نقش microRNA399 و سوکروز در پاسخ‌های فیزیولوژیک گیاه آرابیدوپسیس (Arabidopsis thaliana) نسبت به کمبود فسفر

میکروRNAها (microRNA) مولکول‌های RNAی کوتاه زنجیر، غیر قابل ترجمه و دارای بیان داخلی هستند. اغلب ژن‌های میکروRNA به عنوان واحد‌های مستقل وجود دارند و توسط RNA پلیمراز II (PolII) رونویسی می‌شوند. این رونوشت‌ها در ابتدا به صورت رشته‌های بلند زنجیر هستند Kim, 2005)؛ (Yang et al., 2007 سپس، توسط پروتئین‌های شبه دایسر (Dicer-like) از نواحی حلقه-ساقه (stem-loop) برش می‌خورند و در نهایت، به میکروRNA بالغ تبدیل می‌شوند
Bartel, 2004)؛ (Voinnet, 2009. این مولکول‌های RNA تنظیم‌ کننده، در گیاهان تقریبا دارای 20 تا 24 نوکلئوتید هستند Yang et al., 2007)؛ Voinnet, 2009). سازوکار سنتز و عملکرد میکروRNAها در گیاهان و جانوران تقریبا مشابه است. این RNAهای کوچک از جمله عواملی هستند که به صورت پس از رونویسی بیان ژن‌های مختلف را تنظیم می‌کنند و نحوه‌ عملکرد آنها به گونه‌ای است که mRNAهای هدف خود را شناسایی کرده، برآن تأثیر می‌گذارند (Sunkar et al., 2007؛ (Sunkar et al., 2012. اگرچه میکروRNAها از نظر تعداد اندک هستند اما نقش تنظیم‌کنندگی آنها در بیان ژن‌ها‌ی گیاهان را نمی‌توان نادیده گرفت زیرا اغلب mRNAهای هدف، عوامل رونویسی هستند (Jones-Rhoades et al., 2006). این عوامل رونویسی نقش‌های بالقوه‌ای در اغلب فرآیند‌های تکوینی، از جوانه‌زنی دانه تا بلوغ دارند. همچنین، ارتباط مستقیمی بین میکروRNAها و پاسخ به تنش‌های محیطی نیز شناخته شده است Sunkar and Zhu, 2004)؛ Allen et al., 2005).

گیاهان موجوداتی بی‌حرکت هستند بنابراین، باید بر شرایط نامساعد محیطی غلبه کنند. آنها سازوکارهای پیچیده‌ای را برای سازش به تنش‌های محیطی به کار می‌گیرند (Yang et al., 2007). پیش‌بینی شده است که تعداد زیادی از میکروRNAها در پاسخ به تنش‌‌ها نقش دارند و حتی نقش برخی از آنها نیز به صورت تجربی در پاسخ به تنش‌‌های زیستی (Zhang et al., 2005) و غیر زیستی Sunkar and Zhu, 2004)؛ Zhang et al., 2005) از جمله تنش اکسیداتیو (Sunkar et al., 2006)، تنش‌های مکانیکی در گونه‌های درختی (Lu et al., 2005)، تنش‌های تغذیه‌ای (Fujii et al., 2005) و سایر تنش‌های محیطی به اثبات رسیده است. یکی از انواع تنش‌های غیر زیستی کمبود فسفر است که از محدود کننده‌ترین مواد غذایی برای بازده محصولات زراعی است (Raghothama, 1999). سلول‌های در حال رشد برای سنتز نوکلئیک اسید‌ها و فسفولیپیدها به فسفات نیازمندند، همچنین فسفات نقش مهمی در انتقال انرژی (ATP)، تنظیم واکنش‌های آنزیمی و هدایت پیام ایفا می‌کند Raghothama, 2000)؛ (Tiessen, 2008.

از جمله میکروRNAهایی که در پاسخ به کمبود فسفات افزایش می‌یابد، miRNA399 است که با تأثیر بر mRNA آنزیم ubiquitin-conjugating E2 باعث تعادل فسفات در گیاه می‌شود به طوری که در شرایط کمبود فسفات میزان فسفات گیاهان تراریخته‌ای که بیان ژن miRNA399 در آنها زیاد شده (OXmiR399) در بخش هوایی افزایش می‌یابد Chiou et al., 2006)؛ Yuan and Liu, 2008؛ Rouached et al., 2010؛ Kuo and Chiou, 2011). در سال‌های اخیر، مشخص شده است که miR399 می‌تواند از بخش هوایی گیاه به ریشه منتقل شود و به عنوان یک پیام‌رسان برای برقراری ارتباط بین بخش هوایی و ریشه از نظر وضعیت فسفات عمل کند، بنابراین میزان جذب و انتقال فسفات را تنظیم و در نهایت، تعادل فسفات گیاهان را حفظ می‌کند (Lin et al., 2008).

سوکروز نیز به عنوان مولکول پیام‌رسان سیستمیک از بخش هوایی به ریشه منتقل شده، از طریق آوند آبکش برای تنظیم پاسخ‌های مختلف در ریشه انتقال می‌یابد که از جمله‌ این پاسخ‌ها می‌توان به افزایش جذب فسفات و تغییر معماری ریشه اشاره کرد (Liu and Vance, 2010).

بررسی‌ها نشان داده است گیاهان جهش یافته‌ای که به کمبود فسفات بسیار حساس هستند (hps1) فنوتیپ مشابه با گیاهان تراریخته‌ای دارند که در آنها ژن ترانسپورتر سوکروز (SUC2) به شدت بیان شده است. مشاهده شده که در این گیاهان میزان miRNA399 افزایش قابل توجهی داشته است (Lei et al., 2011) که این امر اثبات کننده وجود یک ارتباط منطقی بین سوکروز و miRNA399 در شرایط کمبود فسفات است. هدف از تحقیق حاضر، بررسی نقش همزمان سوکروز و miRNA399 بر پاسخ‌های فیزیولوژیک گیاه آرابیدوپسیسبه ویژه در جذب فسفات است.

مواد و روش‌ها.

کشت و تیمار گیاهان: در بررسی حاضر، از بذر گیاهان آرابیدوپسیس (Arabidopsis thaliana) رقم Columbia از دو نوع خودرو و تراریخته (OXmiR399) با بیان بالای miR399 استفاده شد. بذرهای تراریخته از مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی کشاورزی تایوان تهیه شد. سطح بذر‌ها توسط هیپوکلریت سدیم 20 درصد (v/v) ضدعفونی شد، سپس سه مرتبه با آب مقطر استریل شستشو و در پایان درون پلیت‌های استریل با قطر 10 سانتی‌متر کشت داده شدند. محیط کشت استفاده شده در این مطالعه شامل نمک‌های MS با آگار 2/1 درصد بود. برای بررسی تأثیر متقابل فسفات و miRNA399 از چهار تیمار متفاوت شامل P+S+ (2/1 میلی‌مولار فسفات و 1 درصد سوکروز)، P+S- (2/1 میلی‌مولار فسفات و فاقد سوکروز)، P-S+ (10 میکرومولار فسفات و 1 درصد سوکروز) و P-S- (10 میکرومولار فسفات و فاقد سوکروز) استفاده شد. در محیط‌های فاقد فسفات برای تأمین پتاسیم از K₂SO₄ 6/0 میلی‌مولار استفاده شد. به منظور تسریع و یکنواختی در جوانه‌زنی بذرها، پلیت‌های کشت شده به مدت دو روز در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار داده شد و در پایان، به اتاقک کشت با دمای 24 درجه سانتیگراد و دوره‌ نوری 8 ساعت تاریکی 16 ساعت نور منتقل شدند.

روش سنجش کلروفیل: کلروفیل از بخش هوایی گیاهان 9 روزه‌ رشد یافته در محیط‌های کشت با استون 80 درصد استخراج شد، سپس میزان کلروفیل‌های a، b و کل از روش Arnon (1949) اندازه‌گیری شد.

روش سنجش آنتوسیانین: آنتوسیانین با استفاده از کلریدریک اسید 1 درصد در متانول از بخش‌های هوایی گیاهان 9 روزه‌ رشد یافته استخراج شد و میزان آن از روش Mita و همکاران (1997) اندازه‌گیری شد.

آنالیز نشاسته:برای سنجش نشاسته، نشاهای 9 روزه‌ به مدت 24 ساعت در اتانول 96 درصد غوطه‌ور شد تا رنگدانه‌های آنها از بین برود و گیاهان کاملا سفید شوند. سپس گیاهان فاقد رنگدانه به مدت 30 دقیقه در محلول یک درصد ید قرار گرفت. پس از اتمام این مدت زمان، گیاهان از محلول ید خارج شده و پس از شستشو با آب مقطر برای نگهداری به اتانول 96 درصد منتقل شدند. در پایان، تجمع نشاسته در گیاه به وسیله استریومیکروسکوپ بررسی شد (Lei et al., 2011).

.سنجش فسفات آزاد در بخش هوایی و ریشه:فسفات آزاد با روش Ames (1966) اندازه‌گیری شد. برای این منظور، بافت ریشه و بخش‌ هوایی با کمک نیتروژن مایع پودر شد. سپس، 50 میلی‌گرم پودر در دو برابر حجم، از محلول 50 میلی‌مولار سدیم‌ استات با اسیدیته 6/5 همگن شد. پس از سانتریفیوژ (میکروسانتریفیوژ، مدل 5702، اپندروف، آمریکا) به مدت 10 دقیقه در 10000 دور در دقیقه 50 میکرولیتر از محلول رویی با آب مقطر به حجم 250 میکرولیتر رسانده شد. سپس، به آن 700 میکرولیتر از مخلوط متشکل از یک حجم محلول 10 درصد آسکوربیک اسید‌ و 6 حجم از محلول 42/0 درصد آمونیوم مولیبدات تهیه شده در سولفوریک اسید یک نرمال افزوده شد. پس از 20 دقیقه، جذب نمونه‌ها در دمای 45 درجه سانتیگراد در طول موج 820 نانومتر خوانده و با استفاده از منحنی استاندارد مقدار فسفات آزاد در نمونه محاسبه شد.

نتایج.

نتایج نشان داد که در دسترس بودن هر دو عامل فسفات و کربن برای رشد و مورفولوژی طبیعی ریشه‌های آرابیدوپسیس ضروری است. حذف فسفات از محیط رشد گیاه باعث مهار رشد ریشه‌ اولیه در هر دو نوع خودرو و تراریخته آرابیدوپسیس شد. در این شرایط، بیان بالای miR399 در گیاهان تراریخته موجب افزایش تعداد انشعابات درجه 2 و 3 نسبت به گیاهان نوع خودرو شد. حذف سوکروز در محیط‌های حاوی فسفات کافی نیز تأثیر متفاوتی بر دو نوع گیاهی داشت به طوری که در گیاهان تراریخت طول ریشه اولیه و انشعابات آن در محیط‌های فاقد سوکروز و دارای فسفات کافی (S-P+) نسبت به گیاهان نوع خودرو به شدت کاهش یافت (شکل‌های 1 و 2). تا زمانی که در محیط کشت گیاه (خودرو و تراریخته) سوکروز وجود داشته باشد، تراکم ریشه‌های جانبی در گیاهان تحت کمبود فسفات به طور معنی‌داری افزایش می‌یابد، اما تفاوت قابل ملاحظه‌ای میان گیاهان نوع خودرو و تراریخته مشاهده نشد (شکل 3).

از دیگر مشخصات پاسخ گیاهان به کمبود فسفات تجمع آنتوسیانین و نشاسته در بافت‌های گیاه است. در این مطالعه مشاهده شد میزان آنتوسیانین گیاهانی که در شرایط کمبود فسفات به ویژه در محیط کشت S-P+ رشد یافته‌اند به طور معنی‌داری افزایش یافته است (شکل 4). این تغییرات هم در گیاهان تراریخته و هم گیاهان نوع خودرو مشاهده شد. کمترین میزان تجمع آنتوسیانین در گیاهان نوع خودرو در محیط‌های فاقد سوکروز صرف نظر از غلظت فسفات محیط کشت مشاهده شد (شکل 4). در حالی که بیان بالای miR399 موجب افزایش معنی‌دار آنتوسیانین در مقایسه با محیط‌های دارای سوکروز می‌شود (شکل 4).

همچنین در این مطالعه مشاهده شده که نشاسته نیز در شرایط کمبود فسفات و به ویژه در حضور سوکروز (S+P-) تجمع بیشتری را در بخش هوایی نشا‌های آرابیدوپسیس داشته است (شکل 5) اما تفاوت معنی‌داری بین دو گروه گیاهان خودرو و تراریخته آرابیدوپسیس مشاهده نشد (شکل 5).

شکل 1-مورفولوژی گیاهان آرابیدوپسیس نوع خودرو (wt) و تراریخته (oxmiR399) در محیط‌های کشت‌ در حضور یا عدم حضور سوکروز و فسفات. معماری ریشه تحت تأثیر فسفات، سوکروز و بیان miR399 متفاوت است.

شکل 5- تجمع نشاسته در نشا‌های آرابیدوپسیس. ردیف نخست مربوط به گیاهان نوع خودرو (wt) و ردیف دوم مربوط به گیاهان تراریخته (oxmiR399) است. نشاسته با ید به رنگ قهوه‌ای قابل مشاهده است.

تغییر در میزان کلروفیل: نتایج بررسی حاضر نشان داد که گیاهان آرابیدوپسیس نوع خودرو و تراریخته در حضور سوکروز در محیط حاوی سوکروز پاسخ‌های متفاوتی نشان دادند به طوری که میزان کلروفیل در گیاهان تراریخته نسبت به نوع اصلی بسیار بالاتر بود. به هر حال، در گیاهان نوع خودرو میزان کلروفیل‌های a و b در پاسخ به کمبود فسفات روند افزایشی را نشان دادند اما در شرایط فقدان سوکروز میزان کلروفیل‌های a و b در پاسخ به کمبود فسفات کاهش یافت.

در گیاهان تراریخته این روند به گونه‌ای بود که کلروفیلa بیشترین مقدار را در تیمار S+P- و کلروفیل bدر تیمار S+P+ داشت. به عبارتی، میزان کلروفیل a در حضور سوکروز در پاسخ به کمبود فسفات افزایش یافت، در حالی که میزان کلروفیل b کاهش یافت و پاسخ گیاهان تراریخته در عدم حضور سوکروز و کمبود فسفات، افزایش میزان هر دو نوع کلروفیل بود (شکل 6).

میزان فسفر آزاد در گیاه:در گیاهان نوع خودرو بیشترین میزان فسفر آزاد گیاه در تیمار S-P+ مشاهده شد. در همین شرایط، گیاهان تراریخته نیز بیشترین میزان فسفر آزاد را نسبت به سایر تیمارها داشتند. از طرفی، مطالعات نشان داد که بیان بالای miR399 در گیاهان تراریخته موجب افزایش معنی‌دار (P<0.05) فسفر آزاد گیاه نسبت به گیاهان نوع خودرو در تمام تیمارها شد (شکل 7). از سوی دیگر، حذف سوکروز از محیط کشت موجب افزایش معنی‌دار فسفر آزاد گیاه در هر دو گیاهان نوع خودرو و تراریخته شد (P<0.05) (شکل 7).

شکل 6- تغییرات میزان کلروفیل‌های a، b و کلروفیل کل در گیاهان 9 روزه‌ نوع خودرو (wt) و تراریخته (oxmiR399) آرابیدوپسیس رشد یافته بر روی محیط‌های جامد و تحت تیمارهای مختلف (میانگین سه تکرار ± انحراف معیار). حروف غیر مشترک بیانگر معنی‌دار بودن میانگین‌ها (p<0.05) بر اساس آزمون دانکن است.

شکل 7- تغییرات میزان جذب فسفر در گیاهان 9 روزه‌ نوع خودرو (wt) و جهش یافته‌ (oxmiR399) آرابیدوپسیس رشد یافته روی محیط‌های جامد و تحت تیمارهای مختلف (میانگین سه تکرار + انحراف معیار) حروف غیر مشترک بیانگر معنی‌دار بودن (p<0.01) بر اساس آزمون دانکن است.