مطالعه اندام‌زایی گل در گوجه‌فرنگی (Lycopersicon esculentum Mill.)

گوجه‌فرنگی با نام علمی Lycopersicon esculentum Mill. گیاهی متعلق به تیره سیب‌زمینی (Solanaceae) است که همچون بسیاری محصولات زراعی دیگر با آب و هوای گرمسیری سازش یافته است. این گیاه که بومی آمریکای جنوبی و مرکزی است، طی دوره استعماری اسپانیا به سایر نقاط جهان منتقل شده است. انواع مختلف این گیاه امروزه در سراسر جهان پرورش داده می‌شود و بخش مهمی از رژیم غذایی مردم بسیاری از کشورها را تشکیل می‌دهد. نظر به اهمیت اقتصادی گوجه‌فرنگی، این گیاه موضوع تحقیق و پژوهش‌های بسیاری بوده است و در علم ژنتیک به ‌عنوان یکی از گیاهان الگو شناخته می‌شود.

گل‌های گوجه‌فرنگی که در گل‌آذین جانبی گرزن یک‌سویه تجمع یافته‌اند، دارای 5 کاسبرگ متناوب با 5 گلبرگ و 5 پرچم مقابل کاسبرگی هستند. مادگی متشکل از 2 برچه الحاق شده است که به خامه‌ای منفرد و کلاله پُرزدار منتهی می‌شود. در گل‌های بالغ، گلبرگ‌ها و پرچم‌ها طویل‌تر از خامه هستند و بساک‌ها لوله‌ای را در اطراف خامه تشکیل می‌دهند (Ronse De Craene, 2010). با وجود اهمیت اقتصادی گل‌های این گونه، تاکنون مطالعات معدودی در مورد تکوین و نمو بخش‌های مختلف گل انجام شده است. مطالعات تکوینی گل‌آذین و گل امروزه جایگاه ویژه‌ای یافته است و دانشمندان متعدد بر لزوم گسترش این مطالعات به موازات مطالعات ریخت‌شناختی، تشریحی و مولکولی نمو گل تأکید ورزیده‌اند (Smyth, 2005). به کارگیری روش‌های جدید و ابداع وسایل و ابزار پیشرفته امکان بررسی دقیق‌تر وقایع ابتدایی تکوین را مهیا کرده و میدان عمل این علم به سرعت در حال توسعه است (Dadpour et al., 2009)؛ Gohari et al., 2010؛ Khodaverdi et al., 2012؛ (Barati et al., 2013.

پژوهشگرانی که پیش از این گل‌های گوجه‌فرنگی را بررسی نموده‌اند، بیشتر روی گیاهان جهش یافته یا تحت تنش‌های محیطی و هورمونی متمرکز شده‌اند Nester and Zeevaart, 1988)؛ Sawhney and Bhadula, 1988؛ (Rasmussen and Green, 1993. تنها بررسی شایان توجه در زمینه توصیف ریختی نمو گل‌های گوجه‌فرنگی توسط Brukhin و همکاران (2003) انجام شده است که به تقسیم فرآیند نمو گل به 20 مرحله منجر گردیده است که در هر مرحله، تعدادی وقایع برجسته رخ می‌دهد. در بررسی آنها ریخت‌شناختی و سیتولوژی، روند زمانی نمو گل و ارتباط مراحل مختلف نمو با اندازه مریستم گل به عنوان پایه‌ای برای مطالعات ژنتیکی و مولکولی آینده مد نظر قرار گرفته است. بر مبنای بررسی Brukhin و همکاران (2003) ظهور آغازه اندام‌ها تا مرحله چهار کامل می‌شود و به دنبال آن تمایز اندام‌ها در مراحل بعدی رخ می‌دهد. برای نمونه، در مرحله 9 فرآیند میوز در بساک‌ها آغاز می‌شود و آغازه تخمک تشکیل می‌گردد و مگاسپوروژنز در مرحله 11 تا 12 آغاز می‌شود. اگرچه این مطالعه تا حدی به روشن شدن وقایع نموی گل در این گونه منجر شده است، اما الگوهای نموی گل در این گونه هنوز به طور کامل شناسایی نشده است.

با توجه به اهمیت اقتصادی گوجه‌فرنگی و مطرح بودن آن به عنوان یک گیاه مدل ژنتیکی، اطلاعات کامل و دقیق از جنبه‌های مختلف نموی گل در این گیاه برای برای درک بهتر اساس ژنتیکی نمو گل ضروری است. در بررسی حاضر، جزییات اندام‌زایی گل در گیاه گوجه‌فرنگی مطالعه شد و ضمن توصیف کامل نمو گل‌های گوجه‌فرنگی، موارد غیرطبیعی مشاهده شده در روند نمو اندام‌ها مورد بحث قرار گرفته است.

مواد و روش‌ها.

برداشت نمونه از گیاهان کشت شده در ایستگاه تحقیقاتی خلعت‌پوشان، وابسته به دانشکده کشاورزی دانشگاه تبریز صورت گرفت. جوانه‌‌ها در اندازه‌‌ها و سنین مختلف جمع‌آوری و در FAA تثبیت شدند. پس از دوره 24 ساعته تثبیت، آبگیری نمونه‌ها به مدت 48 ساعت در غلظت‌‌های متوالی اتانول 70 و سپس 96 درصد انجام گرفت. با پایان آبگیری نمونه‌ها، رنگ‌آمیزی آنها با نیگروزین 5/0 درصد محلول در اتانول 100 درصد صورت گرفت (Dadpour et al., 2008). پس از آن، فلس‌زدایی نمونه‌ها در زیر استرئومیکروسکوپ Nikon SMZ1500 انجام گردید. نمونه‌های آماده شده با بهره‌گیری از میکروسکوپ نوری باز تابشی Nikon E600D که دارای فیلتر بازتابشی زمینه تاریک و عدسی‌های چشمی کاتادیوپتریک بود، بررسی شدند. بدین منظور، هر نمونه در ظرف مخصوص محتوی اتانول 96 درصد که در بخش مرکزی آن سوزن ظریفی تعبیه شده بود، استقرار یافت. تصاویر خام دیجیتالی توسط دوربین Nikon DXM1200 با وضوح 13 مگاپیکسل، از سطوح مختلف نمونه با وضوح متفاوت برداشت شد. لایه‌‌های تصویری برای بهبود عمق میدان و به دست آوردن تصویر نهایی با کیفیت مطلوب ادغام و فرآوری شد (Dadpour et al., 2008).

نتایج.

آغازش اندام‌ها:نخستین نشانه اندام‌زایی، پیدایش آغازه‌های کاسبرگی در پیرامون مریستم گل است. نخستین کاسبرگ در سطح پشتی گل (در مجاورت برگه) پدیدار می‌شود (شکل 1-A). اندکی پس از آن، آغازه دومین کاسبرگ در سطح شکمی (به سمت محور گل‌آذین) نمایان می‌گردد (شکل 1-B). تشکیل کاسه گل با ظهور آغازه کاسبرگ‌های سوم و چهارم در بخش پشتی و جانبی مریستم گل دنبال می‌شود (شکل 1-B) و در پایان، پیدایش آخرین آغازه کاسبرگی در بخش جانبی در مقابل کاسبرگ چهارم رخ می‌دهد (شکل 1-C). بنابراین، آغازش کاسبرگ‌ها با الگوی مارپیچی انجام می‌گیرد. پس از این که کاسبرگ‌ها اندکی رشد یافت و آغازه گلی را احاطه نمودند (شکل 1-D)، 5 آغازه گلبرگ در بخش داخلی و در موقعیت متناوب با کاسبرگ‌ها آغازش می‌یابند (شکل 1-E). چهار گلبرگ با توالی سریع در بخش شکمی و جانبی مریستم گل آغازش می‌یابند و با فاصله اندکی، گلبرگ پنجم در بخش پشتی ظاهر می‌شود (شکل 1- E و F). در ادامه، اندام‌زایی گل با ظهور آغازه‌های پرچمی دنبال می‌شود که به تعداد 5 عدد و به صورت متناوب با گلبرگ‌ها ظهور می‌یابند. الگوی دوجهتی در جریان تکوین پرچم‌ها قابل مشاهده است. با توجه به اندازه آغازه‌ها، آغازش پرچم‌های پشتی و شکمی به صورت همزمان اتفاق می‌افتد که با فاصله اندکی آغازه پرچم‌های جانبی نیز پدیدار می‌شود (شکل 1-G). اندکی پس از ظهور آغازه پرچم‌ها، برچه‌ها به صورت دو برجستگی نابرابر و کم و بیش مورب در قسمت مرکزی مریستم گل نمایان می‌شوند (شکل 1-H و I).

نمو اندام‌ها: کاسبرگ‌ها در جریان آغازش اندام‌های داخلی رشد قابل توجهی یافته و توسط کُرک‌ها احاطه می‌شوند (شکل 2-A). الگوی کُرک‌دار شدن کاسبرگ‌ها منطبق بر الگوی آغازش آنها است و با کاسبرگ پشتی آغاز می‌شود (شکل 2-B). کاسه گل در جریان تمایز کاملاً توسط کُرک‌های طویل پوشیده شده و سایر اندام‌ها را در بر می‌گیرد، به طوری که برای مشاهده آغازش اندام‌های داخلی باید آنها را حذف نمود.

گلبرگ‌ها رشد یافته و روی مریستم گل خمیده می‌شوند (شکل 2-B). در این مرحله، بخش رأسی گلبرگ‌ها توسط کُرک‌ها پوشیده شده است. با ادامه نمو، رشد بینابینی در قاعده گلبرگ‌های مجزا، به تشکیل جام گلی کوتاه منجر می‌گردد (شکل 2-D). حاشیه‌های گلبرگ‌ها در این مرحله به هم می‌رسند و به حالت مماسی در کنار هم آرایش می‌یابند (شکل 2-D).

آغازه پرچم‌ها به تدریج رشد یافته و طویل می‌شود (شکل 2-C). با اتساع بخش انتهایی آغازه‌های پرچمی، بساک‌ها شروع به تمایز می‌کنند (شکل 2-E). بساک‌ها بُن‌چسب هستند و میله پرچمی به قاعده بساک متصل است (شکل 2-E). در گل‌های بالغ، پرچم‌ها دارای بساک‌های کشیده، طویل و میله‌های کوچک هستند (شکل 2-F). در این مرحله، کُرک‌ها در بخش جانبی و شکمی بساک‌ها تمایز می‌یابند و به واسطه گره شدن کُرک‌های اپیدرمی بساک‌ها به هم متصل شده، یک لوله پرچمی را در اطراف خامه تشکیل می‌دهند (شکل 2-F).

برچه‌ها که در مرحله آغازش مجزا هستند، در جریان نمو در امتداد حاشیه‌های مجاور ادغام می‌شوند. در ادامه، رشد و بلند شدن مادگی به تشکیل تخمدان دو برچه‌ای پیوسته برچه، خامه منفرد طویل و کلاله پُرزدار منجر می‌گردد (شکل 2-G). تخمک‌های متعدد در هر یک از خانه‌های تخمدان نمو می‌یابند (شکل 2-G).

موارد غیرمعمول در جریان تکوین گل: طی بررسی روند تکوین گل مواردی از افزایش شمار اندام‌ها و موقعیت‌های غیرمعمول آنها مشاهده گردید. این موارد که با فراوانی نسبتاً بالا (تا 50 درصد نمونه‌های بررسی شده) رخ می‌دهند شامل افزایش تعداد کاسبرگ‌ها، گلبرگ‌ها، پرچم‌ها و برچه‌ها تا 6 عدد هستند (شکل 3). تعداد پرچم‌ها و برچه‌ها گاه تا 7 عدد نیز افزایش می‌یابد (شکل 3- C، D و H). افزایش اندام‌ها در حلقه‌های مختلف می‌تواند به صورت همزمان یا مستقل از هم انجام گیرد. البته حالت دوم با فراوانی بیشتری مشاهده گردید. بر اساس اطلاعات به دست آمده افزایش شمار اندام‌ها به ویژه در حلقه پرچمی و مادگی در نتیجه شکافتگی آغازه‌ها رخ می‌دهد (شکل 3-C و D).

بحث

بر اساس بررسی‌های انجام شده در گوجه‌فرنگی اندام‌های گل در توالی رو به محور تکوین می‌یابند. آغازش و نمو مارپیچی کاسبرگ‌ها با خط تقارنی که از کاسبرگ اول می‌گذرد، به ایجاد تک‌تقارنی مورب در گل منجر می‌شود. اغلب گل‌های تیره Solanaceae چندتقارنی هستند و تک‌تقارنی مورب به ندرت در برخی گونه‌ها نظیر Schizanthus و Salpiglossis مشاهده می‌شود Eichler, 1875)؛ (Knapp, 2002.

بر اساس نظر Knapp (2002) تک‌تقارنی چندین بار در تیره Solanaceae ایجاد شده است و اشکال متنوعی از آن بر چندین اندام یا بر یک اندام خاص تأثیر گذارده است. در Salpiglossis و جنس‌های خویشاوند، جام گل و نافه هر دو تک‌تقارنی هستند و در Browallia پرچم پشتی نابارور است.

جام گل در گوجه‌فرنگی مشتمل بر 5 لوب گلبرگی برآمده روی جام گل است که با آرایش مماسی استقرار یافته‌اند. لوله‌های گلبرگی در تیره Solanaceae اغلب بسیار طویل و دارای لوب‌های کوتاه یا کوتاه با لوب‌های برگشته هستند که برای نمونه در Solanum با گرده افشانی مرتبط است. آرایش گلبرگ‌ها در گیاهان این تیره یک دو یک، پیچ‌خورده یا مماسی است (Ronse De Craene, 2010).

در گوجه‌فرنگی همچون اغلب گونه‌های تیره Solanaceae شمار پرچم‌ها 5 عدد و نافه تک‌حلقه پرچمی (haplostemonous) است. پرچم‌ها در تیره Solanaceae می‌توانند غیر هم اندازه با یک پرچم کوتاه‌تر (مانند Nicotiana) یا با اندازه‌های متفاوت باشند. برای نمونه، در Petunia و Physalis پرچم مقابل کاسبرگ 1 کوتاه‌ترین، دو پرچم مجاور طویل‌ترین و دو پرچم شکمی دارای اندازه متوسط هستند. در Schizanthus تنها پرچم‌های متناوب با برچه‌ها بارور هستند Eichler, 1875)؛ (Knapp, 2002.

حالت مورب مادگی که در گوجه‌فرنگی مشاهده شده است، ویژگی شناخته شده در تیره Solanaceae است. مادگی در اعضای این تیره اغلب دارای 2 و به ندرت 5 برچه (مانند Hicandra) با تخمک‌های فراوان و تمکن محوری است (Ronse De Craene, 2010).

نتایج بررسی انجام شده روی الگوی آغازش اندام‌ها در گوجه‌فرنگی، در تطابق با پژوهش‌های پیشین، وجود فیلوتاکسی مارپیچی را در جریان آغازش کاسبرگ‌ها نشان داد (Sawhney and Greyson, 1972). با این وجود، ظهور تک‌جهتی و دو جهتی گلبرگ‌ها و پرچم‌ها مخالف با الگوی همزمان گزارش شده است
(Brukhin et al., 2003). آغازش اندام‌ها در حلقه‌های متوالی به دنبال هم و بدون همپوشانی رخ می‌دهد که با مراحل 1 تا 4 نمو گل معرفی شده توسط Brukhin و همکاران (2003) مطابقت می‌نماید. در بررسی انجام شده توسط Brukhin و همکاران (2003) نمو گل در گوجه‌فرنگی به 20 مرحله تقسیم شده است. این تقسیم‌بندی بر مبنای زمان آغازش اندام‌ها و به دنبال آن تمایز و تقسیمات سلولی بوده است. بر این اساس، ظهور آغازه کاسبرگ در مرحله 1، ظهور آغازه گلبرگ در مرحله 2، ظهور پرچم‌ها در مرحله 3 و آغازش برچه در مرحله 4 رخ می‌دهد. داده‌های بافت‌شناسی مربوط به مراحل بعدی نمو گل گوجه‌فرنگی نشان داد که گرده‌زایی و تمایزیابی بافت تپتوم با مرحله 6 تا 7، فرآیند میوز با مراحل 8 تا 10، آزادسازی میکروسپورها از تترادها در بساک با مرحله 12 و زمان تمایز کیسه جنینی در تخمک‌ها با مراحل 14 تا 18 مطابقت می‌نماید.

ویژگی جالب یافت شده در بررسی حاضر، مشاهده موارد متعدد افزایش اندام‌های گل در کنار حالت طبیعی پنج پَری گل‌ها بود. افزایش تعداد اندام‌ها، به دنبال مضاعف شدن یا شکافتگی برخی آغازه‌های اصلی اتفاق افتاده است. گرچه انجام بررسی‌های بیشتر برای توجیه این پدیده مورد نیاز است، به نظر می‌رسد این موارد در نتیجه تأثیر عوامل محیطی از جمله سرما باشد. بررسی‌ها نشان داده است که مریستم گل پتانسیل تولید الگوهای ریخت‌شناسی مختلف در پاسخ به عوامل محیطی نظیر: درجه حرارت، فتوپریود و مواد تنظیم‌کننده رشد را دارد (Crozier and Thomas, 1993). بر اساس نتایج مطالعات پیشین، نمو گل و میوه گوجه‌فرنگی در زمان رشد گیاه در دمای پایین به شدت تغییر می‌یابد و به تغییر ماهیت و شمار اندام‌ها و تغییر در الگوی آغازش اندام‌ها منجر می‌گردد (Lozano et al., 1998؛ (Weiss and Egea-Cortines, 2009. تغییر ماهیت اندام‌ها اغلب به تبدیل پرچم‌ها و برچه‌ها به اندام‌های حد واسط منجر می‌شود. تغییر شکل کامل اندام‌ها نیز در مواردی در اندام‌های تولید مثلی گیاهان تحت تنش سرما دیده می‌شود. تغییر تعداد اندام‌ها که عمدتاً در حلقه‌های تولید مثلی این گیاهان دیده می‌شود، در مراحل بسیار ابتدایی نمو رخ می‌دهد و با افزایش معنی‌دار در اندازه مریستم گل مرتبط است. بررسی‌های انجام شده روی بیان ژن‌های گل‌دهی خانواده MADSbox در گوجه‌فرنگی‌های تحت تنش سرما و مقایسه آن با گیاهان طبیعی نشان داده است که بیان ژن‌های TAG1، TM، TM5 و TM6 در اثر دمای پایین به شدت افزایش می‌یابد (Lozano et al. 1998). بنابراین، حالت‌های غیرطبیعی گل می‌تواند با تغییر بیان ژن‌های گل‌دهی مرتبط باشد. چنین حالتی در مورد گیاهان بررسی شده نیز محتمل است که دوره‌ای از سرما را پشت سر گذارده‌اند. بررسی‌های تکمیلی در مورد اساس ژنتیکی فنوتیپ مشاهده شده در این گیاهان می‌تواند اثباتی بر این ادعا باشد.

شکل 1- روند آغازش اندام‌های گل. (A ظهور نخستین آغازه کاسبرگ در بخش پشتی؛ (B تشکیل آغازه کاسبرگ‌های شکمی و جانبی؛
(C پدیدار شدن آخرین آغازه کاسبرگ در بخش جانبی؛ (D مریستم گل پس از حذف 4 کاسبرگ بزرگتر؛ E و (F پدیدار شدن آغازه گلبرگ‌ها در موقعیت متناوب با کاسبرگ‌ها؛ (G پدیدار شدن آغازه‌های پرچمی با الگوی دوجهتی؛ H و (I کامل شدن مراحل اندام‌زایی با تشکیل دو آغازه برچه نابرابر در موقعیت مورب. A: پرچم، C: برچه، P: گلبرگ، S: کاسبرگ. بخش پشتی گل در سمت چپ قرار گرفته است. کاسبرگ‌ها در تصاویر D تا I و گلبرگ‌ها در شکل I حذف شده‌اند.

شکل 2- روند نمو اندام‌های گل. (A نمو نابرابر کاسبرگ‌ها و احاطه شدن آنها توسط کُرک‌های طویل؛ (B رشد گلبرگ‌ها و خمیده شدن آنها به سمت مرکز، کُرک‌های نمو یافته در نوک گلبرگ‌ها قابل مشاهده هستند؛ (C دید قطبی از مریستم گل پس از حذف کاسبرگ‌ها و گلبرگ‌ها که رشد آغازه پرچم‌ها را نشان می‌دهد؛ (D رشد گلبرگ‌ها و استقرار آنها با آرایش مماسی؛ (E تمایز بساک و میله پرچمی؛
(F بساک‌های کشیده و طویل و میله‌های کوچک پرچم‌ها در گل‌های بالغ. بساک‌ها به واسطه گره شدن کُرک‌های موجود در بخش جانبی به یکدیگر اتصال می‌یابند؛ (G مادگی تمایز‌یافته با خامه‌ای طویل، کلاله‌ای پُرزدار و تخمک‌های متعدد در هر خانه تخمدان. A: پرچم، C: برچه، O: تخمدان، Ov: تخمک، P: گلبرگ، rP: گلبرگ حذف شده، rS: کاسبرگ حذف شده، S: کاسبرگ، Sl: خامه، St: کلاله.

شکل 3- حالت‌های غیرمعمول نمو گل. (A ظهور 6 کاسبرگ و 6 گلبرگ؛ (B تشکیل 6 گلبرگ و 6 پرچم؛ C و (D شکافتگی آغازه پرچم‌ها برای تشکیل آغاره‌های جدید (با فلش نشان داده شده است)؛ E و (F افزایش پرچم‌ها و برچه‌ها به 6 عدد؛ (G افزایش همزمان تعداد گلبرگ‌ها، پرچم‌ها و برچه‌ها در یک گل؛ I و (H گل‌هایی با 6 پرچم و 7 برچه. A: پرچم، C: برچه، P: گلبرگ، rS: کاسبرگ حذف شده. کاسبرگ‌ها در تمامی تصاویر و گلبرگ‌ها در تصاویر E، F، H و I حذف شده‌اند.

سپاسگزاری.