بهینه سازی تولید میکروبی صمغ زانتان توسط زانتاموناس کمپستریس با استفاده از نشاسته هیدرولیز شده

مقدمه

صمغ زانتان هتروپلی­ساکارید برون سلولی است که درون آب محلول است و به شکل صنعتی از ساکارز و گلوکز طی فرآیند تخمیری با سویه های میکروبی زانتاموناس به ویژه زانتاموناس کمپستریس تولید می‏شود (5 و 7). با توجه به خواص تغییر شکل متنوع، زانتان در صنایع گوناگونی همچون صنایع غذایی، آرایشی و تزئینی، داروسازی، افزایش بازیافت نفت به عنوان غلیظ کننده، پایدار کننده و معلق کننده استفاده می‏شود (2 و 5). فرآیندهای پایین دستی در جداسازی زانتان و خالص کردن آن با هزینه بسیار بالا، حدود 50 درصد هزینه تمام شده است‏‏ (15). بنابراین، یکی از راه­ها، استفاده از منابع کربن ارزان قیمت برای کاهش هزینه کلی تولید است. مطالعات زیادی بر روی کاهش هزینه تولید با استفاده از منابع متنوع کربن همچون ملاس چغندر قند، ملاس نیشکر، آب­پنیر، ضایعات میوه (مرکبات، فندق، خرما) انجام گرفته است (3، 4، 8، 9،10 و 12). میزان تولید جهانی صمغ زانتان حدود 30000 تن با ارزشی حدود 408 میلیون دلار است. این میزان تولید با رشدی حدود 5 تا 10 درصد روبه­رو است (2، 3 و 9). در این مقاله، برای کاهش هزینه­های تولید و افزایش بازده تولید برای استفاده این بسپار در صنایع غذایی، از نشاسته هیدرولیزی برای تولید زانتان توسط باکتری زانتاموناس کمپستریس استفاده شده است. برای بهینه‌سازی میزان تولید زانتان از روش آماری سطح پاسخ نقطه مرکزی (CCD) که دو عامل زمان و غلظت منبع کربن را در نظر گرفته است، استفاده شد. منبع کربن استفاده شده در این تحقیق نشاسته بوده که منبعی ارزان و قابل دسترس است.

مواد و روش‏ها

میکروارگانیسم و شرایط رشد

سویه استاندارد زانتاموناس کمپستریس PTCC1473 از کلکسیون میکروبی سازمان پژوهش­های علمی و صنعتی ایران به شکل لیوفیلیزه خریداری شذ. این سویه بر روی محیط کشت GYC حاوی 20 گرم بر لیتر گلوکز، 20 گرم بر لیتر کلسیم­کربنات، 17 گرم بر لیتر آگار و 10 گرم بر لیتر عصاره مخمر به مدت 48 ساعت در دمای 28 درجه سانتی‏گراد کشت داده شد.

مایه تلقیح

برای رسیدن به یک توده­ی میکروبی مناسب برای استفاده در فرآیند تخمیری، از محیط کشت YPD حاوی 20 گرم بر لیتر گلوکز، 20 گرم بر لیتر پپتون، 10 گرم بر لیتر عصاره مخمر استفاده شد. 100 میلی‌لیتر از محیط کشت داخل یک فلاسک 500 میلی‌لیتری ریخته و پس از اتوکلاو شدن، از محیط کشت GYC مقدار 4 لوپ به این محیط کشت تلقیح شد. محیط کشت در دمای 30 درجه سانتی‏گراد و در دور 200 دور بر دقیقه به مدت 24 ساعت گرمادهی شد (3). در این زمان با توجه به این‏که سویه در فاز لگاریتمی رشد بوده بهترین زمان برای تلقیح اولیه است. از مایه تلقیح به دست آمده به عنوان مایه تلقیح آزمایش‌های اصلی به میزان 5 درصد(حجمی/حجمی)استفاده شد (7).

فرآیندتخمیر

آزمایش با درصد­های مختلف از منبع کربن (نشاسته هیدرولیزی) که با توجه به تحلیل آماری در سه سطح اصلی (80، 50 و 20 گرم بر لیتر) و دو سطح اضافه (57/7 و43/92 گرم بر لیتر) مشخص شده بود توسط نرم‏افزار و مقادیر ثابت محیط کشت (گرم بر لیتر) انجام شد. این مقادیر ثابت عبارتند از: پتاسیم دی‏هیدروژن‏فسفات: 2، سولفات منیزم: 2/0، نیترات‏آمونیم: 2، سیتریک اسید:2، بوریک اسید: 0006/0، کلرید روی: 0006/0، کلرید آهن: 0024/0، کربنات کلسیم:02/0. اسیدیته‏ محیط کشت با افزودن NaOH(1M) به 2/7 رسانده (4 و 11) و محیط کشت در دمای 115 درجه سانتی‏گراد و به مدت 10 دقیقه اتوکلاو شد.

هیدرولیز نشاسته

 نشاسته (آرد گندم) خشک شده به نسبت 1:5 در آب مخلوط شد. پس از رساندن اسیدیته‏ به 5/5 توسط کلریدریک اسید یک مولار، آنزیم آلفا آمیلاز با نسبت 0002/0 درصد حجمی به نشاسته اضافه و پس از دو ساعت هم‏زدن در حمام 90 درجه سانتی‏گراد، دمای محلول به 65 درجه سانتی‏گراد رسانده شد. سپس برای مرحله قند‏سازی، اسیدیته‏ محلول در 5/4 تنظیم و 0002/0 درصد حجمی آنزیم گلوکوآمیلاز به آن اضافه شد. سپس این محلول در یک شیکر انکوباتور با دور متوسط (120 دور بر دقیقه) به مدت 20 ساعت در دمای 65 درجه سانتی‏گراد گرماگذاری شد (14). در پایان، محلول سانتریفیوژ شده و مایع رویی در دمای 4 درجه سانتی‏گراد نگه داشته شد. غلظت نشاسته در این محلول 20 درصد است که با رقیق کردن آن غلظت‏های 2، 5 و 8 درصد برای استفاده در محیط کشت به دست آمد.

برآورد میزان تولید سلولی

سلول­ها پس از سانتریفیوژ در دور15000 دور بر دقیقه به مدت 25 دقیقه و در دمای 4 درجه سانتی‏گراد از مایع­رویی که برای جداسازی زانتان استفاده می­شود، جدا شده و از اتانول برای جداسازی بقایای زانتان موجود به مدت 10 دقیقه در دور 10000 دور بر دقیقه سانتریفیوژ استفاده شد. سلول­ها درون آون به مدت 3 ساعت در دمای 105 درجه سانتی‏گراد خشک شد. سپس وزن خشک سلول با توزین ظرف حاوی سلول و ظرف خالی توسط ترازو (دقت 00001/0 گرم) و کسر ایندو وزن از یکدیگر تخمین زده شد (3).

تولید زانتان

صمغ زانتان توسط فرآیند هوازی به شکل ناپیوسته درون ارلن و دمای30 درجه سانتی‏گراد در دور 200 دور بر دقیقه و به مدت 56 ساعت انجام شد. محیط کشت به دست آمده به مدت 25 دقیقه در دور 15000 دور بر دقیقه و دمای 4 درجه سانتی‏گراد سانتریفیوژ شد. مقدار 5/0 میلی‏لیتر از مایع رویی بدون سلول میکروبی درون میکروتیوب 5/1 میلی­لیتر ریخته و مقدار یک میلی­لیتر ایزوپروپانول حاوی یک درصد نمک کلسیم کلراید به آن اضافه شد (7). پس از سانتریفیوژ به مدت 30 دقیقه در دور 15000 دور بر دقیقه و دمای 4 درجه سانتی‏گراد، پلیمر رسوب کرده در ته ظرف به مدت 48 ساعت در دمای50 درجه سانتی‏گراد خشک شد. به علت مدت زمان زیاد فرآیند خشک شدن و دمای متوسط خشک شدن زانتان، رطوبتی که موجب خطای تخمین زانتان شود وجود ندارد. ‏میزان تولید زانتان بر اساس اختلاف وزن میکروتیوب قبل از ریختن مواد و پس از خشک شدن بر اساس گرم بر لیتر توسط ترازو (دقت 00001/0 گرم) محاسبه شد.

طراحی آزمایش‌ها

آزمایش‌ها بر پایه دو عامل زمان و غلظت منبع کربن، طراحی شد. عامل زمان در سه سطح 24، 36 و 48 ساعت و غلظت منبع کربن نیز در سه سطح 20، 50 و 80 گرم بر لیتر بررسی شد. این طرح بر اساس روش آزمایشی طراحی نقطه مرکزی (CCD) و با استفاده از نرم افزاز Minitab16 انجام شد. به طور کلی، 13 آزمایش با در نظر گرفتن نقاط مرکزی و تکرار آن‏ها انجام شد. آزمایش‌ها به شکل تصادفی انجام شد تا کم‏ترین مقدار خطا را داشته باشد. در جدول (1) سطوح متغیرها همراه با مقادیر زانتان تولیدی نشان داده شده است.

جدول ‏1- نوع طراحی آزمایش و مقادیر تولیدی صمغ زانتان

نتایج

در بهینه­سازی فرآیند تولید صمغ زانتان، پس از انجام آزمایش بر اساس طرح آماری تنظیم شده در جدول 1، نتایج مربوط به پاسخ­های به دست آمده در هر یک از شرایط آزمایشی تعریف شده مطابق جدول 2 به دست آمد.

با توجه به نتایج به دست آمده از آزمایش­ها توسط نرم افزار Minitab16، ابتدا هر یک از پاسخ­ها به شکل جداگانه بررسی و تحلیل شد. علاوه بر ارائه رابطه­ای بین پاسخ و متغیرهای مورد آزمایش، سطوح بهینه این متغیرها نیز بر اساس متغیرهای پاسخ تعیین شد. در بررسی آماری داده­ها، نتایج به­دست آمده توسط نرم‏افزار تحلیل و مدل نخستین ارائه شد. این مدل از درجه دو بوده و ضرایب مربوط به هر عامل از طریق رگرسیون محاسبه شد. از آن‏جایی که مدل اولیه پیشنهادی شامل کلیه عامل­های A، B، AB، ‏A² و ‏B² (متغیرها با توان اول و دوم و اثر متقابل متغیرها) است، درجه اهمیت هر یک از عامل­ها با توجه به مقدار P مربوط به هر یک از آن‏ها که در جدول تحلیل آماری ارائه می­شود، مشخص شده و عامل­های با درجه اهمیت کمتر که در واقع تاثیر ناچیزی در مدل ارائه شده دارند، حذف شدند. به طور کلی، هرچه میزان P مربوط به یک عامل کمتر باشد، آن عامل از اهمیت و تاثیر بیش‏تری برخوردار است و از آن‏جایی که مقدار 95 درصد به عنوان سطح اطمینان از موثر بودن عامل در نظر گرفته می­شود در صورت عدم صدق شرط ‏(P value <0.05) در مورد یک عامل، عامل مربوطه توسط نرم­افزار حذف شده و رابطه جدیدی که تنها شامل عامل­های مهم باشد، ارائه می­شود (1). علاوه بر موارد ذکر شده، ضریب همبستگی (R²) متغیر دیگری است که برای تحلیل بهتر داده­ها می­توان از آن استفاده کرد (13). به طور معمول، هرچه میزان این ضریب به یک نزدیک­تر باشد، انطباق داده­های تجربی و مدل ارائه شده بیشتر بوده و مدل از دقت بالاتری برخوردار است.

در جدول 2 تحلیل آماری مربوطه قابل مشاهده است. آزمایش رگرسیون دارای ‏P صفر بوده که آزمایشی منطقی ‏و دارای خطای بسیار پایین را نشان می‏دهد. عامل غلظت منبع کربن با P بسیار پایین حدود صفر مشاهده می‏شود که نشان دهنده معنی­دار بودن انتخاب عامل مربوطه و داشتن بیش‏ترین اثر ممکن بر تولید زانتان است. ولی عامل زمان در حد مرز ممکن P بوده که گویای این است که نسبت به عامل غلظت موثر نیست، هرچند باز هم عاملی موثر تلقی می‏شود. اثر متقابل این دو عامل (زمان و غلظت منبع کربن) دارای ‏P بسیار بالایی است که اثر این دو عامل را بر روی هم رد کرده و این عوامل را به تنهایی موثر می داند. عبارتLack-of-Fit  به نوعی معرف خطا است که هرچه P آن بیشتر باشد بهتر است، چون در Lack-of-Fit معنی­دار بودن خطا با P بالا رد می­شود. در این آزمایش، بالاتر بودن P از حد مرزی 5 درصد، نشان دهنده معنی‏دار نبودن خطای Lack-of-Fit و در نتیجه خطای پایین آزمایش است. مقدار R نیز با توجه به آزمایش برابر با 87/95 درصد است. این مقدار بسیار نزدیک به عدد یک بوده و انطباق داده­های تجربی و مدل ارائه شده را نشان می­دهد.

جدول 2- تحلیل واریانس تولید صمغ زانتان

نرم افزار بر اساس داده­های به دست آمده و روش‏های آماری و ریاضی، معادله­ای را برای مقدار تولید صمغ زانتان پیش­بینی می­کند. اعتبار کار آماری معادلات چند جمله­ای به وسیله تحلیل واریانس است‏(10). معادله 1 ارتباط تولید با مقادیر غلظت منبع کربن و زمان تولید محصول را نشان می‌دهد. اثر متقابل این دو عامل با ضریب صفر مشخص شده که نشان دهنده بی‏اهمیتی و عدم اثر متقابل این دو عامل است.

صمغ زانتان ‏(g/l) = 00/8+ 36/1 A + ‏85/0B + ‏000/0A×B - 36/1A² - ‏13/1B² 1