جهش‏زا‏‏یی توسط UV و اسید نیترو برای افزایش تولید رنت در Rhizomucor miehei

مقدمه

کیموزین ‏(‏رنت) ‏یک مخلوط آنزیمی است که در صنایع پنیرسازی برای انعقاد شیر به کار می‏‏‏رود ‏(‏1).
در گذشته، رنت از معده چهارم گوساله‏ها‏ی شیرخوار به دست می‏‏‏آمد. اما با افزایش تقاضا برای مصرف گوشت و پنیر، ضروری بود تا به سایر منابع آنزیم‏ها‏ی دلمه کننده توجه شود. به این ترتیب برخی رنت‏ها‏ی حیوانی جایگزین کشف شدند و امروزه نیز برخی آنزیم‏ها‏ی دلمه کننده شیر با منشا میکروبی، کاربرد تجاری یافته اند ‏(‏2).

رنت مورد استفاده در صنایع پنیرسازی نباید دارای اثر پروتئولیز محسوس روی کازئین شیر باشد. در این صورت ممکن است پپتیدهای آب دوست تشکیل شده و باعث ایجاد طعم تلخ در محصول شود. از این رو لازم است رنت جایگزین، فعالیت دلمه کنندگی بالا و فعالیت پروتئولیتیکی پائینی داشته باشد. به این ترتیب نسبت فعالیت دلمه کنندگی به فعالیت پروتئولیتیکی ‏(‏ ) ‏[1]، به عنوان یک شاخص برای انتخاب سویه‏ها‏ی میکروبی مناسب، توسط محققان به کار رفته است ‏(‏3 و 4).

به طور کلی در میان میکروارگانیسم‏ها‏ی تولید کننده رنت، گونه‏ها‏ی قارچی به علت‏‏ دارا بودن نسبت  ‏بالا، اهمیت بیشتری دارند. در این رابطه رنت به دست آمده از کپک ریزوموکور میه هی[2]، یکی از بهترین جایگزین‏ها‏ی کیموزین گوساله است که به علت‏‏ شاخص‏های کیفی مشابه، دارای اهمیت تجاری است ‏(‏5 و 6).

به منظور اهداف تجاری، یکی از بهترین روش‏ها‏ی افزایش تولید و توسعه سویه‏ها‏ی صنعتی، بهبود ژنتیکی سویه‏ها‏ی میکروبی است. در این رابطه می‏‏‏توان به روش نوترکیبی و تکنیک جهش و انتخاب اشاره نمود. در سال‏ها‏ی گذشته پژوهش‏ها‏ی بسیاری در رابطه با افزایش تولید رنت ‏با روش نوترکیبی انجام شده است‏‏ که در میان آن‏ها‏ می‏‏‏توان به پژوهش‏ها‏ی وارد و همکاران[3]، کاپرالک و همکاران[4] ‏و بادی و همکاران[5] ‏‏اشاره داشت ‏(‏7- 9). سکر و همکاران[6] ‏با بهینه‏سازی‏‏‏ تولید رنت ریزوموکور میه هی در فرمانتور مداوم، تولید این آنزیم را در سطح 5/7 گرم بر لیتر گزارش کردند ‏(‏10). همچنین، می‏‏‏توان به تحقیقات داسیلویرا و همکاران[7] و نیز دلیما و همکاران[8] ‏‏در زمینه بهینه‏سازی‏‏‏ تولید رنت اشاره کرد ‏(‏11 و 12).

به طور کلی تکنیک جهش– انتخاب در 2 مرحله انجام می‏‏‏شود. در مرحله اول با استفاده از عوامل جهش‏زا‏‏ در میکروارگانیسم مورد نظر جهش[9] ایجاد می‏‏‏شود؛ سپس، در مرحله دوم، جهش یافته‏ها‏ی مطلوب با یک استراتژی مشخص انتخاب[10] می‏‏‏شوند ‏(‏2). فونگارو و همکاران[11] ‏با سه سیکل متوالی جهش- انتخاب، موفق به جداسازی سویه ای از
کاندیدا تسوکوبائنسیس[12] شدند که میزان تولید رنت آن حدود 2 برابر نسبت به سویه والد افزایش داشت. ضمن آن که فعالیت پروتئولیتیکی سویه اصلاح شده تقریبا 20 درصد کاهش یافت ‏(‏13).

با این حال با وجود مطالعات فراوانی که تاکنون در زمینه افزایش تولید رنت انجام شد‏‏ه، کمتر به موضوع جهش- انتخاب پرداخته شده است. بنابراین،‏‏ هدف از انجام این تحقیق، استفاده از عوامل جهش‏زا‏‏ مشتمل بر UV ‏(‏به عنوان عامل جهش‏زا‏‏ی فیزیکی) ‏و اسید نیترو [13] ‏(‏به عنوان عامل جهش‏زا‏‏ی شیمیایی)‏، برای تهیه سویه‏ها‏ی جهش یافته از ریزوموکور میه هی بود کهراندمان تولید رنت بیشتری داشتند. مهم‏ترین اثر جهش‏زا‏‏یی پرتوهای UV، ایجاد دایمرهای تیمین در ساختار DNA سلول است که در طول موج 254 نانومتر به حداکثر می‏‏‏رسد ‏(‏14 و 15). اسید نیترو نیز از جهش‏زا‏‏های قوی است که سازوکار تاثیر آن بر DNA، عموما به دآمیناسیون بازهای آدنین، گوانین و سیتوزین مربوط می‏‏‏شود که در نتیجه آن پیوندهای هیدروژنی بازهای یاد شده‏‏ تحت تاثیر قرار می‏‏‏گیرد ‏(‏16).

مواد و روش‏ها

میکروارگانیسم مورد استفاده

سویه میکروبی مورد استفاده در این پژوهش، ریزوموکور میه هی ‏(‏PTCC 5145) ‏بود که از مرکز منطقه ای کلکسیون میکروارگانیسم‏ها‏ی ایران، وابسته به سازمان پژوهش‏ها‏ی علمی وصنعتی ایران تهیه شد. محیط کشت مورد استفاده ‏برای نگهداری سویه میکروبی، حاوی عصاره ‏مالت ‏تهیه ‏شده ‏از شرکت ‏بهنوش ‏ایران ‏(‏60 گرم بر لیتر)‏،‏ ‏پودر شیر بدون چربی ساخت شرکت مرک آلمان ‏(‏15 گرم بر لیتر) ‏و آگار ‏(‏15 گرم بر لیتر) ‏بود که در اسیدیته‏ 5 به شکل‏‏ مایل تهیه و پس از کشت و رشد میکروارگانیسم در دمای 40 درجه سلسیوس، در یخچال ذخیره و هر 15 روز تجدید کشت شد.

جهش‏زا‏‏یی با UV

1/0 میلی‏لیتر از سوسپانسیون کنیدیوسپور حاوی
10⁸ × 2 بر میلی‏لیتر، از اسپورهای با عمر 3 روز، در پلیت‏ها‏ی حاوی محیط کشت DRBC Agar ‏(‏ساخت شرکت کیولب[14]) ‏کشت داده شد. سپس، در شرایط تاریکی، پلیت‏ها‏ زیر لامپ UV 30 وات ‏(‏شرکت فیلیپس[15]) ‏با طول موج 280 نانومتر و در زمان‏ها‏ی ‏مختلف 30، 60، 90، 120، 150و180 ثانیه تحت تابش مستقیم UV قرار گرفتند. به طوری که فاصله لامپ UV تا سطح پلیت‏ها‏ 20 سانتی‏متر بود. ضمن آن که در هنگام تیمار با UV درب پلیت‏ها‏ برداشته شد. پلیت‏ها‏ تا زمان ظاهر شدن کلونی‏‏‏ها‏ در دمای 25 درجه سلسیوس گرمخانه‏گذاری و سپس کلونی‏‏‏ها‏ی تشکیل شده، شمارش شدند ‏(‏2 و 17). دوزی به عنوان دوز بهینه UV تعیین شد که در شرایط متعارف فوق، 99/99 درصد اسپورهای اولیه را از بین ببرد ‏(‏18).

جهش‏زا‏‏یی با اسید نیترو

5 میلی‏لیتر از سوسپانسیون کنیدیوسپور حاوی
10⁸ × 2 بر میلی‏لیتر،‏ به 5 میلی‏لیتر محلول نیتریت سدیم ‏(‏شرکت مرک آلمان) ‏2/0 مولار در بافر استات ‏(‏با غلظت 2/0 مولار و اسیدیته 5/4‏) ‏اضافه و به شیکر انکوباتور با دمای 35 درجه سلسیوس و 150 دور در دقیقه انتقال یافت. به منظور توقف جهش‏زا‏‏یی، در فواصل زمانی 10، 20، 30، 40، 50 و 60 دقیقه، 1 میلی‏لیتر از سوسپانسیون تیمار شده، با بافر فسفات ‏(‏با غلظت 2/0 مولار و اسیدیته1/7‏) ‏مخلوط شده و از هر یک، رقت مناسبی برای کشت تهیه شد‏‏. کشت از سوسپانسیون‏ها‏ی یاد شده‏‏ در پلیت‏ها‏ی حاوی محیط DRBC Agar انجام شد‏‏. به دنبال آن گرمخانه‏گذاری در دمای 25 درجه سلسیوس و تا زمان ظاهر شدن کلونی‏‏‏ها‏ انجام و کلونی‏‏‏ها‏ی تشکیل یافته، شمارش شدند. به این ترتیب، دوز بهینه اسید نیترو، میزان غلظتی تعیین شد که قادر بود 4 سیکل لگاریتمی از اسپورهای اولیه را از بین ببرد ‏(‏18).

تولید آنزیم

یک میلی‏لیتر از سوسپانسیون کنیدیوسپور حاوی
 10⁷ × 4 بر میلی‏لیتر به 40 میلی‏لیتر محیط تولید آنزیم در ارلن‏ها‏ی 250 میلی‏لیتری تلقیح شد. محیط تولید حاوی: عصاره مالت ‏(‏40 گرم بر لیتر) ‏و پودر شیر بدون چربی ‏(‏15 گرم بر لیتر) ‏بود که پس از تنظیم اسیدیته‏ روی 6، در اتوکلاو با دمای 121 درجه سلسیوس و فشار 5/1 اتمسفر به مدت 5 دقیقه استریل شد. سپس، ارلن‏ها‏ به شیکر انکوباتور با دمای ‏37 درجه سلسیوس و 180 دور در دقیقه انتقال یافت. پس از 5 روز، زیست توده تولید شده با استفاده از کاغذ صافی و با کمک پمپ خلا جدا شد و از سوپرناتانت شفاف حاصل که حاوی آنزیم رنت است، برای اندازه‏گیری‏‏‏ کمی استفاده شد ‏(‏2).

سنجش کمیت‏ها‏ی آزمایشی

سنجش فعالیت دلمه کنندگی آنزیم

برای اندازه‏گیری‏‏‏ فعالیت دلمه کنندگی، ابتدا محلول 10 درصد پودرشیر بدون چربی، حاوی غلظت 01/0 مولار کلرید کلسیم تهیه شد. سپس، ‏5/0 میلی‏لیتر سوپرناتانت آنزیمی در دمای 35 ‏درجه سلسیوس به 5 میلی‏لیتر سوبسترا ‏(‏محلول فوق) ‏اضافه و زمان انعقاد محلول تا ایجاد نخستین فلوکوله‏ها‏ اندازه‏گیری‏‏‏ شد. فعالیت دلمه کنندگی با استفاده از رابطه 1 به دست آمد ‏(‏19). ‏رابطه 1:      ‏CA =  ×  ×

در رابطه 1: CA فعالیت دلمه کنندگی آنزیم برحسب واحد سوکسله بر میلی‏لیتر ‏(‏SU.mL^-1)‏،
M و E به ترتیب حجم سوبسترا و حجم سوپرناتانت آنزیمی بر حسب میلی‏لیتر، T دمای محیط واکنش آنزیم - سوبسترا برحسب درجه سلسیوس و
t زمان انعقاد شیر بر حسب ثانیه ‏است‏‏‏.

سنجش فعالیت پروتئولیتیکی آنزیم

برای انجام آزمایش، ابتدا لازم بود تا سوبسترای پروتئینی تهیه شود. به همین منظور محلول 5 گرم پودر کازئین در 80 میلی‏لیتر آب مقطر تهیه و در دمای ‏37 ‏درجه سلسیوس به مدت 60 دقیقه گرمخانه گذاری شد. سپس 50 میلی‏لیتر بافر فسفات ‏‏(‏25/7 اسیدیته‏ و غلظت 25/0 مولار) ‏به آن افزوده و با آب مقطر به حجم 250 میلی‏لیتر رسانده شد. به منظور سنجش فعالیت پروتئولیتیکی آنزیم، 5 میلی‏لیتر از سوبسترای کازئینی تهیه شده در دمای 35 درجه سلسیوس به 1 میلی‏لیتر سوپرناتانت آنزیمی افزوده شد. پس از 15 دقیقه، واکنش با اضافه کردن 10 میلی‏لیتر تری کلرواستیک اسید 5 درصد ‏‏‏ متوقف شد. پس از 30 دقیقه و پایدار شدن محلول‏ها‏، جذب نمونه‏ها‏ در طول موج 280 نانومتر، با استفاده از اسپکتروفتومتر ‏(‏بیو کروم بیو ویو 2[16]- انگلستان) ‏خوانده شد. یک واحد فعالیت پروتئولیتیکی، معادل مقدار آنزیمی تعریف شد که جذب نمونه را در طول موج 280 نانومتر از مسیری به طول 1 سانتی متر، به میزان یک واحد افزایش دهد. به این ترتیب نتایج سنجش فعالیت پروتئولیتیک بر حسب PU.mL^-1گزارش شد ‏(‏20).

ترسیم منحنی سینتیک تولید آنزیم ‏

برای رسم منحنی سینتیک تولید آنزیم، ابتدا هر کدام از سویه‏ها‏ی اصلی و جهش یافته، با سه تکرار کشت داده شدند. محیط‏ها‏ در دمای ‏37 درجه سلسیوس و 180 دور بر دقیقه در شیکرانکوباتور ‏(‏ان بیوتک[17] - کره جنوبی) ‏گرمخانه گذاری شدند. در هر 24 ساعت، 3 ارلن از محیط‏ها‏ی تلقیح شده مربوط به هر سویه را از شیکر خارج کرده و فعالیت دلمه کنندگی آن‏ها‏ اندازه‏گیری‏‏‏ شد. با قرار دادن میانگین فعالیت دلمه کنندگی آنزیم هر سویه نسبت به زمان، منحنی سینتیک تولید آنزیم رسم شد ‏(‏11)

ارزیابی بهره‏وری‏‏ آنزیم

از رابطه 2، به منظور تعیین میزان بهره‏وری‏‏ آنزیم استفاده شد ‏(‏21). ‏رابطه 2:      ‏P =

در رابطه 2: P بهره‏وری‏‏ آنزیم بر حسب سوکسله بر میلی‏لیتر ساعت ‏(‏SU.mL^-1h^-1)‏، CA فعالیت دلمه‏کنندگی آنزیم بر حسب واحد سوکسله بر میلی‏لیتر ‏(‏SU.mL^-1)‏، v حجم محیط تولید بر حسب میلی‏لیتر و t زمان بر حسب ساعت ‏است‏‏‏.

ارزیابی بازدهی آنزیم

میزان بازدهی نسبت به منابع کربن و نیتروژن محیط تولید، با استفاده از رابطه‏های 3 و 4 تعیین شد ‏(‏22):

‏‏رابطه 3:      Y_CA/C =

‏‏رابطه 4:      ‏‏‏‏Y_CA/N =

در رابطه‏های 3 و 4: Y_CA/C، بازدهی تولید آنزیم نسبت به منبع کربن بر حسب واحد سوکسله بر گرم کربوهیدرات ‏‏ (‏SU.g^-1_C)‏، Y_CA/N، بازدهی تولید آنزیم نسبت به منبع نیتروژن بر حسب واحد سوکسله بر گرم نیتروژن ‏(‏SU.g^-1_N) ‏وM_C ‏و M_N به ترتیب جرم کربوهیدرات و نیتروژن محیط بر حسب گرم ‏(‏g) ‏است‏‏‏.

سنجش ضریب رشد ویژه

در ابتدا، سوسپانسیون کنیدیوسپور حاوی 10⁷ × 4 بر میلی‏لیتر به محیط تولید تلقیح و به شیکر انکوباتور با دمای 40 درجه سلسیوس و 150 دور در دقیقه منتقل شد. پس از 24 ساعت، 10 درصد ‏(‏حجمی/حجمی) ‏از محیط فوق به محیط جدید تلقیح و وزن خشک اولیه آن‏ها‏ اندازه‏گیری‏‏‏ شد. پس از ‏4 روز گرمخانه‏گذاری در شیکر انکوباتور با شرایط یاد شده‏‏، زیست توده تولید شده با استفاده از صافی کاغذی و پمپ خلا جدا شده و وزن خشک ثانویه آن‏ها‏ نیز تعیین شد. برای تعیین وزن خشک، صافی‏ها‏ی کاغذی محتوی زیست توده به مدت 24 ساعت در دمای 70 درجه سلسیوس در فور قرار گرفتند ‏(‏23). با محاسبه وزن خشک اولیه و ثانویه و استفاده از رابطه مونود ‏(‏رابطه 5)‏، ضریب رشد ویژه به دست آمد ‏(‏24). (‏رابطه 5):

تجزیه و تحلیل آماری داده‏ها‏

تمام داده‏ها‏ی به دست آمده از آزمایش‏ها‏ی مختلف، در قالب طرح کاملا تصادفی بررسی‏ها‏ی آماری شد. در آزمایش‏ها‏ی نهایی مربوط به هریک از میکروارگانیسم‏ها‏، تعداد 3 تیمار با 5 تکرار در نظر گرفته شد. در این پژوهش، به منظور بررسی ویژگی کمی داده‏ها‏، از تحلیل‏‏ واریانس و نرم افزار اس پی اس اس نگارش 16[18] و برای مقایسه میانگین‏ها‏ از آزمون چند دامنه ای دانکن استفاده شد. همچنین، رسم نمودارها به کمک نرم افزار ‏مایکروسافت آفیس اکسل 2007[19] انجام شد.

نتایج

منحنی لگاریتمی مرگ اسپورهای
ریزوموکور میه هی در اثر UV و اسید نیترو، به ترتیب در شکل‏ها‏ی 1 و 2 آمده است. همان گونه که مشاهده می‏‏‏شود. دوز بهینه UV برای کاهش 4 سیکل لگاریتمی ‏(‏99/99 درصد‏‏‏ اسپورهای تلقیح شده)‏، در زمان تقریبی 52 ثانیه به دست آمد؛ در مورد اسید نیترو، این زمان حدود 40 دقیقه بود.

شکل 1- ‏منحنی لگاریتمی مرگ اسپورهای ریزوموکور میه هی در اثر UV

شکل 2- ‏منحنی لگاریتمی مرگ اسپورهای ریزوموکور میه هی در اثر اسید نیترو

شکل 3- مقایسه فعالیت دلمه کنندگی سویه‏ها‏ی والد و جهش یافته ریزوموکور میه هی

‏(‏error bar‏ها‏ نشان دهنده انحراف معیار 5 تکرار است‏‏‏) ‏

مقدار فعالیت دلمه کنندگی رنت حاصل از سویه والد SU.mL^-1 1183 اندازه‏گیری‏‏‏ شد. این مقادیر در مورد ‏جهش یافته‏ها‏ی N-0227 و U-1113 به ترتیب SU.mL^-1 1864 و SU.mL^-1 1771 به دست آمد ‏(‏شکل 3).

همچنین، فعالیت پروتئولیتیکی رنت حاصل از سویه والد PU.mL^-1 239/0 اندازه‏گیری‏‏‏ شد که این مقادیر برای جهش یافته‏ها‏ی N-0227 و U-1113 به ترتیب PU.mL^-1 231/0 و PU.mL^-1 222/0 به دست آمد ‏(‏شکل 4).

شکل 4 - مقایسه فعالیت پروتئولیتیکی سویه‏ها‏ی والد و جهش یافته ریزوموکور میه هی

(‏error bar‏ها‏ نشان دهنده انحراف معیار 5 تکرار است‏‏‏) ‏

نتایج مربوط به نسبت  ‏آنزیم سویه‏ها‏ی والد و جهش یافته ریزوموکور میه هی ‏در شکل 5 آمده است. همان گونه که ملاحظه می‏‏‏شود، این کمیت برای سویه والد، ‏U-1113 ‏و N-0227 به ترتیب 5037، 8193 و SU.PU^-1 8114 به دست آمده است.

شکل 5- ‏مقایسه نسبت  ‏آنزیم سویه‏ها‏ی والد و جهش یافته ریزوموکور میه هی

(‏error bar‏ها‏ نشان دهنده انحراف معیار 5 تکرار است‏‏‏) ‏

شکل 6 سینتیک تولید آنزیم را تا 144 ساعت نشان می‏‏‏دهد. همان گونه که مشاهده می‏‏‏شود، تولید رنت از ‏سویه‏ها‏ی جهش یافته و والد تا زمان 96 ساعت، با آهنگ کمابیش یکسانی افزایش یافته است. اما پس از 96 ساعت، تولید رنت از سویه‏ها‏ی جهش یافته در مقایسه با سویه والد، شتاب بیشتری گرفته، به طوری که در زمان 144 ساعت پس از کشت، این اختلاف کاملا مشخص شده است.

شکل 6- ‏مقایسه سینتیک تولید رنت حاصل از سویه والد و جهش یافته‏ها‏

در مورد سویه والد، بازدهی تولید آنزیم نسبت به منابع کربن و نیتروژن به ترتیب 44308 و
SU.g^-1 230245 محاسبه شد؛ این کمیت‏ها‏ برای
N-0227 به ترتیب 69822 و 362828 و برای U-1113 به ترتیب66308 و SU.g^-1 344571 به دست آمد
(‏شکل 7). ‏

شکل 7- ‏مقایسه بازدهی تولید رنت از سویه والد و جهش یافته‏ها‏ نسبت به منابع کربن و نیتروژن محیط تولید

(‏error bar‏ها‏ نشان دهنده انحراف معیار 5 تکرار است‏‏‏) ‏

همچنین، بهره‏وری‏‏ آنزیم نیز در سویه والد، 22/8 و در جهش یافته‏ها‏ی ‏N-0227وU-1113، به ترتیب ‏95/12 و SU.h^-1.mL^-1 3/12 محاسبه شد ‏(‏شکل 8). ‏

شکل 8- ‏مقایسه بهره‏وری‏‏ تولید رنت از سویه والد و جهش یافته‏ها‏

(‏error bar‏ها‏ نشان دهنده انحراف معیار 5 تکرار است‏‏‏) ‏

نتایج ارزیابی ضریب رشد ویژه در شکل 9 نمایش داده شده است. همانگونه که ملاحظه می‏‏‏شود این کمیت برای سویه والد 97/1 و برای جهش یافته‏ها‏ی
‏N-0227وU-1113، به ترتیب 9/1 وh^-1 ‏78/1 اندازه‏گیری‏‏‏ شد.

شکل 9- ‏مقایسه ضریب رشد ویژه سویه والد و جهش یافته‏ها‏

(‏error bar‏ها‏ نشان دهنده انحراف معیار 5 تکرار است‏‏‏)

بحث و نتیجه‏گیری

پیش از القای جهش، دوز‏ها‏ی بهینه عوامل جهش‏زا‏‏ی مورد استفاده ‏(‏اسید نیترو و UV) ‏‏برای از بین بردن 99/99 درصد‏‏‏ از اسپورهای تلقیح شده، تعیین شد. در نتیجه احتمال یافتن جهش یافته در بین کلونی‏‏‏ها‏ی تشکیل شده، بیشتر شد. به همین دلیل ابتدا منحنی‏ها‏ی مرگ اسپورهای ریزوموکور میه هی در اثر تیمار با اسید نیترو و UV رسم شد ‏(‏25 و 26).

پس از آن، به منظور القای جهش و ایجاد سویه‏ها‏ی جهش یافته از دوز‏ها‏ی بهینه اسید نیترو و UV استفاده شد. به منظور یافتن جهش یافته برتر از نظر تولید رنت، جهش یافته‏ها‏ی ایجاد شده از نظر فعالیت دلمه کنندگی آنزیم شده و از میان آن‏ها‏، سویه‏ها‏ی با فعالیت پروتئولیتیکی کمتر انتخاب شدند.

 از بین جهش یافته‏ها‏ی مورد ارزیابی که با اسید نیترو تیمار شده بودند، در نهایت جهش یافته ای با نام انتخابی ‏N-0227، جداسازی شد. به همین ترتیب جهش یافته دیگری با نام انتخابی U-1113 که حاصل تیمار با UV بود، جدا شد. به منظور اطمینان از پایداری جهش‏ها‏ی ایجاد شده در جهش یافته‏ها‏ی یاد شده‏‏، 10 بار تجدید کشت متوالی انجام شد و فعالیت آنزیم آن‏ها‏ اندازه‏گیری‏‏‏ شد. در نهایت پس از حصول اطمینان از پایداری، رنت تولیدی از آن‏ها‏ از نظر کیفی و کمی با رنت سویه والد مقایسه شد‏‏.

در این پژوهش، فعالیت دلمه کنندگی اندازه‏گیری‏‏‏ شده برای سویه والد ‏(‏SU.mL^-1 1183)‏، با نتایج داسیلویرا و همکاران ‏(‏SU.mL^-1 1105) ‏کاملا منطبق بود ‏(‏11). ضمن آن که نتایج ‏تجزیه ‏واریانس ‏داده‏ها‏ی مربوطه ‏نشان ‏داد که ‏فعالیت ‏دلمه کنندگی ‏رنت ‏حاصل ‏از ‏N-0227وU-1113، به ترتیب 6/57 و 7/49 درصد در مقایسه با سویه والد افزایش یافته است ‏(‏05/0P value<)‏؛ در حالی که فعالیت پروتئولیتیکی سویه جهش یافته یاد شده‏‏ تغییر معنی داری در مقایسه با سویه والد نشان نداد
‏(‏05/0P value>). به این ترتیب با افزایش فعالیت دلمه کنندگی و ثبات نسبی فعالیت پروتئولیتیکی، نسبت  آنزیم، 6/62 درصد در N-0227 و 1/61 درصد در U-1113 افزایش یافت‏(‏05/0P value<). هر چه مقدار نسبت  آنزیم بیشتر باشد، آنزیم اختصاصی تر عمل کرده و راندمان دلمه در فرآیند تهیه پنیر بیشتر خواهد بود. به عبارت دیگر هر چه این نسبت بیشتر باشد، کیفیت رنت بیشتر و کارایی آن بالاتر است‏‏‏ (‏27).

همچنین، نتایج به دست آمده از سینتیک تولید آنزیم، با گزارش‏ها‏ی سکر و همکاران، روی ریزوموکور میه هی منطبق است. طبق گزارش یاد شده، منحنی سینتیک تولید آنزیم تا حدود 420 ساعت پس از تلقیح، حالتی صعودی داشته و پس از آن نزول پیدا می‏‏‏کند ‏(‏10). در این پژوهش، سینتیک تولید آنزیم تا 144 ساعت ارزیابی شد.

همچنین، نتایج به دست آمده برای بازدهی آنزیم سویه والد، نسبت به منبع کربن و نیتروژن محیط که به ترتیب 44308 و SU.g^-1 230245 اندازه‏گیری‏‏‏ شد، نسبت به نتایج دلیما و همکاران به ترتیب 5/62 و 5/53 درصد بیشتر بود ‏(‏12). این تفاوت می‏‏‏تواند با در نظر گرفتن ترکیب محیط کشت و شرایط حاکم بر آزمایش توجیه شود؛ به طوری که فرمولاسیون محیط کشت و شرایط آزمایشی در این پژوهش نسبت به تحقیق دلیما و همکاران، در افزایش بازدهی آنزیم تاثیرگذارتر بوده است. ضمن آن که نتایج تجزیه واریانس داده‏ها‏ی مربوط به بازدهی آنزیم سویه والد و جهش یافته‏ها‏، وجود تفاوت معنی‏دار را نشان داد ‏(‏05/0P value<). بنابراین،‏‏‏‏ ‏بازدهی آنزیم در سویه‏ها‏ی N-0227 و U-1113 به ترتیب 6/57 و 7/49 درصد نسبت به سویه والد افزایش یافت. این نتایج به خوبی نشان می‏‏‏دهد که در ازای مقدار یکسان مواد موجود در محیط تولید، سویه‏ها‏ی جهش یافته نسبت به سویه والد، توانایی بیشتری در سنتز آنزیم داشته اند.

نتایج به دست آمده برای بهره‏وری‏‏ آنزیم در سویه والد ‏(‏SU.h^-1.mL^-1 22/8) ‏با نتایج داسیلویرا و همکاران ‏(‏SU.h^-1.mL^-1 88/8) ‏قابل مقایسه است ‏(‏11). این رقم در مورد جهش یافته‏ها‏ی N-0227و U-1113، به ترتیب 6/57 و 7/49 درصد نسبت به سویه والد افزایش یافت ‏(‏05/0p<). نتایج حاصل از محاسبه بهره‏وری‏‏ نشان داد که به ازای حجم تولید و زمان یکسان، تولید آنزیم توسط جهش یافته‏ها‏نسبت به سویه والد بیشتر است.

بر اساس مطالعات سکر و همکاران، روند تولید زیست توده در کپک ریزوموکور میه هی تا حدود 190 ساعت پس از تلقیح، به شکل‏‏ خطی و با آهنگی کمابیش یکنواخت ادامه یافته و پس از آن تقریبا ثابت می‏‏‏شود ‏(‏10). بنابراین،‏‏ نتایج به دست آمده با نتایج دلیما و همکاران منطبق است. به طوری که ضریب رشد ویژه در مطالعات آن‏ها‏ رقمی در حدود h^-1 13/2 محاسبه شد که با ضریب رشد ویژه اندازه‏گیری‏‏‏ شده برای سویه والد در این پژوهش ‏(‏h^-1 97/1) ‏قابل مقایسه است ‏(‏12).

در این طرح، ضریب رشد ویژه در N-0227در مقایسه با سویه والد، رقمی کم و بیش معادل بوده و اختلاف معنی‏داری ندارد ‏(‏05/0P value>). اما ضریب رشد ویژه جهش یافته ‏U-1113، حدود 6/9 درصد کاهش یافته است ‏(‏05/0P value<). به طوری که این مقدار از h^-1 97/1 در سویه والد به h^-1 78/1 در سویه جهش یافته U-1113 کاهش داشته است. با توجه به این که از یک سو القای جهش توسط تابش UV به طور تصادفی روی ساختار DNA تاثیرگذار است و از سوی دیگر برنامه انتخاب جهش یافته برتر، بر اساس فعالیت دلمه کنندگی بالا و فعالیت پروتئولیتیکی پائین آنزیم رنت تولیدی انجام گرفت، کاهش ضریب رشد ویژه توجیه می‏شود. هر چند مقدار این کاهش کمابیش ناچیز بوده است، اما با توجه به تحقق هدف اصلی طرح ‏(‏افزایش نسبت )‏، این مقدار کاهش در ضریب رشد ویژه در سویه U-1113 قابل چشم پوشی است.

به این ترتیب دستاورد‏ها‏ی این تحقیق به طور خلاصه به شرح زیر است‏‏‏:

• در این پژوهش، با استفاده از تکنیک جهش و انتخاب و با کاربرد دوز بهینه از عامل جهش‏زا‏‏ی اسید نیترو، ‏سویه ای از اصلاح و جهش یافته ای به نام
   ‏N-0227 ایجاد شد که فعالیت دلمه کنندگی رنت حاصل از آن، 6/57 درصد بیشتر بود.
• همچنین، با استفاده از تکنیک جهش و انتخاب و با کاربرد دوز بهینه از عامل جهش‏زا‏‏ی UV، ‏سویه ای از اصلاح و جهش یافته ای به نام ‏U-1113 ایجاد شد که فعالیت دلمه کنندگی رنت حاصل از آن، 7/49 درصد بیشتر بود.
• با توجه به این که فعالیت دلمه کنندگی افزایش و فعالیت پروتئولیتیکی تقریبا بدون تغییر بوده است، طبق محاسبات انجام گرفته نسبت  ‏رنت تولیدی در N-0227وU-1113، به ترتیب ‏6/62 و 1/61 درصد افزایش یافت. به این ترتیب کیفیت رنت تولید شده توسط سویه جهش یافته بیشتر بوده و رنت حاصل از آن برای فرآیند پنیرسازی مناسب تر است.
• جهش یافته‏ها‏ی یاد شده‏‏ برای تولید رنت، دارای بازدهی و بهره‏وری‏‏ بیشتری نسبت به سویه والد بودند. بدیهی است که استفاده از سویه ای با بازدهی و بهره‏وری‏‏ بیشتر، برای تولید صنعتی رنت مناسب‏تر است.

جدول 1- ‏مقایسه شاخص‏های سنجش شده برای سویه‏ها‏ی جهش یافته ‏نسبت به سویه والد

* ns: تغییر اندازه‏گیری‏‏‏ شده معنی‏دار نیست.