cry4Ba از Bacillus Thuringiensis Israelensis با یافته‏های بیوانفورماتیکی بررسی شد‏ه است. ‏‏‏بر اساس اطلاعات به‏دست آمده از NCBI دلتا اندو توکسین سم حشره‏کش است که در طی اسپور‏زایی تولید می‏شود‏‏‏. ‏‏‏اندوتوکسین تولید شده به اپیتلیوم روده متصل می‏شود‏‏‏ و با لیز‏ سلول‏ها به مرگ منجر می‏شود‏‏‏. ‏‏‏همان گونه که در شکل 1 نشان داده شده، ‏‏‏دلتا اندوتوکسین فعال شامل سه دومین[16] ساختاری است: دومین N انتهایی یا هلیکال یا دومین I، ‏‏‏که در قرار گرفتن سم در غشا و ایجاد سوراخ نقش دارد؛ در حالی که دومین شماره II و III در اتصال به گیرنده نقش دارند. ‏‏‏دومین شماره III یا دومین C انتهایی از لحاظ ساختاری به دومین متصل شونده به کربوهیدرات 6 ‏‏‏(‏‏‏CBM6) ‏‏‏شباهت دارد و امکان دارد که حشره به طور اختصاصی از واکنش پروتئین- پروتئین و یا پروتئین-کربوهیدرات توسط دومین شماره II و III تشخیص داده شود. ‏‏‏

شکل 1- موقعیت قرارگیری سه دومین پروتئین CRY4Ba بر اساس اطلاعات به‏دست آمده از NCBI. ‏‏‏‏‏‏

اندوتوکسین تولید شده به اپیتلیوم روده حشرات متصل می‏شود‏‏‏ و با لیز‏ سلول‏ها به مرگ منجر می‏شود. ‏‏‏

از آنجاکه یافتن جایگاه اتصال به فلزات و مناطق حفاظت شده دارای اهمیت هستند و از طرفی ایجاد موتاسیون در این مناطق مطلوب نیست بنابراین، ‏‏‏به کمک پایگاه اطلاعات NCBI جایگاه این مناطق مشخص شد. ‏‏‏جایگاه اتصال به فلزات در همه ‏‏‏Cry toxin‏ها شامل: سه اسید آمینه بسیار حفاظت شده ‏‏‏پرولین، ‏‏‏والین و آسپارتیک اسید است. ‏‏‏این سه اسید‏آمینه جایگاه اتصال به فلزات هستند و می‏توانند به Ca²⁺ و Na⁺ متصل شوند. ‏‏‏

در مقایسه دومین شماره سه Cry4Ba با نه توالی مشابه ‏‏‏(‏‏‏پروتئین‏های کریستالی کشنده حشرات، ‏‏‏هیپوتتیکال پروتئین و دلتا اندو توکسین) ‏‏‏مشخص شد که سه اسید‏آمینه حفاظت شده که در جایگاه‏های مشخصی از پروتئین قرار دارند و جایگاه اتصال به فلزات هستند‍‍ در تمامی این نه توالی در سویه‏های مختلف باسیلوس تورنجینسیس بسیار حفاظت شده هستند. ‏‏‏به‏علاوه توالی همه‏ دلتا‏ اندوتوکسین‏ها شباهت بالایی به یکدیگر دارند. ‏‏‏

در این پژوهش‏‏‏ پارا اسپورال‏بادی باسیلوس‏تورنجینسیس MH14برای بررسی بیشتر و تعیین شکل کریستال‏های آن با روش ساده رنگ آمیزی کوماسی بلو G250 بررسی شد. ‏‏‏

در مشاهدات میکروسکوپ نوری از لام تهیه شده از کریستال/ اسپور/ باکتری رنگ‏آمیزی شده با کوماسی‏بلوG250 مطابق شکل 2 کریستال‏های آزاد شده از اسپورها قابل تشخیص است. ‏‏‏آبی رنگ بودن کریستال‏ها تایید کننده ‏‏‏ساختار پروتئینی آن‏هاست. ساختار لوزی شکل آن‏ها نشان‏دهنده آن است که
پارا اسپورال بادی این سویه به ‏شکل کریستال‏های لوزی شکل است. ‏‏‏اسپور‏ها سفید رنگ و بیضی شکل هستند و سلول‏های رویشی به شکل باسیل‏های آبی دیده می‏شوند، ‏‏‏کریستال/ اسپور‏ها هم به شکل اجسام سفید رنگ در سلول‏های آبی قابل مشاهده هستند که در واقع پارا اسپورال‏بادی‏های ترشح شده از اسپور، ‏‏‏اسپور را در برگرفته است که هم نشان‏دهنده آزاد شدن این کریستال‏های پروتئینی از اسپور است و هم نشان‏دهنده ‏‏‏تولید بالای این کریستال‏ها از اسپور است به شکلی که اطراف اسپور سازنده‏اش را در برگرفته‏است ‏‏‏(‏‏‏شکل 2).‏‏‏

‏‏‏

شکل 2- تصویر میکروسکوپ نوری از لام تهیه شده از کشت کهنه‏ باسیلوس‏تورنجینسیس MH14. ‏‏‏کریستال‏های آزاد شده از اسپورها قابل تشخیص است، ‏‏‏آبی رنگ بودن کریستال‏ها تایید کننده ‏‏‏ساختار پروتئینی آن‏هاست. ساختار لوزی شکل آن‏ها نشان‏دهنده آن است که پارا اسپورال بادی این سویه به‏ شکل کریستال‏های لوزی شکل است. ‏‏‏اسپور‏ها سفید رنگ و بیضی شکل هستند. سلول‏های رویشی به شکل باسیل‏های آبی دیده می‏شوند. ‏‏‏کریستال/ اسپور‏ها هم به شکل اجسام سفید رنگ در سلول‏های آبی قابل مشاهده هستند. ‏‏‏بار نشان دهنده 1000 نانومتر است. ‏‏‏

سپس نمونه‏خالص از پارا اسپورال‏بادی تهیه‏شد به این شکل که مخلوط اسپور/ کریستال از محیط NA در آب مقطر استریل جمع آوری و با دور rpm 10000 برای نشست اسپورها سانتریفیوژ و مایع رویی حاوی کریستال‏های پروتئینی برای زدودن کامل اسپورها 5 بار دیگر سانتریفیوژ شد. ‏‏‏در نهایت، کریستال‏های پروتئینی با سانتریفیوژ در دور rpm 19000 به مدت 30 دقیقه حاصل شد. ‏‏‏از پارا اسپورال‏بادی‏ها‏ی جداسازی شده دو لام تهیه‏شد یکی بدون رنگ‏آمیزی و یکی رنگ شده با کوماسی‏بلو G250، ‏‏‏همان گونه که در شکل 3 نشان داده شده، ‏‏‏نمونه خالص پارا اسپورال بادی رنگ آمیزی نشده به شکل کریستال‏های درشت چند وجهی ‏‏‏(‏‏‏شکل 3-الف) ‏‏‏و نمونه رنگ آمیزی شده با کوماسی بلو G250 به شکل کریستال‏های آبی رنگ مشاهده می‏شود‏‏‏ که تایید کننده جنس پروتئینی آن‏هاست ‏‏‏(‏‏‏شکل3- ب).‏‏‏ ‏‏‏در شکل 3 کریستا‏ل‏های درشت پارا اسپورال بادی مشاهده می‏شود‏‏‏ اما همان‏گونه که در شکل 2 نشان‏داده‏شده این کریستال‏ها هنگامی که از اسپور رها می‏شوند به شکل کریستال‏های کوچک لوزی شکل هستند اما پس از خالص شدن به شکل کریستال‏های درشت مجتمع شده‏اند که نشان‏دهنده ‏‏‏تمایل این کریستال‏ها برای مجتمع‏شدن پس از رهایی از اسپور است. ‏‏‏شایان ذکر است که پس از استخراج پارا اسپورال بادی میزان پروتئین نمونه با معرف برادفورد انداره‏گیری شد که بر اساس منحنی استاندارد میزان پروتئین 29 میکروگرم در 1 میلی‏لیتر بوده است. ‏‏‏

این تصویر نشان دهنده تجمع کریستال‏های پروتئینی و تشکیل کریستال درشت پارا اسپورال بادی است. ‏‏‏بزرگ نمایی X40. ‏‏‏

برای پیش‏بینی جایگاه حفره ساختار سه بعدی پروتئین Cry4Ba از بانک اطلاعات پروتئین ‏‏‏(‏‏‏PDB) ‏‏‏با PDB ID: 1W99 گرفته شد و با نرم افزار Molegro جایگاه حفره‏هایش پیش‏بینی شد. ‏‏‏هر زیر واحد این پروتئین 11 حفره دارد در حالی که مجموع این سه زیر واحد در کنار هم حاوی 59 حفره است. ‏‏‏جایگاه اتصال به فلزات که شامل سه اسید آمینه ‏‏‏حفاظت‏شده ‏‏‏آسپارتیک‏اسید موقعیت 626، ‏‏‏پرولین موقعیت 484 و والین موقعیت 486 است با استفاده از نرم افزار Molegro در ساختار سه بعدی پروتئین Cry4Ba تعیین و مشخص شد که جایگاه حفاظت شده اتصال فلزات در ناحیه حفره‏های پروتئین قرار ندارند. ‏‏‏

از آنجا که Cry4Ba یک سم کشنده حشرات است افزایش مقاومت این پروتئن مطلوب است. بر این اساس کوشش شد که افزایش پایداری این پروتئین بر اساس جهش نقطه‏ای در یک اسید‏آمینه آن پیش‏بینی شود. ‏‏‏برای این کار از دو سرور CUPSAT و MuStab استفاده شد. ‏‏‏CUPSAT یک ابزار تحت وب برای پیش‏بینی تغییرات پایدار پروتئین بر اساس جهش نقطه‏ای ‏‏‏(‏‏‏جهش تک اسید‏آمینه‏ای) ‏‏‏است. ‏‏‏این برنامه از پتانسیل محیط ساختاری اتم خاص و توان زاویه ‏‏‏پیچش برای پیش‏بینی Delta Delta G، ‏‏‏تفاوت در انرژی آزاد آشکار بین پروتئین‏های وحشی و جهش‏یافته استفاده می‏کند و نیازمند ساختار پروتئین با فرمت Protein Data Bank و جایگاه اسیدآمینه‏ای که قرار است در آن جهش رخ دهد می‏باشد. ‏‏‏نتایج شامل: اطلاعاتی در مورد جایگاه جهش، ‏‏‏ویژگی‏های ساختاری ‏‏‏(‏‏‏دسترسی حلال، ‏‏‏ساختار دوم و زاویه ‏‏‏چرخش) ‏‏‏و اطلاعات جامع در مورد تغییرات در ثبات پروتئین در شرایط 19 تعویض ممکن در یک جهش خاص اسید‏آمینه است و نتایج را بر اساس 1538 جهش از دناتوراسیون حرارتی و 1603 جهش از دناتورسیون شیمیایی آزمایش می‏کند. ‏‏‏در انتها چندین آزمایش اعتبار سنجی برای اطمینان از قابل اعتماد بودن و دقت کار انجام می‏دهد. بر این اساس بیش از 80 درصد دقت در پیش‏بینی را به همراه دارد ‏‏‏(‏‏‏14) ‏‏‏و MuStab نیز برای پیش‏بینی تغییرات پایداری پروتئین بر اساس جایگزینی اسید‏های آمینه طراحی شده‏است. ‏‏‏

توالی و ساختارسه بعدی پروتئین CRY4Ba از بانک اطلاعات پروتئین ‏‏‏(‏‏‏PDB) ‏‏‏به‏دست آمد. با استفاده از سرور CUPSAT افزایش پایداری پروتئین با جهش نقطه‏ای تصادفی بر اساس دناتوراسیون حرارتی و دناتوراسیون شیمیایی در ASP موقعیت 451 پیش‏بینی شد. ‏‏‏جدول‏های 1 و 2 نشان‏دهنده نتایج پیش‏بینی پایداری Cry4Ba با جهش نقطه‏ای بر اساس دناتوراسیون حرارتی و شیمیایی با استفاده از سرور CUPSAT در آسپارتیک‏اسید موقعیت 451 هستند. ‏‏‏از بین جهش‏های ایجاد شده جهش‏هایی که در هر دو مورد پایدار و دارای پیچش مطلوب و شامل: جایگزینی آسپارتیک‏اسید موقعیت 451 با اسیدهای‏آمینه ‏‏‏LEU, ILE, MET, TRP, THR, PHE, TYR و HIS بودند انتخاب و با سرور Mustab در رنجی از شرایط اسیدیته‏ و دما بررسی شدند. جایگزینی همه ‏‏‏اسید‏های ‏آمینه به ‏جز IEU موجب کاهش پایداری می‏شدند. شرایط در دو دمای 37 و 25 درجه سانتی‏گراد و اسیدیته‏ 1 تا 8 بررسی شد. نتایج این پیش‏بینی برای جایگزینیASP موقعیت 451 با IEU در جدول 3 بیان شده‏است. ‏‏‏بر اساس نتایج سرور Mustab پیش‏بینی شد که ممکن است از بین این جهش‏ها جایگزینیASP موقعیت 451 با IEU در شرایط اسیدیته 5‏ و دمای 37 درجه سانتی‏گراد، همچنین، اسیدیته‏ 4 و دمای 37 درجه سانتی‏گراد با بیشترین ضریب‏‏‏ ‏اطمینان ‏‏‏(‏‏‏93/23 درصد)، ‏‏‏و پس از آن در شرایط اسیدیته‏ 6 و دمای 37 درجه سانتی‏گراد، همچنین، اسیدیته‏ 3 و دمای 37 درجه سانتی‏گراد با ضریب‏‏‏ ‏اطمینان 57/23 درصد موجب افزایش پایداری و مقاوت این سم ‏شود‏‏‏. ‏‏‏همان‏گونه که در جدول 3 مشاهده‏ می‏شود‏‏‏ جایگزینیASP موقعیت 451 با IEU در شرایط اسیدیته‏ قلیایی در هر دو دمای 25 و 37 درجه سانتی‏گراد موجب کاهش پایداری Cry4Ba می‏شود.‏‏‏ همچنین، شرایط اسیدیته‏ 1 و دمای 25 درجه سانتی‏گراد نیز باعث کاهش پایداری می‏شود‏‏‏.

جدول 1- نتایج سرور CUPSAT از ایجاد جهش نقطه ای بر اساس دناتوراسیون حرارتی در آسپارتیک‏اسید موقعیت451. ‏‏‏پیش‏بینی می‏شود‏‏‏ که جایگزینی آسپارتیک‏اسید موقعیت451 با اسید‏های‏آمینه والین، ‏‏‏لوسین، ‏‏‏ایزولوسین، ‏‏‏متیونین، ‏‏‏تریپتوفان، ‏‏‏ترئونین، ‏‏‏فنیل‏آلانین، ‏‏‏تیروزین و هیستیدین دارای پیچش مطلوب و ساختار پایدار است. ‏‏‏

جدول 2- نتایج سرور CUPSAT از ایجاد جهش نقطه ای بر اساس دناتوراسیون شیمیایی در آسپارتیک‏اسید موقعیت451. ‏‏‏پیش‏بینی می‏شود‏‏‏ که جایگزینی آسپارتیک‏اسید موقعیت451 با اسید‏های‏آمینه لوسین، ‏‏‏ایزولوسین، ‏‏‏متیونین، ‏‏‏تریپتوفان، ‏‏‏ترئونین، ‏‏‏فنیل‏آلانین، ‏‏‏تیروزین و هیستیدین دارای پیچش مطلوب و ساختار پایدار است. ‏‏‏

جدول 3- نتایج پیش‏بینی جایگزینیASP موقعیت 451 با IEU در دو دمای 37 درجه سانتی‏گراد و 25 درجه سانتی‏گراد و اسیدیته‏ 1 تا 8 با استفاده از سرور Mustab. ‏‏‏نتایج نشان دهنده ‏‏‏آن است که جایگزینیASP موقعیت 451 با IEU در شرایط اسیدیته‏ 5 و دمای 37 درجه سانتی‏گراد، همچنین اسیدیته‏ 4 و دمای 37 درجه سانتی‏گراد با ضریب‏‏‏ ‏اطمینان 93/23 درصد؛ و پس از آن در شرایط اسیدیته‏ 6 و دمای 37 درجه سانتی‏گراد، همچنین اسیدیته‏ 3 و دمای 37 درجه سانتی‏گراد با ضریب‏‏‏ ‏اطمینان 57/23 درصد موجب افزایش پایداری و مقاوت این سم می‏شود‏‏‏. ‏‏‏همچنین، این جایگزینی در شرایط اسیدیته‏ قلیایی در هر دو دمای 25 و 37 درجه سانتی‏گراد و اسیدیته‏ 1 و دمای 25 درجه سانتی‏گراد نیز باعث کاهش پایداری Cry4Ba می‏شود‏‏‏. ‏‏‏

از سوی دیگر باسیلوس تورنجینسیس در فاز رشد لگاریتمی، پروتئین سطحی تولید می‏کند. ‏‏‏برای مطالعه بیشتر، ‏‏‏این لایه توسط نمک گوانیدین هیدروکلراید استخراج شد. نتایج SDS page نشان دهنده حضور چند لایه پروتئینی بر روی ژل پلی آکریل آمید بود و یک باند قوی KD100 مشاهده شد ‏‏‏(‏‏‏شکل 4).‏‏‏ ‏‏‏

باسیلوس‏تورنجینسیس MH14: مشاهده باند kD100

 برای مقایسه آرایش پارا اسپورال بادی با پروتئین لایه‏سطحی تصویر میکروسکوپ نوری از لایه‏سطحی تهیه شد. ‏‏‏همان‏طور که در شکل 5 نشان داده شده، تصویر میکروسکوپی لایه‏سطحی خالص نشان دهنده حضور کریستال‏های درشت و صفحات گسترده از پروتئین لایه سطحی است که منومرهای آن که به شکل خود آرایه به یکدیگر اتصال یافته و آرایش منظمی پیدا کرده‏اند. ‏‏‏سایز برخی از این صفحات کریستالی به بیش از 2 میکرومتر می‏رسد. ‏‏‏البته برای کریستاله کردن لایه S معمولا از سطوحی مانند میکا، لیپوزوم و سیلیکون استفاده می‏شود. مطالعات نشان می‏دهد که خودآرایه لایه S باسیلوس‏ها به روی سطوح هیدروفوب بهتر است. در پژوهشی که بر روی لایه S کالوباکتر انجام شد، شبکه کریستاله منظم در نمونه‏هایی که به روی سیلیکون هیدروفوب کریستاله شده بودند یافت شد (18).

برای آنکه پروتئین Slp که در فاز لگاریتمی رشد تولید می‏شود‏‏‏ را با پروتئین Cry4Ba مقایسه کنیم، ‏‏‏توالی آن‏ها را که از NCBI به‏دست آمده بود با سرور protparam بررسی کرده، برخی ویژگی‏های آن‏ها را با یکدیگر مقایسه کردیم. ‏‏‏مطابق جدول 4 اطلاعات به‏دست آمده از سرور protparam گویای‏‏‏ آن است که Slp از Bacillus thuringiensis israelensis فاقد اسیدآمینه سیستئین است و درصد حضور اسیدهای آمینه ‏‏‏تریپتوفان، ‏‏‏متیونین و هیستیدین بسیار پایین است. ‏‏‏همچنین، اسیدهای آمینه ‏‏‏تریپتوفان، ‏‏‏متیونین، ‏‏‏هیستیدین و سیستئین کم‏ترین درصد حضور را میان اسید‏های آمینه پروتئین Cry4Ba دارند.

شکل 5- ساختار صفحات کریستالی پروتئین لایه سطحی باسیلوس‏تورنجینسیس MH14با بزرگ‏نمایی X 100 ‏‏‏(‏‏‏الف) ‏‏‏و X 40 ‏‏‏(‏‏‏ب).‏‏‏ ‏‏‏علامت بار نشان دهنده 1000 نانومتراست. ‏‏‏

جدول 4- درصد حضور برخی اسیدهای آمینه در پروتئینSlp و Cry4Ba از Bacillus thuringiensis israelensis بر اساس اطلاعات به‏دست آمده از prot param. ‏‏‏اسیدهای آمینه ‏‏‏تریپتوفان، ‏‏‏متیونین، ‏‏‏هیستیدین و سیستئین کم‏ترین درصد حضور را میان اسیدهای آمینه در هر دو پروتئین دارند. ‏‏‏