جداسازی و شناسایی سویه بومی قارچی Aspergillus niger ZRS14 با قابلیت تحمل پذیری بالا به یون روی و کاربرد سوپرناتانت آن در سنتز خارج سلولی نانو ذره اکسید روی

مقدمه

فناوری نانو درسه سطح تولید مواد، وسایل، دستگاه‏ها و سیستم‏ها‏ بکار گرفته می‏شود. آنچه باعث ظهور علم نانو فناوری شده، نسبت بالای سطح به حجم است که باعث شده مواد در مقیاس نانو شروع به تغییر رفتار کرده و رفتار سطح بر رفتار توده ای غلبه کند (1 و 2). در واقع در این مقیاس قوانین فیزیک کلاسیک از بین رفته و قوانین فیزیک کوانتومی وارد صحنه می‏شود. تقریبا وقتی به مقیاس نانو می‏رسیم خواص فیزیکی-شیمیایی و حتی رنگ، نقطه ذوب و خواص شیمیایی کاملا متحول می‏شود. افزایش نسبت سطح به حجم باعث می‏شود که اتم‏ها‏ی واقع در سطح نسبت به اتم‏ها‏ی درون حجم ذرات، اثر بیشتری روی خواص فیزیکی ذرات داشته باشند (3). این ویژگی واکنش پذیری ذرات را به شدت افزایش داده به گونه ای که این ذرات به شدت تمایل به آگلومراسیون دارند. مثلا نانوذرات فلزی به محض قرارگیری در برابر هوا به شدت اکسیده می‏شوند. از این خاصیت به‏عنوان واکنشگرهای شیمیایی بسیار قوی می‏توان استفاده کرد و یا در تولید کامپوزیت‏ها‏ با استفاده از این ذرات، می توان پیوندهای شیمیایی مستحکم‏تری بین ماده زمینه و ذرات برقرار نمود  که در این صورت استحکام کامپوزیت به شدت افزایش می‏یابد (4). افزایش نسبت سطح به حجم علاوه برافزایش واکنش پذیری ذرات، فشارسطحی را تغییر داده و باعث می‏شود که فاصله بین اتم‏ها‏ی ذرات با کاهش اندازه ذره کاهش یابد. البته این امر برای نانوذرات فلزی صادق است و درمورد نیمه‏‏ها‏دی‏ها و اکسیدهای فلزی با کاهش اندازه ذره فاصله بین اتم‏ها‏ افزایش می‏یابد. تغییر در فاصله بین اتم‏ها‏ی ذرات و نسبت بالای سطح به حجم تأثیرات متقابلی بر روی خواص نوری، مغناطیسی، الکترونیکی و ترمودینامیکی ماده خواهد داشت. نانوذرات که شامل: نانوذرات فلزی، نیمه‏ها‏دی‏ها و اکسیدهای فلزی هستند، به‏عنوان زیست واکنشگرهای[1] قدرتمند عمل نموده که راندمان واکنش‏ها‏ی شیمیایی را به شدت افزایش داده و همچنین، به میزان چشمگیری از تولید مواد زاید در واکنش‏ها‏ جلوگیری می‏کنند (2 و 4). بکارگیری نانوذرات در تولید مواد دیگر استحکام آن‏ها را افزایش داده، وزن آن‏ها را سبک کرده، مقاومت شیمیایی و حرارتی آن‏ها را بالا برده و واکنش آن‏ها را در برابر نور و تشعشعات دیگر تغییر می‏دهد. بنابراین، در تولید نانوکامپوزیت‏‏ها‏ استفاده می‏شوند (5 و 6). درسال‏‏ها‏ی اخیرکوشش‏‏ها‏ی بسیار زیادی برای تولید نانوذرات به علت خواص ویژه نوری، شیمیایی، الکتریکی و فوتو‏الکتریکی آن‏ها انجام شده است که موید استفاده‏‏ها‏ی گوناگون این مواد در زمینه‏‏ها‏یی چون کاتالیست‏ها‏، اپتیک، دانش داروهای زیستی، مکانیک، مغناطیس و انرژی است (7). روش‏های معمول فیزیکی- شیمیایی تولید نانوذرات اکسید روی شامل: رسوب فیزیکی بخار، چگالش گازخنثی، فرآیند سل- ژل (رسوب‌دهی محلول شیمیایی)، احیای الکتروشیمیایی، تجزیه نوری وحرارتی، میکرو امولسیون و احیای شیمیایی است (8، 9و 10). بیشتر تکنیک‏ها‏ی بالا با وجود سرعت بالا دارای معایبی از جمله هزینه بالا، مصرف مواد و انرژی بالا، آلودگی زیست محیطی و ایجاد ذرات بی کفایت (توزیع نامناسب ذرات و پایداری پایین) هستند. بنابراین، تقاضا برای پیشبرد روش‏ها‏ی سنتزی کم هزینه، مطمئن و محافظ محیط زیست وجود دارد و این امر نقش روش‏ها‏ی زیستی تولید نانوذرات را پر رنگ تر می کند (4 و 11). سیستم‏ها‏ی زیستی از قبیل گیاهان، جلبک‏ها‏، کپک‏ها‏ی رشته ای، مخمرها و باکتری‏ها قادر به تولید نانوذرات فلزی هستند که در این میان قارچ‏های رشته ای به علت وجود مقادیر در خور توجهی از آنزیم‏‏ها‏ و پروتئین‏ها‏ی ترشحی ویژه دراین میکروارگانیسم‏ها‏، سهولت کار با آن‏ها در آزمایشگاه، سهولت دسترسی به مقادیر زیادی توده زیستی[2] و شاید از همه مهمتر فرآیند پردازش پایین دستی[3]‌ ساده از جذابیت بالاتری برخوردار هستند (12 و 13). مزایای تولید زیستی نانوذرات برتولید شیمیایی عبارتند از: تمیز بودن بسیاربالا، سازگاری بالا با محیط زیست، توزیع مناسب ذرات[4]، پایداری بالا، انعطاف‏پذیری بیشتر، انتشار نور بهتر و آسانی تولید است (14). نانوذره روی از عناصر پایه علم نانو است که به علت کاربرد‏ها‏ی فراوان آن در صنایع مختلف مورد توجه قرار گرفته است. با توجه به ویژگی‏های نوری و الکتریکی منحصر بفرد نانوذره اکسید روی، از این نانوذره در پوشش‏ها‏ی رسانای اکسیدی با قابلیت عبور دهی بالا برای سلول‏ها‏ی خورشیدی، حسگر‏ها‏ی گازی، آشکار ساز‏ها‏ی نوری فرابنفش، جاذب شیمیایی، کاتالیست‏ها‏یی برای هیدروژن دار کردن در فاز مایع و کاتالیست‏ها‏یی برای تخریب نوری به جای نانو ذره‏ها‏ی تیتانیوم نام برد (15 و 16). از نانوذرات اکسید روی همچنین به‏عنوان واکنشگرهای شیمیایی بسیار قوی برای افزایش بازده واکنش‏ها‏ی شیمیایی، تولید نانوکامپوزیت‏ها‏ و ساخت شیشه‏ها‏ی ضد آفتاب استفاده می‏شود (17). در دو دهه گذشته مطالعات زیادی برای تولید میکروبی نانوذرات فلزی (طلا، نقره، روی، منگنز، مس، کروم و پلاتینیوم)، نیمه‏ها‏دی‏ها (سولفید روی، سولفید کادمیوم، سولفید سرب و سولفید آهن) و اکسیدهای فلزی (زیرکونیوم، اکسید منگنز، مگنتیت و اکسید اورانیوم) انجام شده که به شناسایی میکروارگانیسم‏ها‏ی مختلف شامل: باکتری‏ها‏، قارچ‏ها‏ی رشته ای و مخمرهایی از قبیل
 Bacillus subtilis, Pseudomonas stutzeri
Lactobacillus sp., Klebsiella sp., Escherichia coli
Rhodococcus sp., Thermoanerobacter sp.
Shewanella sp., Candida sp., Torulopsis sp.
Fusarium sp., Streptomyces sp.و
Aspergillus sp.منتهی شده است (4 و 6). طلا و نقره از مهم‏ترین فلزاتی هستند که بیش‏ترین تحقیقات را در این زمینه به خود اختصاص داده اند. با این حال، در ارتباط با تولید زیستی نانوذرات فلزی روی مطالعات بسیار کمی در سطح جهانی انجام شده است که در این ارتباط می توان به مطالعات پراساد[5] و ژا[6] و جاین[7] و همکارانش در رابطه با تولید نانوذرات اکسید روی به ترتیب در سویه‏ها‏یی از Lactobacillus sporogenes و Aspergillus aeneus اشاره نمود (11 و 18). هدف از تحقیق حاضر، تولید نانوذرات اکسید روی با هدف معرفی یک سویه بومی کارآمد برای تولید نانوذرات اکسید فلزی روی بوده است. در این راستا، سنتز خارج سلولی نانوذرات اکسید روی در سویه بومی غربال‏گری شده A. niger isolate ZRS14 گزارش شد.

مواد و روش‏ها‏

مواد شیمیایی و محیط‏ها‏ی کشت استفاده شده

نمک استات روی دو آبه[8] با خلوص 98 درصد از شرکت سیگما- آلدریچ[9] خریداری شد. محلول‏های استوک روی در آب مقطر حل شده و بعد از فیلتراسیون به‏وسیله فیلترهای سرنگی 22/0 میکرونی در دمای 4 درجه سانتی‏گراد و در تاریکی نگهداری شدند. محیط‏ها‏ی کشت جامد و مایع سیب زمینی دکستروز آگار[10] و براث[11] حاوی 4 گرم در لیتر عصاره خیسانده سیب زمینی، 20 گرم در لیتر گلوکز و 15 گرم در لیتر آگار با اسیدیته برابر 6/5، از شرکت مرک[12] خریداری شد. آنتی بیوتیک کلرامفنیکل از کمپانی هایمدیا[13] تهیه شد. محلول استوک کلرامفنیکل (mg/l34) در اتانول تهیه و سپس توسط فیلترهای غشایی میلی‏پور استریل شده و تا زمان استفاده در فریزر منهای 20 درجه سانتی‏گراد نگهداری شد. بیشتر مواد استفاده شده در واکنش زنجیره ای پلیمرآز از شرکت سیناژن[14] تهیه شد. سایر مواد شیمیایی استفاده شده با درجه خلوص بالا بودند. در تمامی مراحل آزمایش‏های مربوط به سنتز زیستی نانوذرات اکسید روی از آب مقطر دو بار تقطیر استفاده شد.

روش نمونه­گیری و غربال‏گری سویه‏ها‏ی قارچی تحمل پذیر به فلز سمی روی

برای جداسازی سویه‏ها‏ی قارچی با پتانسیل تحمل پذیری به یون روی، نمونه‏ها‏ی خاک از معادن روی و سرب انگوران، واقع در استان زنجان، جمع آوری شد. نمونه برداری در ظروف استریل انجام شد. نمونه­ها سریعا به آزمایشگاه انتقال داده و تا زمان استفاده در یخچال 4 درجه سانتی‏گراد نگهداری شدند. از نمونه‏ها‏ی خاک جمع آوری شده سری رقت از ^1-10 تا ^6-10تهیه شد. از هر رقت 300 میکرولیتر در محیط‏ها‏ی کشت PDA آگار حاوی 100 میلی گرم در لیتر یون روی به روش کشت چمنی [15]با میله ی سرکج کشت داده و پلیت‏ها‏ی مذکور به مدت 5 روز تحت شرایط تاریکی در انکوباتور 28 درجه سانتی‏گراد گرماگذاری شدند. برای جلوگیری از آلودگی‏ها‏ی باکتریایی به محیط‏ها‏ی کشت اتوکلاو شده، آنتی بیوتیک کلرامفنیکل در غلظت نهایی10 میلی‏گرم در لیتر اضافه شد. پس از حدود 5 روز کلونی‏ها‏ی ظاهر شده روی پلیت‏ها‏ خالص‏سازی شدند. سپس تک اسپور کردن کلونی‏ها‏ی خالص‏سازی شده انجام شد تا قارچ‏هایی خالص و حاصل از یک اسپور به دست آیند. شناسایی اولیه سویه‏ها‏ی قارچی جدا شده براساس ویژگی‏های رشد بر روی محیط‏های کشت جامد، ظاهر میکروسکوپی آن‏ها و همچنین خصوصیات ریخت شناسی آن‏ها انجام شد (19).

پروفایل تحمل پذیری سویه‏ها‏ی قارچی غربال‏گری شده نسبت به یون سمی روی

تحمل پذیری سویه‏ها‏ی قارچی غربال‏گری شده با روش رقت در آگار تعیین شد (20). برای این منظور به ارلن‏ها‏ی 250 میلی‏لیتری حاوی 30 میلی‏لیتر از محیط‏ها‏ی کشت کمپلکس PDA و سنتتیک M9 با اندکی تغییرات (21) (گلوکز 5 گرم در لیتر، کلرید آمونیوم 5/2 گرم در لیتر، سولفات منیزیم هفت آبه 5/0 گرم در لیتر، سدیم کلراید 5/0 گرم در لیتر، کلرید کلسیم 015/0 گرم در لیتر، سولفات آهن هفت آبه 03/0 گرم در لیتر و بافر نمکی فسفات 100میلی مولاری با اسیدیته برابر 6/5)، غلظت‏ها‏ی خاصی از یون روی (250، 500، 750، 1000، 1250، 1500، 1750 و 2000 میلی گرم در لیتر) بصورت جداگانه اضافه شده و داخل پلیت‏ها‏ی شیشه ای به قطر 10 سانتی‏متر ریخته شد. سپس به‏وسیله سمپلر، 100 میکرولیتر از سوسپانسیون قارچی ازمحیط مایع PDB که قارچ مورد نظر درآن رشد کرده (رشد لگاریتمی) و تراکم آن cfu/ml10⁶× 5/1، با دانسیته سلولی[16] برابر 12/0بود، به‏عنوان مایه تلقیح[17] استاندارد بصورت کشت نقطه ای بر روی محیط‏ها‏ی کشت محتوی آگار کمپلکس و سنتتیک، قرار گرفت. پلیت‏ها‏ پس از 7 روز گرما گذاری در 28 درجه سانتی‏گراد در تاریکی، مطالعه شدند. از محیط‏ها‏ی کشت تلقیح شده فاقد یون روی، به‏عنوان کنترل استفاده شد. تمامی آزمایش‏ها سه بار متوالی تکرار شدند.

شناسایی سویه قارچی ZNRS14 با استفاده از روش‏ها‏ی ریخت‏شناسی و مولکولی

شناسایی اولیه سویه قارچی ZRS14 براساس مشاهدات ماکروسکوپی، مشاهدات میکروسکوپی و بررسی شاخص‏های ریخت شناسی مختلف از جمله رنگ، ساختار میسیلیوم، الگوی تشیکل اسپور، نحوه استقرار هیف‏ها‏ و مشاهده انشعابات هیف‏ها‏ انجام شد (19). سپس، برای تایید دقیق جنس و گونه سویه مذکور از تعیین ترادف ژن rDNA استفاده شد. استخراج DNA ژنومی سویه ZRS14 به روش تخریب با کمک ازت مایع و با استفاده از کیت استخراج DNA (کمپانی هایمدیا) انجام شد. به منظور استخراج DNA از سویه قارچی ZRS14، قارچ مورد نظر در محیط کشت PDB کشت داده شد. پس از جداسازی میسیلیوم از محیط کشت با استفاده از سانتریفیوژ یخچالی (g×3000، 10 دقیقه، 4 درجه سانتی‏گراد) و شستشوی آن با آب مقطر استریل، توده میسیلیومی جمع آوری شده به کمک ازت مایع خرد و سپس استخراج DNA به کمک کیت استخراج DNA مخصوص قارچ‏ها، طبق دستورالعمل شرکت سازنده کیت انجام شد. پس از تعیین کیفیت و کمیت DNA استخراجی به کمک روش‏‏ها‏ی اسپکتروفتومتری و الکتروفورز، DNA استخراج شده مورد آزمون PCR اختصاصی با استفاده از دو پرایمر همه گانی ITS3 (پرایمر رفت)
[5^ʹ- gcatcgatgaagaacgcagc-3^ʹ] و ITS4
(پرایمر برگشتی) [5^ʹ-tcctccgctttattgatatgc-3^ʹ]
که برای نواحی حفاظت شده ژن‏های ریبوزومی 18S و 28S طراحی شده اند، و بخش کاملی از زیر واحد ریبوزومی 5.8S و همچنین، نواحی غیرکدینگ ITS2 را تکثیر می دهند، قرار گرفت (22). واکنش PCR در حجم نهایی 50 میکرولیتر مخلوط واکنش متشکل از 300 نانوگرم DNA الگو (با غلظت 1میکروگرم بر میکرولیتر)، 5 میکرولیتر بافر PºR 10X با غلظت برابر 1X، 2 میکرولیتر MgCl₂ با غلظت برابر 50 میلی مولار، 2/0 میکرولیتر از هر کدام از پرایمرها با غلظت 125 میکرومولار، 4 میکرولیتر از نوکلئوتیدهای چهارگانه (با غلظت 5/2 میلی مولار)، 2/0 میکرولیتر از آنزیم Taq پلیمراز (با غلظت U 5 (و مابقی آب مخصوص PCR تا حجم نهایی 50 میکرولیتر، با استفاده از دستگاه ترموسایکلر اپندورف انجام شد. برنامه تکثیری با واسرشت اولیه[18] در دمای 94 درجه سانتی‏گراد به مدت 4 دقیقه، سپس 30 سیکل بصورت واسرشت شدن در دمای 94 درجه سانتی‏گراد به مدت 30 ثانیه، چسبیدن پرایمر[19] به DNA ژنومی در دمای 54 درجه سانتی‏گراد به مدت 30 ثانیه و تکثیر DNA در دمای 72 درجه سانتی‏گراد به مدت 45 ثانیه انجام شد. بسط نهایی[20] در دمای 72 درجه سانتی‏گراد به مدت 5 دقیقه انجام شد. پس از انجام شدن PCR، محصول برروی ژل آگاروز 5/1 درصد در شرایط بافری TAE تحت تاثیر ولتاژ 80 ولت به مدت 60 دقیقه الکتروفورز شد. محصول حاصل از PCR (تقریبا 350 جفت باز) با استفاده از کیت تخلیص محصول PCR شرکت فرمنتاز[21]، تخلیص و برای تعیین توالی به شرکت فزاپژوه برای ارسال به کمپانی ماکروژن[22] کره جنوبی ارسال شد. برای شناسایی توالی‏ها‏ از برنامه‏ها‏ی Finch TV وBioEdit و برای بررسی و تحلیل‏ توالی‏ها‏ از الگوریتم بلاست کردن در بانک جهانی اطلاعات ژنی[23] استفاده شد. پس از مطابقت توالی‏ها‏ی نوکلئوتیدی شناسایی شده با ترادف‏ها‏ی موجود در بانک ژنی، با استفاده از نرم افزار مگا[24] درخت فیلوژنیکی سویه قارچی غربال‏گری شده رسم شد (23).

سنتز خارج سلولی نانوذرات اکسید روی توسط سویه قارچی ZRS14

10 میلی گرم از اسپورهای غیرجنسی سویه قارچی ZRS14، برداشت شده از یک کشت 14 روزه بر روی محیط PDA، به یک محلول نمکی استریل حاوی 1/0 درصد تویین 80 و 85/0 درصد نمک سدیم کلراید منتقل شده و به مدت 2 ساعت بر روی یک شیکر دورانی با سرعت rpm 200 هم‏زده شد. پس از شمارش در زیر میکروسکوپ حدود یک میلی لیتر از غلظت اسپور مورد نظر (spores/ml10⁶ ×1) به 100 میلی‏لیتر محیط کشت مایع PDB درون فلاسک‏ها‏ی 250 میلی‏لیتری و تحت شرایط دمایی 28 درجه سانتی‏گراد و بر روی شیکر دورانی با سرعت rpm150به مدت 72 ساعت گرماگذاری شد. برای جدا کردن توده میسیلیوم قارچی از محیط کشت مایع PDB، از سانتریفیوژ یخچالی با دور rpm 5000 در دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‏گراد به مدت 10 دقیقه استفاده شد. پس از سه بار شستشو با آب دو بار تقطیر استریل، 20 گرم از توده زیستی مذکور در ارلن‏ها‏ی 250 میلی لیتری که حاوی 100 میلی لیتر آب دو بار تقطیر استریل بود، ریخته و به مدت 72 ساعت در شیکر انکوباتوردار در دمای 28 درجه سانتی‏گراد و دور شیکر rpm150 قرار داده شد. پس از طی دوره گرماگذاری، توده قارچی با استفاده از فیلتراسیون به کمک کاغذ صافی واتمن جدا شد. پس از جمع آوری، از سوپرناتانت عاری از میسیلوم قارچ ZRS14 به‏عنوان بیوکاتالیزور، برای سنتز زیستی نانوذرات اکسید روی استفاده شد. برای این منظور به فلاسک‏ها‏ی 250 میلی لیتری حاوی 100 میلی لیتر از سوپرناتانت برداشت شده قارچی، محلول استات روی (با غلظت نهایی 250 میلی گرم در لیتر یون روی) اضافه و به مدت 72 ساعت تحت شرایط دمایی 28 درجه سانتی‏گراد و دور شیکر rpm150 گرماگذاری شد. بطور همزمان از محلول استات روی (بدون تلقیح سوپرناتانت قارچ ZRS14) به‏عنوان محیط کنترل استفاده شد.

مشخصه یابی نانوذرات اکسید روی تشکیل شده

تشخیص نانوذرات اکسید روی تشیکل شده در محلول واکنش زیست تبدیلی، ابتدا با استفاده از مشاهدات چشمی از طریق تغییر رنگ محلول واکنش انجام شد. سپس برای تایید مشاهدات چشمی از تکنیک‏ها‏ی [25]UV-vis، تحلیل طیف پراکندگی عنصری اشعه ایکس[26] و همچنین تصویر برداری با میکروسکوپ الکترونی SEM[27] استفاده شد. در مرحله اول، شکل گیری نانو ذرات اکسید روی با مشاهده تغییر رنگ محلول واکنش حاوی سوپرناتانت سویه قارچی ZRS14 و محلول استات روی مشخص شد. به منظور تعیین طیف جذبی محلول رویی حاصل از سانتریفیوژ، نمونه‏ها‏ با سرعت g×3000 به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‏گراد سانتریفیوژ شدند. سپس، تحلیل‏های پراش پرتو ایکس با استفاده از XRD و مشاهدات میکروسکوپی با استفاده از میکروسکوپ الکترونی SEM با هدف بررسی وضعیت نانو کریستال‏های تشیکل شده و همچنین بررسی ریخت‏شناسی آن‏ها انجام شد. برای این منظور، ابتدا سوپرناتانت عاری از کشت قارچی از فیلترهای سرنگی 22/0 میکرونی عبور داده شد و سپس با هدف رسوب نانو ذرات اکسید روی، نمونه‏ها‏ با سرعت ×g 15000 به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‏گراد، سانتریفیوژ شدند. پس از شستشوی رسوب حاصل با آب مقطر دو بار تقطیر استریل، نمونه‏ها‏ در آون 50 درجه سانتی‏گراد به مدت 24 ساعت خشک و تحلیل شدند.

نتایج

جداسازی و غربال‏گری سویه‏ها‏ی قارچی با پتانسیل تحمل پذیری بالا به یون روی

با توجه به سمیت یون روی بر روی سلول‏ها‏ی میکروبی، شناسایی و تشخیص سویه‏ها‏ی میکروبی با پتانسیل تحمل پذیری بالا به یون سمی روی، می‏تواند به‏عنوان گام نخست ما را به گزینش سویه برتر هدایت کند. در این راستا، 15 سویه قارچی (نام‏گذاری شده تحت عنوان ZRS1-ZRS15) براساس مشاهدات میکروسکوپی، ماکروسکوپی و آزمایش‏های ریخت‏شناسی تشخیصی اولیه، از خاک‏های معادن روی و سرب انگوران زنجان، براساس تکنیک غنی سازی انتخابی، جدا سازی شدند. پروفایل تحمل پذیری ذاتی سویه‏‏ها‏ی قارچی جدا شده نسبت به یون سمی روی، در محیط‏ها‏ی کمپلکس و سنتتیک با روش رقت در آگار تعیین شد (شکل 1). همانگونه که در شکل 1 مشاهده می شود، میزان تحمل پذیری سویه‏ها‏ی بومی قارچی جدا شده در محیط‏ها‏ی سنتتیک و کمپلکس به ترتیب بین 250 تا 1750 میلی گرم در لیتر و 500 تا 2000 میلی‏گرم در لیتر تعیین شد. در بین سویه‏ها‏ی مذکور، سویه قارچی ZRS14 که بیشترین میزان تحمل پذیری را نسبت به یون سمی روی هم در محیط‏ها‏ی کمپلکس (بالاتر از 2000 میلی گرم در لیتر) و هم در محیط‏ها‏ی سنتتیک (بالاتر از 1750 میلی گرم در لیتر) را نشان داد، به‏عنوان سویه برتر مورد مطالعات فنوتیپی و مولکولی برای تعیین هویت از نظر جنس و گونه قرار گرفت.

شناسایی ریخت شناسی و مولکولی سویه قارچی ZRS14

سویه ZRS14 که براساس تحلیل‏ پروفایل تحمل‏پذیری دارای بیش‏ترین تحمل پذیری به یون سمی روی بود انتخاب و براساس ویژگی‏ها‏ی ریخت شناسی تشخیصی متداول قارچ‏ها شناسایی شد (19) و به‏طور موقت به‏عنوان Aspergillus niger تشخیص داده شد. ویژگی‏های ریخت‏شناسی و کشتی این سویه در شکل 2 نشان داده شده است. سویه ZRS14، از نظر ماکروسکوپی، دارای کلونی کرکی و سیاه رنگ، اسپورهای غیر جنسی گرد و همچنین از نظر شکل ظاهری دارای میسیلیوم با تیغه میانی و کونیدیوفور است که بر روی آن وزیکول تقریبا گرد قرار گرفته است. شکل‏ها‏ی میسلیومی بسته به شرایط فیزیکی- شیمیایی موجود در کشت می تواند به اشکال رشته ای و گلوله ای با انشعابات هیفی مشاهده شود (شکل 2).

شکل 1- پروفایل تحمل پذیری به یون روی در سویه های قارچی جدا شده از خاک‏های معادن روی و سرب

شکل 2- ویژگی‏های ریخت شناسی سویه قارچی A. niger ZRS14.

A: شکل میکروسکوپی اسپور غیر جنسی سویه ZRS14 B1 وB2: اشکال میکروسکوپی میسیلیوم های سویه ZRS14 به ترتیب بعد از 48 ساعت رشد در محیط PDB حاوی 250 میلی گرم در لیتر یون روی و PDB بدون یون روی و C: رشد سویه ZRS14 در محیط کشت جامد PDA.

شکل 3- الکتروفورز محصول PCR ژنوم سویه قارچی ZRS14. ستون 1: سویه ZRS14، ستون 2: شاهد مثبت (Aspergillus niger PTCC1243)، ستون 3: شاهد منفی.

همانگونه که در شکل 3 مشاهده می‏شود، محصول PCR در ناحیه 350 جفت بازی نمایان شده است که حکایت از خلوص DNA مورد استفاده برای تعیین توالی دارد. پس از مشخص شدن توالی ژن سویه مذکور و بلاست نمودن آن در سایت اینترنتی NCBI، قارچ مورد نظر تعیین هویت شد. براساس نتایج حاصل از بلاست این سویه دارای مشابهت 6/98 درصدی با گونه ثبت شده Aspergillus niger (با شماره دسترسیKC763981 در سایت اینترنتی NCBI) است. در ادامه با ترسیم درختچه فیلوژنی بر پایه روش neighbor-joinig با استفاده از نرم افزار MEGA-4 مشخص شد که این سویه در میان گونه‏ها‏ی ثبت شده نزدیک‏ترین شباهت ژنتیکی را با گونهAspergillus nigerدارد. درختچه فیلوژنی سویه قارچی ZRS14 در شکل4 نشان داده شده است.

شکل 4- درخت فیلوژنتیک سویه قارچی ZRS14 رسم شده به روشNeibour-joining که با گونه های مربوط در جنس Aspergillus نزدیکی نشان داد. درخت فیلوژنتیک با الگوریتم دو پارامتری کیمورا ترسیم شد. بررسی اعتبار شاخه­های درخت با استفاده الگوریتم Bootstrap analysis و با 100 بار نمونه­گیری انجام شد. اعداد داخل پرانتز به شماره ژنی قابل دستیابی در بانک اطلاعات ژنی NCBI مربوط است. Aspergillus flavus به عنوان outgroup قرار داده شد.

کاربرد سوپرناتانت Aspergillus niger isolate ZRS14 در تولید خارج سلولی نانوذرات اکسید روی

سوپرناتانت عاری از میسیلیوم قارچ Aspergillus niger strain ZRS14، دارای تحمل پذیری بالا نسبت به یون روی، قادر به سنتز نانوذرات اکسید روی، در غلظت 250 میلی گرم در لیتر از یون سمی روی بود که با ایجاد تغییر رنگ محلول واکنش زیست تبدیلی از سفید به شیری شناسایی شد. در محلول کنترل (استات روی عاری از سوپرناتانت) هیچ تغییر رنگی در محلول واکنش مشاهده نشد (شکل 5). نمایان شدن رنگ شیری پس از واکنش زیست تبدیلی با استات روی بیانگر کاهش یون روی و تشکیل نانوذرات اکسید روی است. نانوذرات اکسید روی به علت تحریک ارتعاشات پلاسمون سطح بسته به اندازه ذرات تشکیل شده و همچنین ریخت‏شناسی آن‏ها، به رنگ سفید متمایل به شیری تا زرد هستند و همین ابزاری ساده و مناسب برای تایید اولیه نانوذرات اکسید روی در محلول واکنش زیست تبدیلی می‏باشند (24 و 25).

شکل 5- محلول های استات روی (غلظت یون روی 250 میلی‏گرم در لیتر) بدنبال اضافه کردن سوپرناتانت عاری از توده میسیلومی قارچی A. niger isolate ZRS14 در ابتدای واکنش (A)، پس از 72 ساعت واکنش زیست تبدیلی (B) و در محلول کنترل (C) ] عاری از سوپرناتانت قارچی[ بر روی شیکر مدور (150 دور در دقیقه)

در ادامه تحلیل‏ نمونه‏ها‏ با اسپکتروفتومتری UV-vis، مربوط به پلاسمون رزونانس سطحی[28] نانوذرات، یک پیک جذبی مشخص را در طول موج 380 نانومتر (پیک اختصاصی برای نانوذرات اکسید روی) را نشان داد که براساس منابع معتبر بیانگر وجود نانوذرات روی در محلول واکنش زیست تبدیلی است (18، 24 و 25). در محلول کنترل (عاری از سوپرناتانت قارچی)، در طول موج‏ها‏ی بین 240 تا 520 نانومتر هیچ پیک جذبی مشاهده نشد (شکل6).

شکل 6- طیف های جذبی UV-vis حاصل از واکنش زیستی سوپرناتانت قارچی A. niger isolate ZRS14 با محلول استات روی. (A) محیط کنترل (محلول استات روی فاقد سوپرناتانت قارچی) و (B) محلول استات روی تلقیح شده با سوپرناتانت قارچی بعد از 72 ساعت واکنش زیست تبدیلی.

در ادامه این پژوهش، تحلیل XRD به منظور اثبات نانوکریستال‏ها‏ی فلزی اکسید روی انجام شد. براساس نتایج بدست آمده که در شکل (7) نشان داده شده است، نانوذرات کریستالی اکسید روی در سطوح 100، 002، 101،102، 110، 103 و 112 پیک‏ها‏ی را نشان داد که با نمونه استاندارد نانوکریستال‏ها‏ی اکسید روی کاملا همخوانی دارد (11 و 26).

شکل7- الگوی XRD نانوذره اکسید روی که در محلول واکنش زیست تبدیلی توسط سوپرناتانت قارچی A. niger isolate ZRS14 ساخته شده است.

 تصاویر به‏دست آمده از میکروسکوپ الکترونی SEM نیز سنتز نانوذرات اکسید روی با توزیع کمابیش باریک اندازه ذرات و متوسط اندازه ذرات 32 نانومتر و اشکال کروی را نشان داد (شکل 8).

شکل 8- میکروگراف های SEM حاصل از نانوذرات اکسید روی سنتز شده توسط سویه قارچی Aspergillus niger strain ZRS14.