افزایش میزان تولید آنزیم گزیلاناز از باسیلوس موجاونسیس با استفاده از روش جهش‏زایی تصادفی

مقدمه

جهش‏زایی تصادفی فرآیندی است که در آن، ‏با به‏کار بردن عوامل شیمیایی و فیریکی جهش‏زا، ‏تغییراتی در ویژگی‏های محصولات تولید شده توسط ژن‏ها ایجاد می‏شود. گاهی محصول اساساً تولید نمی‏شود و یا محصولاتی غیر طبیعی تولید می‏شوند. ولی گاهی این فرآیند منجر به افزایش تولید محصول در مقایسه با سویه جهش نیافته یا والد می‏شود ‏(‏1 و 2). ‏گزیلاناز، ‏آنزیم اصلی در تجزیه گزیلان، ‏دومین بیوپلیمر فراوان در جهان پس از سلولز است که با حمله به پیوندهای بتا یک به چهار گزیلان باعث شکستن اسکلت اصلی می‏شود ‏(‏3 و 4). ‏گزیلانازها کاربردهای فراوانی در صنایع، ‏از جمله سفید شویی کاغذ، ‏فرآوری نان، ‏هضم غذای دام و طیور و غیره دارد و تولید آن به طور انبوه مورد نیاز است ‏(‏5-9). ‏از آنجا که تولید آنزیم از منابع تولید کننده آن، ‏که بیشتر باکتری‏ها و قارچ‏ها هستند، ‏نمی‏تواند به لحاظ کمیت و ویژگی‏های کیفی آن جواب‏گوی نیازهای تجاری باشد، ‏تغییر ژنتیکی سویه‏های تولید کننده آنزیمی در ازای تولید بیشتر و یا تغییر کیفییت محصول تولیدی مد نظر است. به طور کلی بهبود سویه‏ها به لحاظ صنعتی و استفاده از روش‏های جهش‏زایی تصادفی فرآیندی است که در صورت موفقیت، ‏قابلیت تولید را تا چندین برابر افزایش می‏دهد و این افزایش در میزان تولید آنزیم گزیلاناز بسیار بیشتر و کارآمدتر از روش‏های پر هزینه دیگری نظیر کلونینگ و سایر روش‏های ژنتیکی نظیر جهش‏زایی هدف‏دار است، ‏که شاید با توجه به محدودیت و ویژگی‏های ذاتی خود سویه یا میزبان بیان کننده یک ژن در نهایت کارایی چندانی نداشته باشند ‏(‏7 و 10). ‏پژوهش‏های اندکی در رابطه با افزایش میزان تولید آنزیم گزیلاناز از منشا باکتریایی یا قارچی و با استفاده از روش‏های جهش‏زایی کلاسیک انجام شده است. بیشتر پژوهش‏های انجام شده بر روی کلونینگ ژن گزیلاناز متمرکز شده که میزان تولید را می‏تواند تا حد محدودی افزایش دهد. زیرا محدودیت سویه‏های وحشی تولید کننده و میزبان بیان کننده ژن پس از کلونینگ، ‏خود مانع از تولید بیش از حد محصول کلون شده می‏شود، ‏ضمن اینکه روش‏های بر پایه کلونینگ و یا جهش هدف‏دار گران‏تر نیز هستند. در حالی که ایجاد جهش با اشعه فرا بنفش ‌و یا مواد شیمیایی، ‏نه تنها ارزان‏تر و راحت‏تر بوده بلکه می‏تواند نتایجی به مراتب بهتر در افزایش تولید محصول مورد نظر نسبت به سایر روش‏های ژنتیکی گران قیمت‏تر ارایه دهد ‏(‏1 و 5). ‏مرور مقالات نشان می‏دهد تا به‏حال به تولید گزیلاناز توسط جهش‏یافته‏های باسیلوس موجاونسیس اشاره‏ای نشده است. در این مطالعه، ‏از روش کلاسیک ایجاد جهش‏های القایی با استفاده از اشعه [1]UV و اسید نیترو به‏عنوان ابزاری در بهبود سویه استفاده شد. نتایج به دست آمده در میزان تولید آنزیم از سویه‏های جهش یافته مقایسه شده و در نهایت، ‏بهترین سویه با بیش‏ترین میزان تولید آنزیم برگزیده شد.

مواد و روش‏ها

میکروارگانیسم

سویه میکروبی Bacillus mojavensis PTCC1723 [2] به شکل لیوفیلیزه از مرکز منطقه‏ای میکروارگانیسم‏های صنعتی ایران تهیه شد. برای تجدید کشت باکتری اقدامات لازم انجام و با انتفال سویه به محیط غنی برین هارت اینفوژین آگار مرحله احیای آن با موفقیت انجام شد.

برای بررسی توانایی باسیلوس موجاونسیس PTCC 1723 در تولید آنزیم گزیلاناز[3]، ‏از سوبسترای اختصاصی آنزیم گزیلاناز استفاده شد. محیط اختصاصی گزیلان آگار، ‏حاوی گزیلان خالص پوسته جو، ‏تهیه شده از شرکت فلوکا[4]، ‏با اسیدیته 7 و ترکیبات زیر ‏(‏گرم در لیتر) ‏تهیه شد: گزیلان خالص 5، ‏پپتون 5، ‏عصاره مخمر 5، ‏سولفات منیزیم هفت آبه 2/0، ‏دی‏پتاسیم هیدروژن فسفات 1 و آگار 15.

کشت نقطه ای از باکتری وحشی بر روی محیط اختصاصی تهیه شد. درچنین محیط کشتی، ‏میکروارگانیسم مولد آنزیم گزیلاناز، ‏هاله شفاف ناشی از تجزیه گزیلان تولید می‏کند. برای رویت بهتر هاله‏ها، ‏پلیت‏ها با محلول 1/0 درصد قرمز کنگو به مدت 15 دقیقه رنگ آمیزی و سپس، ‏با محلول کلرید سدیم یک مولار چندین بار شسته شدند ‏(‏6، ‏7 و 11). ‏

تهیه سوسپانسیون باکتریایی

از کشت 24 ساعته باسیلوس به میزان یک لوپ وارد 50 میلی‏لیتر از محیط غنی لوریا برتانی حاوی ‏(‏گرم در لیتر)‏: تریپتون 10، ‏پپتون 5 و کلرید سدیم 10 شد. گرماگذاری برروی شیکر انکوباتور به مدت 18 ساعت در 37 درجه سانتی‏گراد با دور rpm 160 انجام شد. سپس، 10 میلی‏لیتر از کشت مایع در دورrpm9000 به مدت 5 دقیقه و دمای 4 درجه سانتی‏گراد سانتریفوژ شد تا بیوماس جدا شود. بیوماس در 10 میلی‏لیتر از محیط سترون لوریا برتانی و در شرایط استریل حل شد. به‏طوری که کدورت سوسپانسیون به دست آمده در طول موج 625 نانومتر معادل 08/0 تا 1/0، ‏برابر نیم‏ درجه مک فارلند شود. به این شکل سوسپانسیونی حاوی حدود 10⁸×5/1 سلول در هر میلی‏لیتر به دست آمد ‏(‏12-14). ‏

تیمار با اشعه فرابنفش

از سوسپانسیون باکتریایی یاد شده سری رقت‏هایی مختلف از ^1-10 تا ^9-10 تهیه و از هر رقت به میزان 50 میکرولیتر در پلیت کشت داده شد. پلیت‏های نوترینت آگار برای شمارش تعداد کلونی‏های بازمانده و پلیت‏های گزیلان آگار اختصاصی برای مشاهده هاله هیدرولیز کلونی‏‏های جهش‏یافته و مقایسه شاخص H/C[5]کلونی‏‏های جهش یافته با باکتری والد استفاده شدند ‏(‏15). ‏از لامپ اشعه فرابنفش میله ای شکل فیلیپس 30 وات با طول موج 280 نانومتر برای ایجاد جهش استفاده شد. پلیت‏ها در فاصله 20 سانتی‏متری لامپ قرار داده شدند ‏(‏16). ‏بازه زمانی اشعه دهی از صفر تا 400 ثانیه در نظر گرفته شد و پلیت‏های کشت شده با فواصل 30 ثانیه‏ای از معرض اشعه دهی فرا بنفش خارج شدند. برای جلوگیری از فعال شدن سیستم ترمیم نوری، ‏پلیت‏ها در کیسه‏های نایلونی سیاه رنگ و در یک جعبه مقوایی قرار داده شدند. پس از 24 ساعت پلیت‏های اشعه دیده از انکوباتور 37 درجه سانتی‏گراد و شرایط تاریکی خارج شده تا کلونی‏های ظهور یافته بر روی پلیت‏ها شمارش شوند. پلیت یا نمونه متعلق به زمان صفر که همان نمونه شاهد و بدون تیمار با اشعه فرابنفش است، ‏برای تعیین تعداد کلونی‏‏های اولیه و تیمار نشده استفاده شد. در نهایت، ‏براساس شمارش تعداد کلونی‏های بازمانده در پلیت‏ها منحنی میزان مرگ- میزان بازماندگان در اثر عامل جهش‏زا ترسیم شدکه نشان دهنده تغییر تعداد بازماندگان در مقابل زمان است ‏(‏1، ‏15، ‏17 و 18). ‏

تیمار با اسید نیترو

غلظت 2/0 مولار از نیتریت سدیم در بافر استات 2/0 مولار و اسیدیته 5/5 تهیه و پس از سترون شدن با فیلتر 2/0 میکرون به عنوان محلول پایه اسید نیترو در تمام مراحل بعدی جهش‏زایی استفاده شد ‏(‏15). ‏سوسپانسیون باکتریایی با کدورت نیم درجه مک فارلند تهیه و 10 میلی‏‏لیتر از آن وارد ارلنی شد که حاوی 10 میلی‏‏لیتر محلول اسید نیترو دربافر استات بود. این ارلن در شیکر انکوباتور 37 درجه سانتی‏گراد قرار گرفت. برای ارزیابی تاثیر اسید نیترو بر سلول‏های باکتریایی، ‏تحت شرایط سترون، ‏از سوسپانسیون سلولی سویه وحشی هر 5 دقیقه یک‏بار، ‏تا 75 دقیقه، ‏به میزان 5/0 میلی‏لیتر نمونه‏گیری شد و به لوله‏های حاوی5/4 میلی‏لیتر بافر سدیم فسفات 05/0 مولار با اسیدیته 7 انتقال یافت. از بافر سدیم فسفات برای توقف اثر اسید نیترو روی سلول‏ها استفاده شد ‏(‏16). ‏سپس، ‏از لوله‏های یاد شده، ‏5/0 میلی‏‏لیتر نمونه گرفته و به درون لوله‏های حاوی سرم فیزیولوژی استریل برده شد. پس از هم زدن تمامی لوله‏ها،‏‏ از هر لوله 50 میکرولیتر بر روی پلیت‏های نوترینت آگار و گزیلان آگار استریل کشت داده شد. پلیت‏های نوترینت آگار برای شمارش تعداد کلونی‏های بازمانده و پلیت‏های گزیلان آگار برای مشاهده هاله هیدرولیز کلونی‏‏های دچار جهش و مقایسه شاخص قطر هاله کلونی‏‏های جهش یافته با سویه والد در نظر گرفته شدند. پلیت‏ها پس از کشت، ‏به انکوباتور37 درجه سانتی‏گراد منتقل و پس از 24 ساعت برای شمارش تعداد کلونی‏های باقی مانده خارج شدند ‏(‏16 و 19). ‏
به عنوان کنترل، ‏از سوسپانسیون باکتریایی سویه وحشی و تیمار نشده با اسید نیترو استفاده شد.

منحنی دوز بقا

معمولاً برای افزایش اطمینان از موثر بودن جهش‏های ایجاد شده، ‏ضریب مرگ سلول‏ها در اثر عامل جهش‏زا بین 99 تا 99/99 درصد در نظر گرفته می‏شود. ابتدا با تعیین منحنی مرگ میکروارگانیسم در اثر هریک از عوامل جهش‏زا، ‏زمان تیمار برای فرایند جهش‏زایی بهینه شد (‏20). ‏پس از تیمار سوسپانسیون باکتریایی با اشعه فرابنفش و اسید نیترو، با شمارش تعداد کلونی‏های تشکیل شده، ‏منحنی دوز- بقا در مقابل زمان رسم شد. مدت زمانی که 99/99 درصد سلول‏ها دچار مرگ شده‏اند به عنوان زمان بهینه ایجاد جهش در نظر گرفته شد (‏16). ‏از آن پس مراحل جهش‏زایی با اشعه فرابنفش و اسید نیترو چندین مرتبه تکرار شد و کلونی‏های جهش‏یافته به دست آمده وارد مرحله غربال‏گری کیفی و کمی شدند.

غربال اولیه جهش‏یافتگان بر اساس شاخص قطر هاله

در این مرحله از غربال‏گری‏ از شاخص نیمه کمی قطر هاله، ‏برای انتخاب کلونی‏‏هایی که تولید آنزیم آن‏ها بیش از سویه وحشی است استفاده شد. شاخص قطر هاله با تقسیم قطر هاله شفاف ناشی از هیدرولیز گزیلان بر قطر کلونی به دست آمد. پس از خالص‏سازی جهش‏یافتگان، از هر یک از کلونی‏‏ها بر روی محیط گزیلان آگار، ‏دوباره کشت نقطه‏ای داده شد و شاخص قطر هاله کلونی‏ها باشاخص قطر هاله باکتری شاهد مقایسه شد. کلونی‏هایی که نسبت شاخص قطر هاله آن‏ها از سویه والد بزرگتر بود به عنوان کلونی‏های بالقوه پر تولید بررسی و سنجش بیشتر شدند.

غربال ثانویه جهش‏یافته‏ها بر اساس میزان تولید آنزیم گزیلاناز در کشت مایع

جهش‏یافتگان برگزیده شده از مرحله اول به لحاظ میزان تولید آنزیم در محیط کشت مایع سنجش شدند تا میزان تولید آنزیم در آن‏ها با میزان تولید آنزیم سویه وحشی مقایسه شود.برای این منظور در ارلن‏های 250 میلی‏‏لیتری مقدار 50 میلی‏‏لیتر محیط تولید پایه آنزیم گزیلاناز حاوی ‏(‏گرم در لیتر)‏: گزیلان خالص 5، ‏پپتون 5، ‏عصاره مخمر 5، ‏سولفات منیزیم هفت آبه 2/0 و دی‏پتاسیم هیدروژن فسفات 1 تهیه شد. برای تنظیم اسیدیته از محلول 10 درصدکربنات سدیم سترون استفاده شد که به طور جداگانه و پس از اتوکلاو محیط‏های تخمیری به آن‏ها اضافه شد. اسیدیته محیط‏ها روی 7 تنظیم شد (‏21). ‏

سوسپانسیون‏های باکتریایی تازه از جهش‏یافته‏ها با کدورتی معادل 5/0 درجه مک فارلند تهیه و برای تلقیح آماده شدند. سپس، ‏از محیط‏های پیش کشت متعلق به هر یک،‏‏ به میزان ‏(‏v/v) ‏2 درصد وارد محیط‏های تخمیری شد. ارلن‏های محیط کشت تولید آنزیم به مدت 96 ساعت در شیکر انکوباتور 37 درجه سانتی‏گراد با دور rpm 160 قرار داده شد. از هر ارلن در فواصل زمانی 24 ساعت نمونه‏گیری انجام شد. نمونه‏های گرفته شده با انتقال به لوله‏های اپندورفدر دور rpm 9000 به مدت 10 دقیقه در سانتریفوژ دارای یخچال با دمای4 درجه سانتی‏گراد سانتریفوژ شد. از عصاره شفاف رویی به‏عنوان منبع آنزیم گزیلاناز خام برای سنجش فعالیت آنزیمی استفاده شد (‏21 و 22). ‏از کشت سویه والد در همان شرایط به عنوان شاهد استفاده شد.

سنجش فعالیت آنزیم گزیلاناز

از محلول ‏(‏w/v) ‏5/0 درصد گزیلان خالص پوسته جو در بافر سدیم فسفات05/0 مولار، ‏اسیدیته 7، ‏به عنوان سوبسترا استفاده شد. میزان 5/0 میلی‏لیتراز سوبسترا به همراه 5/0 میلی‏لیتر ازمحلول آنزیمی، ‏که به میزان مناسبی در بافر فوق رقیق شده بود، ‏به مدت 20 دقیقه در 40 درجه سانتی‏گراد گرماگذاری شد. فعالیت آنزیمی با سنجش میزان قندهای احیا کننده آزاد شده با استفاده از معرف دینیترو سالیسیلیک اسید محاسبه شد‏ ‏(‏‏23 و 24). ‏از منحنی استاندارد قند د-گزیلوز برای تعیین غلظت قندهای آزاد شده استفاده شد‏. یک واحد از فعالیت آنزیمی برابر با مقداری از آنزیم در نظر گرفته شد که موجب آزاد شدن یک میکرومول قند د-گزیلوز از سوبسترای به کار رفته در واکنش در هر دقیقه می‏شد‏ (‏25). ‏

نتایج

همان‏گونه که در شکل شماره 1 مشاهده می‏شود، باکتری والد با نشان دادن هاله شفاف نارنجی رنگ حاصل از تجزیه گزیلان به عنوان تولید کننده آنزیم گزیلاناز معرفی و شناخته شد. قطر کلونی‏های 24 ساعته باکتری از سویه وحشی حداقل 15 میلی‏متر و حداقل قطرناشی از هاله هیدرولیز 25 میلی‏متر بود در نتیجه شاخص قطر هاله آن معادل 6/1 به دست آمد.

شکل 1- ظهور هاله‏های نارنجی رنگ شفاف تجزیه گزیلان در اثر تولید آنزیم گزیلانازدر سویه وحشی

منحنی مرگ سلولی باسیلوس موجاونسیس در اثر اشعه فرابنفش

در شکل 2 منحنی مرگ سلول‏های باسیلوس موجاونسیس در اثر اشعه فرابنفش مشاهده می‏شود. بررسی نمودار نشان می‏دهد پس از 200 ثانیه 99/99 درصد سلول‏ها از بین رفته‏اند. در واقع در منحنی نشان داده شده که در زمان 210 ثانیه احتمال دسترسی به کلونی‏‏های جهش‏یافته در اثر اشعه بالاست. بنابراین، ‏از این پس کلونی‏‏هایی که پس از 210 ثانیه مجاورت با اشعه زنده ماندند، ‏از نظر وقوع جهش مطلوب غربال اولیه و ثانویه شدند.

شکل 2- تاثیر تابش اشعه فرابنفش بر میزان زنده ماندن سلول‏های باسیلوس موجاونسیس PTCC 1723. ‏

نقاط نمایش داده شده بر اساس میانگین داده‏ها در سه تکرار رسم شده است.

منحنی مرگ سلولی باسیلوس موجاونسیس در اثر اسید نیترو

در شکل 3 منحنی مرگ سلول‏های باسیلوس موجاونسیس در اثرتیمار بااسید نیترو مشاهده می‏شود.
با دقت به نمودار برای تعیین دوز بهینه جهش‏زایی اسید نیترو روی باسیلوس موجاونسیس، ‏زمان بهینه تیمار با اسید نیترو 52 دقیقه به دست آمد که طی آن 99/99 درصد سلول‏ها از بین رفتند.

در واقع طبق منحنی نشان داده شده که در زمان 52 دقیقه احتمال دسترسی به کلونی‏‏هایی که در اثر اسید نیترو دچار جهش شده اند حداکثر است. بنابراین، ‏از این پس کلونی‏هایی که پس از 52 دقیقه تیمار با اسید نیترو زنده ماندند، ‏از نظروقوع جهش مطلوب غربال اولیه و ثانویه شدند.

شکل 3-تاثیر محلول اسید نیتروبر میزان زنده ماندن سلول‏های باسیلوس موجاونسیس PTCC 1723.

نقاط نمایش داده شده بر اساس میانگین داده‏ها در سه تکرار رسم شده است.

شکل 4- نتیجه غربال‏گری‏ اولیه. الف) ‏شاخص قطر هاله در جهش‏یافته‏های اشعه فرابنفش، ‏ب) ‏فراوانی جهش‏یافته‏های اشعه فرابنفش از نظر شاخص قطر هاله، ‏ج) ‏شاخص قطر هاله در جهش‏یافته‏های اسید نیترو، ‏د) ‏فراوانی جهش‏یافته‏های اسید نیترو از نظر شاخص قطر هاله.
نقاط نمایش داده شده بر اساس میانگین داده‏ها در سه تکرار رسم شده است.

شکل 5- نتیجه غربال‏گری‏ ثانویه. الف) ‏تولید آنزیم در جهش‏یافته‏های اشعه فرابنفش، ‏ب) ‏فراوانی جهش‏یافته‏های اشعه فرابنفش از نظر تولید آنزیم، ‏ج) ‏تولید آنزیم در جهش‏یافته‏های اسید نیترو، ‏د) ‏فراوانی جهش‏یافته‏های اسید نیترو از نظر تولید آنزیم ‏

نقاط نمایش داده شده در نمودار الف و ج بر اساس میانگین داده‏ها در سه تکرار رسم شده اند.

نتایج غربال اولیه جهش‏یافتگان

طی انجام مرحله اول جهش‏زایی، ‏در مجموع 72 کلونی‏ با جهش مثبت غربال شد که شاخص قطر هاله بزرگتری در مقایسه با باکتری وحشی از خود نشان دادند. همان‏گونه که در شکل 4 مشاهده می‏شود. تعداد 36 سویه پس از تیمار با اشعه فرا بنفش و نیز تعداد 36 سویه پس از تیمار با اسید نیترو با شاخص قطر هاله بزرگتر از سویه وحشی از میان تعداد بیشماری از جهش‏یافتگان غربال شدند. بر اساس شکل 4 قسمت الف و ج، ‏جهش‏یافته شماره 17 با شاخص قطر هاله برابر با 2/3 از بین تیمار شده‏های اشعه فرابنفش و جهش‏یافته شماره 43 با شاخص قطر هاله برابر با 3 از بین تیمار شده‏های اسید نیترو، ‏به‏طور مشخصی شاخص قطر هاله بزرگتری را نشان دادند.

گزینش جهش‏یافته پر تولید:

در راستای انجام آزمایش‏های تاییدی و در مرحله غربالگری ثانویه، ‏میزان کمی تولید آنزیم در جهش‏یافتگان مطلوب سنجش و با میزان آنزیم تولید شده توسط باکتری وحشی مقایسه شد.نتایج این مقایسه در شکل 5 گنجانده شده است. از بین 36 جهش‏یافته به دست آمده از تیمار با اشعه فرابنفش سویه جهش‏یافته شماره 17 به عنوان جهش‏یافته برتر با میزان تولید آنزیمی IU/mL56/330 توانست نسبت به باکتری والد، ‏با میزان تولید اولیه IU/mL 73/95، ‏افزایش تولید 45/3 برابری را نشان دهد.

از طرفی همان‏گونه که در شکل 5 بارز است چندین سویه جهش یافته با میزان تولید آنزیم بالاتری از باکتری وحشی نیز به دست آمدند، ‏از جمله جهش‏یافته پر تولید شماره 43 که ناشی از تیمار سویه والد با اسید نیترو بود؛ زیرا توانست افزایش تولید 3/3 برابری را نسبت به آن نشان دهد. در نتیجه این سویه نیز به لحاظ میزان آنزیم تولید شده که معادلIU/mL 58 /319 است دارای ارزش و اهمیت بوده و نگه‏داری شد. از آنجا که بیش‏ترین میزان تولید آنزیم در سویه والد 48 ساعت پس از گذشت فرایند تخمیر به دست آمد ملاک سنجش و مقایسه میزان تولید آنزیم برای سویه‏های جهش‏یافته نیز همان 48 ساعت در نظر گرفته شد. اگر چه نمونه‏برداری و سنجش میزان تولید آنزیم برای جهش‏یافتگان نیز در زمان‏های 24، ‏48 و 96 ساعته انجام شد، ‏جهش‏یافتگان نیز بالاترین میزان تولید آنزیم را همانند سویه والد پس از گذشت 48 ساعت نشان دادند.

طبق شکل 6 قسمت الف و ب ضریب همبستگی بین نتایج حاصل از غربال‏گری‏ اولیه و ثانویه در تیمار با اشعه فرابنفش و اسید نیترو ‏(‏هر دو با فاکتور آلفا کوچکتر از 001/0) ‏به ترتیب برابر 853/0 و 793/0 بود که نشان دهنده همبستگی قوی بین نتایج این دو مرحله است‏. ضریب تشخیص همبستگی این‏ دو به ترتیب برابر 727/0 و 636/0 محاسبه شد که نشان می‏دهد در 7/72 درصد موارد می‏توان با دانستن نسبت شاخص قطر هاله کلونی‏‏های جهش‏یافته ناشی از تیماربا اشعه فرابنفش، ‏مقدار آنزیم قابل تولید توسط آن‏ها را در غربالگری‏ ثانویه به‏ درستی حدس زد. این احتمال در مورد جهش‏یافتگان ناشی از اسید نیترو6/63 درصداست‏. در هر دو مرحله نیمه کمی و کمی، ‏سویه‏ها اختلاف مشابهی را با والد نشان می‏دهند. به‏علاوه در مرحله دوم اختلاف جهش‏یافتگان با سوش والد خیلی نمایان‏تر است‏. در نهایت جهش‏یافتگانی که میزان تولید آنزیم آن‏ها کمتر از سویه وحشی بود و یا افزایش تولید آنزیم در آن‏ها خیلی چشمگیر نبوده کنار گذارده شدند.

شکل 6- همبستگی بین نتایج حاصل از غربال‏گری‏ اولیه و ثانویه. الف) ‏تیمار با اشعه فرابنفش، ‏ب) ‏تیمار با اسید نیترو

بحث و نتیجه‏‏گیری

همان‏گونه که مشاهده می‏شودفراوانی جهش‏یافتگان با شاخص قطر هاله 2 تا 2/2 بیش از بقیه است و حدود 45 جهش‏یافته با این حد از شاخص قطر هاله حاصل شده است. در شکل 4 و 5 قسمت ب و دال واضح است که فراوانی آن دسته از جهش‏یافتگان مطلوب که نسبت به والد تنها 5 تا 10 درصد افزایش تولید آنزیم داشتند، ‏بالاست. این کلونی‏‏ها دارای جهش‏های کوچک هستند و احتمال دستیابی به چنین جهش‏هایی در یک فرایند جهش‏زایی زیاد است، ‏اگر چه افزایش میزان تولید آنزیم در آن‏ها در مقایسه با باکتری وحشی خیلی چشمگیر نیست اما می‏توان با روش‏های بهبود سویه‏ای و ایجاد جهش‏های پی در پی در آن‏ها به نتایج مطلوبی در بالاتر بردن توانایی تولید محصول دست یافت. از طرفی دیگر، ‏احتمال دست یافتن به جهش‏یافتگانی با توانایی تولید آنزیم بسیار بیشتر، ‏نسبت به باکتری وحشی، ‏در اولین مرحله بسیار اندک و نیازمند تکرار آزمایش‏های طولانی مدت است‏ به‏طوری‏که ممکن است زمان زیادی صرف دسترسی به چنین جهش‏یافتگانی شودکه به اصطلاح جهش‏های بزرگ گفته می‏شود. اگرچه افزایش تولید محصول در آن‏ها نسبت به باکتری والد بسیار چشمگیر است اما همان‏طور که در شکل 5 ملاحظه می‏شود فراوانی این جهش‏یافتگان بسیار کمتر است. مقایسه افزایش تولید آنزیم در جهش‏یافتگان گویای آن است که تاثیر اشعه فرا بنفش در مقایسه با اسید نیترو در ایجاد جهش‏های مطلوب و کلونی‏‏های پر تولید بیشتر بوده است (‏شکل 4- قسمت ب و دال). ‏نتایج قطعی‏تر را می‏توان با مقایسه نسبت فراوانی جهش‏یافتگانی که میزان آنزیم بیشتری نسبت به باکتری وحشی تولید می‏کنند و ناشی از تیمار با اشعه فرا بنفش هستند ابراز داشت. همان‏گونه که در شکل 5- قسمت ب و دال مشاهده می‏شود، ‏نسبت فراوانی جهش‏یافتگان با میزان تولید آنزیم بین 100 تا 130 واحد بیش از سایر مقادیر است و در این میان، ‏این افزایش تولید، ‏فراوانی بیشتری را در میان جهش‏یافتگان تیمار یافته با اشعه فرا بنفش به خود اختصاص داده است. مقایسه قسمت الف و ج شکل 4 و 5 با یکدیگر می‏رساند که دقیقا آن دسته از جهش‏یافتگان با شاخص قطر هاله بزرگتر از باکتری والد لزوماً آنزیم بیشتری نیز تولید کرده اند و ضریب همبستگی این دو آزمایش بسیار نزدیک شده است. در واقع با دقت به منحنی توزیع فراوانی جهش‏یافتگان با شاخص قطر هاله بزرگتر از والد در شکل 4 قسمت ب و دال و مقایسه آن با منحنی توزیع فراوانی جهش‏یافتگان پر تولید در قسمت بو دال شکل 5 متوجه می‏شویم که بیش از 70 درصد تـوزیع فراوانی جهش‏یافتگان با شاخص قطر هاله بالاتر، ‏با نحوه توزیع فراوانی جهش‏یافتگان پر تولید مطابقت می‏کند. ضریب همبستگی مرحله نیمه کمی و مرحله غربال ثانویه بسیار نزدیک به هم بوده و این می‏رساندکه نتایج برآمده به قدری دقیق بوده که حتی می‏توان گفت نیازی به انجام روش تاییدی نبوده است؛ به عبارتی دیگر اگر چه شاخص قطر هاله یک روش نیمه کمی است، ‏اما نتایج برگرفته از روش کمی کاملاً با آن مطابقت می‏کند. منحنی توزیع فراوانی کل جهش‏یافتگان به دست آمده در حالت تمام شماتیک یک منحنی ناقوسی شکل است. در نمودارهای شکل 4 و 5 توزیع فراوانی جهش‏یافتگان منفی با شاخص قطر هاله کمتر از باکتری والد و توزیع فراوانی کلونی‏‏های بدون جهش نشان داده نشده است. این کلونی‏‏ها در همان مرحله اول از غربال‏گری‏ حذف شده و میزان تولید آنزیم در آن‏ها سنجش نشده است. بنابراین، ‏توزیع فراوانی مشاهده شده در مورد جهش‏یافتگان، ‏فقط متعلق به فراوانی جهش‏یافتگان مطلوب است که دقیقاً پس از باکتری والد و با میزان تولید بیشتر در نمودارهای شکل 4 و 5 مشخص شده اند. اما آنچه در این مورد مهم جلوه می‏کند نحوه توزیع این فراوانی است‏. فراوانی جهش‏یافتگانی که میزان شاخص قطر هاله آن‏ها بالاتر از 6/1 است در شکل 4 قسمت الف و ج گنجانده شده است. نحوه توزیع فراوانی کلونی‏‏های با شاخص قطر هاله بالاتر دقیقاً مشابه توزیع جهش‏یافتگانی است که آنزیم بیشتری نسبت به والد طبق شکل 5 قسمت الف و ج تولید می‏کنند. نتایج قطعی‏تر را می‏توان با دقت به شکل 6 متوجه شد.

شایان ذکر است افزایش تولید گزیلاناز همواره مورد توجه پژوهشگران بوده و برای دستیابی به مقادیر هر چه بالاترآنزیم،‏‏ محققان به راه‏های گوناگونی متوسل شده اند. عده‏ای نظیر آنچه به اختصار در جدول شماره 1 یاد شده است در جستجوی میکروارگانیسم‏هایی هستند که ذاتا توانایی تولید گزیلاناز بالایی را دارند و به طور طبیعی و دست نخورده مقادیر مناسبی از آنزیم را تولید می‏کنند (‏26-28). ‏برخی دیگر به دنبال بالا بردن میزان تولید از سویه‏های میکروبی طی بهینه‏سازی ترکیبات محیط کشت و شرایط تخمیری هستند (‏30 و 29). ‏به عنوان مثال، ‏گزیلاناز باسیلوس موجاونسیس 137 بومی، ‏جداسازی شده از خاک مزرعه پنبه در حوالی کاشان،‏‏ با تولید اولیه حدود IU/mL 68/194، ‏طی بهینه‏سازی ترکیبات محیط کشت و شرایط تخمیر به میزانی معادل IU/mL 466/302 افزایش یافت (‏21). ‏همچنین، ‏در سویه 137-12p از گونه ای از استرپتومایسس، ‏با به کارگیری روش‏های بهینه‏سازی ترکیبات محیط کشت و شرایط تخمیر، ‏افزایش تولید آنزیم تا حدود 27 واحد به دست آمد (‏3). ‏

جدول 1- مقادیر آنزیم گزیلاناز تولید شده از میکروارگانیسم‏های مختلف