تثبیت باسیلوس در بید‏های آلژینات کلسیم برای حذف فلز نیکل

مقدمه

فلزات سنگین سمی بیشتر در اثر فعالیت‏های صنعتی باعث آلودگی محیط زیست می‏شوند، هر چند که منابعی مانند پساب‏های کشاورزی نیز در این امر نقش دارند. این آلاینده‏ها وارد زیستگاه‏های آبی و خاکی شده و در محل ورود به محیط، تراکم‏های خیلی بالایی از آن‏ها دیده می‏شود. پساب‏های آلوده به مواد سمی و فلزات سنگین از قبیل کادمیوم، سزیم، نیکل و غیره حتی در حد مجاز، وقتی وارد محیط زیست شوند می‏توانند تحت تأثیر عوامل مختلف فیزیکی، شیمیایی و میکروبی متراکم شده و آب‏های سطحی و زیرزمینی را آلوده و آثار جبران ناپذیری بر محیط زیست وارد کنند (1 و 2). از این رو ضرورت مطالعه راه‏های رفع آلودگی آلاینده‏های پیچیده آب، خاک و هوا احساس می‏شود. در دهه‏های اخیر، پژوهش‏های گسترده‏ای روی اتصال فلزات توسط باکتری‏ها، مخمرها، قارچ‏ها ‏و جلبک‏ها ‏انجام شده‏ و فرآیندهای حذف، تثبیت و سم‏زدایی بیشتر فلزات سنگین از محیط‏های طبیعی با فعالیت میکروارگانیسم‏ها انجام می‏شود (3 و 4). باکتری‏ها واجد سیستم‏هایی برای جذب و سازگارشدن با غلظت‏های بالای فلزات در محیط هستند، در واقع خواص آنیونی سطح باکتری‏ها شبیه یک اسفنج عمل می‏کند و قادر به جذب یون‏های فلزی به خود است. بنابراین، از آنجا که اکثر فلزات سنگین سمی بوده و ورود آن‏ها از پساب‏های صنعتی به محیط زیست، به آلودگی محیط منجر می‏شود، دستیابی به روش مناسب برای حذف و بازیافت این فلزات امری ضروری است. نخستین کاتالیزورهای زیستی مورد استفاده در روش‏های صنعتی سلول‏های دست نخورده و سپس، آنزیم‏های محلول بودند، پس از آن از آنزیم‏های تثبیت شده و در نهایت، از سلول‏های تثبیت شده استفاده شد (5). تثبیت سلولی امروزه در صنعت جای خود را باز کرده است. سلول‏های تثبیت شده سلول‏هایی هستند که با حفظ فعالیت کاتالیتیکی و امکان حفظ حیات، به طور فیزیکی محدود و یا در یک ناحیه تعریف شده مشخص از فضا مستقر شده‌‏اند و می‌توانند به طور پیوسته استفاده شوند. از رایج‏ترین روش‏های تثبیت سلولی که امروزه برای استفاده مجدد از میکروارگانیسم‏ها و محفوظ نگهداشتن آن‏ها از تغییرات مستقیم عوامل فیزیکی و شیمیایی محیط به کار می‏رود، روش تثبیت سلولی به نام به‏دام انداختن است. در این روش، سلول‏ها در فضای داخل یک شبکه پلیمری محصور و در فضای بین خلل و فرج شبکه پلیمری قرار می‏گیرند، در نتیجه تغییرات فیزیولوژیکی خاصی انجام نگرفته و فعالیت سلول‏ها و آنزیم‏ها تغییر نمی‌کند (6- 8). از انواع حامل‏هایی که در تثبیت سلول و آنزیم استفاده می‏شود‏ می‏توان به حامل‏های زیر اشاره کرد: آگار و آگاروز، کیتوزان، صمغ ژلان، پلی وینیل الکل، سلولز و آلژینات. در این پژوهش، از آلژینات در تثبیت سلول استفاده شد که در ساختار آن سه نوع پلیمر مختلف وجود دارد که عبارتند از:

1-    فقط واجد واحدهای مانورونیک اسید (MM)،
2- فقط واجد واحدهای گلوکورونیک اسید (GG)،
3- به طور متناوب واجد هر دو اسید گلوکورونیک و مانورونیک (MG).

یکی از روش‏های محصورکردن سلول در آلژینات روش قطرک است. دراین روش محلول 2 تا 3 درصد آلژینات سدیم پیش از افزودن سوسپانسیون سلولی به وسیله‌ فیلترکردن سترون می‌شود. ریزدانه‌های ژلی با انداختن سوسپانسیون سلولی/ پلیمر از خلال سرنگ به طور آزادانه به داخل محلول سفت کننده 15 تا 20درصد کلسیم کلرید ایجاد می‌شود (9- 11). فاصله سرسوزن تا محلول سفت کننده حدود 20 سانتی‌متر است. در فرآیند تثبیت از بیو- رآکتورها نیز استفاده می‏شود. بیو- رآکتورها یا رآکتورهای زیستی دستگاه‏هایی هستند که می‏توانند محیطی را که از نظر زیستی فعال است در شرایط آزمایشگاهی به وجود آورند. در این محیط‏ها از نقش کاتالیتیکی ویژه آنزیم‏ها ‏و اندامک‏های سلول یا خود سلول‏ها در تبدیل و تولید مواد بهره‏گیری می‏شود. این رآکتورها انواع مختلفی دارند: 1- رآکتور مخزنی همزن‌دار (رآکتور مخزنی پیوسته در حال به هم خوردن):  محتویات درون این رآکتور پیوسته توسط پره‌های همزنی که بر روی یک محور در حال چرخش است به هم می‌خورد و باعث مخلوط کردن کامل آن‏ها می‌شود. 2- رآکتور بستر سیال: ستونی که در آن ذرات بیوکاتالیت توسط جریان پیوسته از سر بستر در حال شناور معلق نگه داشته‌ می‌شود (12). 3- رآکتور بستر فشرده: رآکتور بستر فشرده با آکنده ذرات بیوکاتالیت در داخل ستون ریخته می‌شود و محلول سوبسترا از آن عبور داده می‌شود. 4- رآکتور هوا خواسته: این رآکتور حباب‌های گاز مایع را حمل می‌کند که به کاهش چگالی مایع منجر می‌شود‏.

هدف از این پژوهش، پی بردن به توانایی گونه باکتری باسیلوس برای جذب فلز نیکل به شکل تثبیت شده در روی آلژینات کلسیم و بهینه‏سازی شرایط جذب است.

.مواد و روش‏ها

برای انجام آزمایش‏های جذب فلز نیکل توسط باسیلوس میله‏ای شکل، گرم مثبت و اسپوردار از مواد و محیط کشت‏های زیر استفاده شد.

میکروارگانیسم‏ها:  تمام آزمایش‌ها بر روی گونه‏ باکتری میله‌ای شکل گرم مثبت اسپوردار Bacillus Sp Strain MGL75 جدا شده از پساب کارخانه ذوب فلزات جنوب شهر تهران انجام شد (13). باکتری بر روی آلژینات کلسیم تثبیت شده مطالعه شد.

مواد و محیط‏های کشت: در انجام این پژوهش از آلژینات سدیم شرکت بی دی اچ انگلیس[i]، و محیط کشت معدنی[ii] استفاده شد. همچنین، نیکل به شکل محلول نمکی کلرید نیکل شش آبه[iii] استفاده شد.

اندازه گیری فلز نیکل:  برای اندازه گیری و تحلیل فلز نیکل قبل و بعد از هر آزمایش از دستگاه جذب اتمی[iv] استفاده شد.

.بررسی میزان جذب فلز نیکل توسط باکتری باسیلوس:  باکتری باسیلوس در محیط نمکی معدنی[v] گلوکز تلقیح، در شیکر با دور 150 دور در دقیقه به مدت 72 ساعت گرمخانه‏گذاری شد. بیومس باکتری یاد شده با سانتریفیوژ [vi] 10000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه، جدا شده و یک گرم وزن تر باکتری یاد شده با 50 میلی‏لیتر محلول فلزی حاوی نیکل کلرید 200 میلی‏گرم بر لیتر به مدت 2 ساعت در دمای بین 25 تا 30 درجه سانتی‏گراد در شیکر با دور 100 دور در دقیقه مجاورت داده شد. پس از گذشت این مدت نمونه در 10000 دور در دقیقه به مدت 15دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس، بیومس رسوب شده، پس از شستشو با آب مقطر استریل بدون یون، 2 بار تقطیر شده در دمای 100 درجه سانتی‌گراد فر، به مدت یک شب خشک شد. پس از هیدرولیز اسیدی، محلول رویی بیومس هضم شده بعد از تهیه رقت‌های مناسب با استفاده از دستگاه جذب اتمی تحلیل شد (13).

.تثبیت سلو‌های باکتریایی بر روی آلژینات کلسیم: مطابق شکل 1 رآکتوری تهیه شد و با استفاده از آن تولید ریزدانه‏های آلژینات کلسیم حاوی باکتری انجام شد. این رآکتور با اندازه طول و عرض مشخص و کناره‏های خاص خود به گونه‌ای طراحی شده که ریزدانه‏های تولیدی به بهترین و ایده‌آل‏ترین شرایط مهیا شود‏. طراحی اولیه بیورآکتور به‏وسیله دکتر مفیدی و همکاران در مرکز پژوهش‏های بیوشیمی و بیوفیزیک دانشگاه تهران انجام شد. در ابتدای کار، از محلول آلژینات سدیم جامد شرکت ب د اچ انگلستان، محلول ژله‌ای آلژینات سدیم 3 درصد تهیه شد. پژوهشگران نشان داده‌اند که اگر به میزان 4/1 حجم آلژینات سدیم، بوتانول[vii] به آن اضافه شود‏ در حلالیت و تهیه آلژینات سدیم 3 درصد نقش مناسبی خواهد داشت. به این آلژینات، سوسپانسیون میکروبی حاوی 10¹⁰*2 سلول باکتری بر میلی‏لیتر اضافه شد و به طور اختصاصی با استفاده از سرنگ 2 میلی‏لیتری از فاصله 20 سانتی‌متر به داخل رآکتور حاوی 15میلی‏لیتر آب مقطر و2 گرم کلرید کلسیم[viii] که واجد مگنت برای مخلوط کردن آن می‌باشد، چکانده شد. انتخاب سرنگ 2 میلی‏لیتری برای تولید بید‏های آلژینات در مناسب‏ترین حالت است‏. با ورود آلژینات حاوی باکتری به داخل محلول کلرید کلسیم یک تبادل یونی انجام می‏شود، که در نهایت، آلژینات کلسیم حاوی باکتری را خواهیم داشت. مهره‏ها بعد از 2ساعت، جدا و چندین بار با آب مقطر استریل شستشو داده شد. بار دیگر این مراحل تکرار، با این تفاوت که به آن سوسپانسیون باکتری باسیلوس اضافه نشد‏. تعداد 200 تا 250 عدد از بیدها یا مهره‏ها در دکآنتور 100 میلی‏لیتر حاوی فلز قرار داده شد. مشابه همین به شاهد فاقد باکتری اضافه شد. این سلول‏های تثبیت شده در آلژینات با سلول‏های باکتریایی نرمال و از طرفی با شاهد فاقد باکتری مقایسه شد. همه آزمایش‏ها در شرایط کاملاً یکسان انجام شد. بنابراین، تمام شرایط یکسان خواهد بود و تنها متغیری که وجود دارد این است که از یک طرف که ما ریزدانه‏های حاوی باسیلوس تثبیت شده را داریم، از طرف دیگر مهره‏های حاوی آلژینات کلسیم فاقد باکتری به عنوان شاهد را خواهیم داشت. همچنین، برای برطرف کردن و حل مشکل به محلول زیرین به میزان 15 میلی‏لیتر اتانول و 1 میلی‏لیتر اسیداستیک اضافه شد‏.

شکل 1- بیورآکتور طراحی شده برای تولید ریز دانه‏های آلژینات کلیسم حاوی باکتری (14)

.بررسی میزان جذب فلز نیکل در باکتری باسیلوس تثبیت شده در آلژینات کلسیم: میزان 10 میلی‏لیتر آلژینات سدیم به علاوه 1 میلی‏لیتر سوسپانسیون باکتری از ارتفاع20 سانتی‌متری در داخل محلول کلرور کلسیم وارد شد. از دکآنتور 100 میلی‏لیتر واجد شیر تخلیه استفاده شد. مشابه چنین آزمایشی برای آلژینات کلسیم بدون سلول انجام گرفت. همه آزمایش‌های یاد شده در شرایط یکسان اسیدیته انجام شد. از محلول فلزی حاوی 50 میلی‏لیتر کلرید نیکل 200 میلی‏گرم بر لیتر که روی اسیدیته حدود 7 تنظیم شد بود و از سرنگ 2 میلی‏لیتر نیز استفاده شد. مدت زمان انکوباسیون مورد استفاده 16ساعت بود که پس از این مدت نمونه‌های محلول رویی از شیر پایینی خارج و برای بررسی میزان نیکل آن توسط دستگاه جذب اتمی اندازه‌گیری شد (14).

.بررسی اثر زمان تماس برای جذب نیکل توسط باسیلوس تثبیت شده در آلژینات کلسیم: بر اساس روش‌های قبلی باکتری تثبیت شده در آلژینات کلسیم، بدون سلول وارد دکآنتور 100 میلی‏لیتری و دکآنتور 50 میلی‏لیتر محلول فلزی نیکل 200 میلی‏گرم بر لیتر شد. پس از گذشت مدت زمان 8، 16، 24 و 72 ساعت، محلول رویی از دکآنتور جدا شد و برای بررسی میزان فلز نیکل در آن با استفاده از دستگاه جذب اتمی تحلیل شد.

.بررسی تاثیر قطر ریز دانه‏ها ‏بر میزان جذب فلز نیکل به‏وسیله باسیلوس تثبیت شده در آلژینات کلسیم: از نکات قابل توجه در این آزمایش، اندازه و تعداد مهره‏های تشکیل شده در دکآنتورهای محلول فلزی نیکل است. اگر چه اطلاعات کمی در مورد انتشار مولکولی و اندازه‌ خلل و فرج پلیمر آلژینات کلسیم وجود دارد، ولی عبور مولکول‏های کوچکی مانند اتانول و گلوکز در آن اثبات شده است و همچنین در عبور مولکول‌های بزرگ مثل پروتئین‌ها اشکال ایجاد می‌شود. در این مرحله توسط سرنگ‌های 2، 5 و 10 میلی‏لیتری، قطرهای متفاوت از ریزدانه‏ها به ترتیب حدود 5/0، 1 و 2 میلی‏متر تشکیل شد (14).

.میزان جذب فلز نیکل به وسیله باسیلوس بدون تثبیت: همان‏گونه که در شکل 2 نشان داده شده است، باسیلوس مورد آزمایش در اسیدیته‏ مختلف اسیدی، خنثی و قلیایی توان قابل قبولی در جذب فلز نیکل دارد. بیشینه میزان جذب فلز نیکل توسط باکتری مورد مطالعه در اسیدیته خنثی بوده است، این میزان در حدود 48 میلی‏گرم در گرم وزن خشک بیومس است‏.

.اثر تثبیت باکتری MGL-75 روی دانه‌های آلژینات .کلسیم و مقایسه آن با آلژینات کلسیم بدون سلول: همان‏طور که در شکل‏های 3 و 4 نشان داده شده است، درصد جذب فلز نیکل توسط باکتری تثبیت شده در آلژینات کلسیم نسبت به آلژینات کلسیم بدون سلول بسیار بیشتر بوده و میزان جذب نیکل توسط آلژینات کلسیم فاقد سلول ناچیز است.

شکل 2- جذب نیکل به‏وسیله باکتری در اسیدیته مختلف (درجه حرارت 28، زمان تماس 120 دقیقه، غلظت نیکل در محلول 200 میلی‏گرم بر لیتر)

شکل 3- اثر تثبیت باکتری باسیلوس بر روی آلژینات و آلژینات بدون باسیلوس در جذب نیکل از محلول

.اثر زمان تماس برای جذب فلز نیکل توسط .باسیلوس تثبیت شده در آلژینات کلسیم: همان‏گونه که در شکل 5 نشان داده شده است، با بررسی و مشاهده باکتری تثبیت شده به این نتیجه رسیدیم که افزایش جذب در باسیلوس تثبیت شده به آرامی باعث افزایش جذب فلز نیکل می‏شود‏. به طوری که در زمان 72 ساعت افزایش 10 درصدی در میزان جذب را شاهد هستیم. احتمالاً با گذشت زمان ورود محلول فلزی نیکل به داخل ریزدانه‏های حاوی باکتری بیشتر می‌شود، که خود باعث افزایش روند جذب می‌شود‏. در مورد شاهد، آلژینات کلسیم خود به شکل یک شبکه عمل می‌کند و باعث به دام انداختن فلز می‌شود‏. نتایج به دست آمده نشان داد مناسب‏ترین زمان برای استفاده از باکتری تثبیت شده در صنعت، 16 ساعت تماس است. زیرا هم زمان کمابیش کوتاه است و هم درصد جذب فلز در آن زمان مناسب است.

شکل 4- اثر آلژینات کلسیم بدون باکتری در جذب نیکل در زمان‏های مختلف

شکل 5- اثر زمان تماس در جذب نیکل به‏وسیله باکتری تثبیت شده در آلژینات کلسیم

.تأثیر قطر بیدهای آلژینات کلسیم در جذب فلز سدیم به وسیله باسیلوس: در این آزمایش همه شرایط به جز اختلاف در سرنگ یعنی اختلاف در قطر، یکسان بوده است و همچنین، اسیدیته محلول فلز نیکل در حدود7 تنظیم شد. میزان باکتری مورد استفاده در آلژینات کلسیم برابر، تعداد مهره‏های مورد استفاده یکسان و زمان تماس برای همه 16 ساعت درنظر گرفته شد. نتایج به‏دست آمده در شکل 6 نشان داده که سرنگ 2 میلی‏لیتری بهترین و مناسب‏ترین مهره‏ها را تولید می‏کند. مهره‏های حاصل از سرنگ2میلی‏لیتر پایداری بیشتری نسبت به مهره‏های حاصل از سرنگ 5 میلی‏لیتر و 10 میلی‏لیتر داشته ودر دوره‏های بیشتری قابل استفاده است.

شکل 6- تأثیر قطر ریزدانه‏های آلژینات کلسیم در جذب نیکل به‏وسیله باکتری

.بحث و نتیجه‏‏ گیری

استفاده از باکتری تثبیت شده می‏تواند به علت استفاده مداوم در فرآیند‏های صنعتی جایگزین استفاده از باکتری آزاد شود‏. باکتری باسیلوس مورد استفاده یک گونه باکتری میله‏ای شکل، گرم مثبت اسپوردار است که در محیط نوترینت آگار، کلونی‏های درشت، لعاب‏دار، برآمده و لزج شبیه قطرات شبنم ایجاد می‏کند که سرشار از پلیمرهای خارج سلولی است. برای دست‏یابی به میزان زیاد باکتری از محیط نمک معدنی گلوکز استفاده شد. مشخص شد که این باکتری ضمن رشد سریع، ماده لزج پلیمر خارج سلولی فراوانی تولید می‏کند به طوری‏که باعث افزایش ویسکوزیته محیط می‏شود‏ و یک حالت ژله‏ای شکل خمیر مانندی به خود می‏گیرد. نتایج به دست آمده نشان داده که اگزوپلیمرهای ترشح شده از باکتری باسیلوس در افزایش میزان جذب فلز نیکل نقش مهمی دارد. باکتری مورد مطالعه دارای بیشینه جذب برای فلز نیکل برابر 48 میلی‏گرم در گرم وزن خشک سلول است. در سطح باکتری و سطح آلژینیک اسید، حضور گروه‏های کربوکسیلیک به وسیله روش تحلیل اسپکتروسکوپی مادون قرمز[ix] در جذب فلز مشخص شد. با این روش باکتری بدون فلز و باکتری بعد از جذب فلز با تغییرات گروه‏های سطحی، نقش آن گروه‏ها ‏را در جذب مشخص می‏کنند (17). پژوهشگران دیگری نیز به نقش گروه‏های کربوکسیلیک به عنوان کلیدی‏ترین گروه در جذب فلز به‏وسیله باکتری‏ها ‏اشاره کردند. از جمله هونگ و لیو[x]، به جذب فلزات کادمیوم و سرب به وسیله باکتری سودوموناس و نقش اصلی گروه‏های کربوکسیلیک سطح دیواره آن اشاره کردند. این گروه‏ها ‏با از دست دادن یک هیدروژن به شکل COO^- در می‏آیند و کاتیون‏ها ‏از جمله کادمیوم، نیکل و سرب به آن‏ها متصل می‏شوند‏ (18).

مطالعه پژوهشگران نشان داد، جذب نیکل به وسیله باکتری آزاد جداسازی شده از تالاب انزی در حدود 5 درصد است‏ و در مقایسه با سلول‏های باکتریایی سودوموناس تثبیت شده کمتر است‏ (19). بررسی جاذب‏های زیستی دیگر نشان می‏دهد، میکروارگانیسمی مانند ساکارومیسس سرویزیه تثبیت شده با حامل‏های مختلف مانند آگار، آلژینات کلسیم و پلی آکریل آمید برای تثبیت سرب بیشتر از ساکارومیسس سرویزیه آزاد عمل می‏کند (18- 20). نقش اگزوپلیمر‏ها ‏ازجمله اگزوپلی ساکاریدها در جذب فلزات سمی و سنگین بررسی و مشخص شد، بسیاری از اگزوپلیمر‏های میکروبی در شرایط طبیعی به شکل پلی آنیون عمل می‏کنند. زیرا واجد گروه‏های آنیونی فراوانی هستند که میل ترکیبی بالایی با کاتیون‏های فلزی دارند. بنابراین، امروزه از آن‏ها برای جذب فلزات سمی و سنگین از محیط زیست استفاده می‏شود‏. اگزوپلیمر باکتریایی در جذب فلز نقش دارد، بطوری که اگزوپلیمر ریزوبیوم و ازتوباکتر در جذب فلز سرب مشخص شد (20).همچنین، میزان جذب نیکل به وسیله باکتری تثبیت شده، بیشتر از میزان جذب آن به وسیله‌ باسیلوس آزاد است. در تولید بید‏ها، برای تولید بید در بهترین حالت به محلول زیرین به میزان 15 میلی‏لیتر اتانول و 1 میلی‏لیتر اسیداستیک اضافه می‌شود‏. با استفاده از این ترکیبات که به محلول زیری اضافه می‌شود‏، ریزدانه‏ها واجد ویژگی‏های زیر می‏شوند:

الف- چسبندگی سلول‌ها به حداقل می‏رسد، به طوری‌ که همانند دانه‌های تسبیح خیلی راحت از هم جدا می‌شوند؛ ب- ریزدانه‏های آلژیناتی ایجاد شده واجد شفافیت بیشتر می‌شود‏.

البته پژوهش‏های بیشتر و دقیقی در این زمینه باید انجام شود تا زوایای پنهان این پژوهش مشخص شود‏ (19 و 20). از جمله مطالعات با میکروسکوپ الکترونی[xi] نگاره، برای بررسی ساختار سطحی و درونی آلژینات شاهد و آلژینات کلسیم واجد باکتری لازم است‏ (20). باید روشی استفاده شود‏ تا توزیع همگن و مناسب باکتری در آلژینات ایجاد شود. در حال حاضر روش توزیع تصادفی باکتری در بید‏های آلژیناتی مورد استفاده است. این نوع آرایش باکتری در آلژینات به شکل اتفاقی است‏. همچنین، نیاز است‏ علاوه بر آلژینات از ناقل‏های دیگر تثبیت مانند آگار، ژل پلی آکریل آمید و کیتوزان استفاده کرد و معایب و مزایای آن‏ها با آلژینات مقایسه شود.

.تشکر و قدردانی

از معاونت پژوهشی دانشگاه مازندران تشکر و قدردانی می‏شود.