بررسی اثر غلظت‌های متفاوت نیتروپروساید سدیم (SNP) در تخفیف صدمات اکسیداتیو ناشی از تنش خشکی در گیاه گوجه‌فرنگی

تنش خشکی یکی از تنش‌های اصلی است که باعث کاهش تولیدات کشاورزی می‌شود. این تنش از فتوسنتز گیاه ممانعت نموده، باعث تغییر در محتوای کلروفیل و صدمه به ساختارهای فتوسنتزی می‌شود. یکی از دلایلی که تنش‌های محیطی مثل خشکی، رشد و توانایی فتوسنتزی گیاه را کاهش می‌دهند، اختلال در تعادل میان تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن و مکانیسم‌های دفاعی برطرف کننده این رادیکال‌هاست که به تجمع ROS و القای تنش اکسیداتیو، خسارت به پروتئین‌ها، لیپیدهای غشا و سایر اجزای سلولی منجر می‌گردد (Fu and Huang, 2001).

سیستم دفاعی آنتی‌اکسیدان در سلول‌های گیاهی شامل مکانیسم‌های آنزیمی GR, APX, CAT ,SOD gPOX
(Guaiacol Peroxidase) و غیر آنزیمی مثل گلوتاتیون احیا، آسکوربیک اسید و توکوفرول است. آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز با تولید آب اکسیژنه (H₂O₂) آنیون سوپر اکسید را حذف می‌کند. آب اکسیژنه تولید شده سپس توسط آنزیم‌های CAT و POX سمّ‌زدایی می‌شود. آنزیم آسکوربات پراکسیداز نیز در سیکل آسکوربات -گلوتاتیون، با مصرف آسکوربات به عنوان دهنده الکترون، مقدار پراکسید هیدروژن را کاهش می‌دهد (Sundhakar et al., 2001).

در شرایط تنش های محیطی، مثل خشکی، فعالیت بالای آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان و محتوای بالای آنتی‌اکسیدان‌های غیر آنزیمی برای تحمل گیاه به تنش بسیار مهم است.

اکسید نیتریک، یک رادیکال نسبتاً پایدار است. در ابتدا این گاز به عنوان آلوده‌کننده محیطی مورد توجه قرار گرفت؛ هر چند بررسی‌های اخیر نشان داده است که NO می‌تواند به عنوان یک مولکول در پدیده ترارسانی علامت در گیاهان عمل کند و در فرآیند‌های مختلف فیزیولوژیک، پاتوفیزیولوژیک و نموی مثل جوانه‌زنی دانه، بسته شدن روزنه، پاسخ به عوامل بیماری‌زا و نمو ریشه دخالت نماید (Duan et al., 2007; Neill et al., 2003). از طرف دیگر، NO می‌تواند به عنوان واسطه در عمل تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی و متابولیسم ROS شرکت کند و در بسیاری از مطالعات نشان داده شده است که در انتقال پیام و پاسخ به تنش‌های زیستی و غیر زیستی نیز دخالت دارد (Del Rio et al., 2004). مقدار زیاد NO می‌تواند با O^¯₂ ترکیب شده، رادیکال پراکسی نیتریت ONOO¯ را تولید کند و گزارش شده است که این رادیکال باعث تخریب لیپیدها، پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک می‌شود (Beligni and Lamattina, 1999). چون O^¯₂ و H₂O₂ بسیار سمّی‌تر از NO و ONOO¯ هستند، بنابراین NO می‌تواند به عنوان یک تنش پیش تیمار سلول را از تخریب رادیکال‌های اکسیژن حفظ کند. بنابراین، اعتقاد بر این است که NO دارای نقش دو گانه است: سمّی یا حفاظتی و این بستگی به غلظت آن، نوع گیاه، بافت گیاهی، سن گیاه و نوع تنش وارده به گیاه دارد (Beligni and Lamattina, 1999; Del Rio et al., 2004)، در بسیاری از مطالعات گزارش شده است که NO بیرون‌زا در گیاهان باعث کاهش خسارات ناشی از برخی تنش‌ها مثل فلزات سنگین، علف‌کش‌ها، سرما، اشعه ماوراء بنفش و تنش شوری شده است (Arasimowicz and Floryszak-wieczorek, 2007).

با توجه به مطالعات و بررسی‌های قبلی، NO دارای دو نقش در شرایط تنشی است. بنابراین، هدف از مطالعه حاضر بررسی نقش احتمالی NO در تنظیم متابولیسم ROS و مکانیسم فیزیولوژیک NO برون‌زا در تحمل به تنش خشکی در برگ‌های گیاه گوجه‌فرنگی است.

مواد و روش‌ها

بذرهای گیاه گوجه‌فرنگی (Lycopersicon esculentum Mill. cv Alicante) که از شرکت Thomson and Morgan کشور انگلستان تهیه شده بودند، در تابستان در خزانه‌های حاوی گیاه‌خاک در ژرمیناتور گروه زیست‌شناسی کاشته شدند، تا زمانی که جوانه زدند (تقریباً یک هفته). پس از جوانه‌‌زنی، گیاهک‌ها به اتاق رشد با دوره 16 ساعت نور 8 ساعت تاریکی، منتقل شدند. گیاهک‌ها هر روز آبیاری شدند و هفته‌ای یک‌بار محلول غذایی (Long Ashton) با غلظت 2/1 به گیاهک‌ها داده شد. پس از چهار هفته رشد، ریشه گیاهان با دقت شسته شد و گیاهک‌ها به شیشه‌های حاوی محلول‌های SNP با غلظت‌های 0، 100، 200 و 500 میکرومولار منتقل شدند. پس از 24 ساعت تیمار با SNP، به منظور اعمال تنش خشکی گیاهک‌ها به مدت 24 ساعت به شیشه‌های حاوی 2/11 درصد PEG (معادل MPa 2/0-) منتقل گردیدند. از هر نمونه پیش تیمار شده، یک نمونه به عنوان شاهد در آب مقطر به‌جای خشکی قرار داده شد. پس از 24 ساعت اعمال تیمار خشکی، برگ سوم گیاهک برداشته شد و بلافاصله در نیتروژن مایع منجمد و برای اندازه‌گیری‌های بعدی در فریزر 80- درجه سانتیگراد نگهداری شد.

سنجش میزان پراکسیداسیون لیپیدها

برای سنجش میزان پراکسیداسیون لیپیدها، غلظت مالون‌دآلدهید (MDA) وسایر آلدهید‌ها اندازه‌گیری شد. بدین منظور 2/0 گرم از بافت تازه برگی در هاون چینی حاوی 5 میلی‌لیتر تری کلرواستیک اسید (TCA) 1% ساییده شد. عصاره حاصل با استفاده از دستگاه سانتریفوژ به مدت 5 دقیقه در g10000 سانتریفوژ شد.

به یک میلی‌لیتر از محلول حاصل از سانتریفوژ،
5 میلی‌لیتر محلول TCA 20 درصد که حاوی 5/0 درصد تیوباربیتوریک اسید (TBA) بود، اضافه شد. مخلوط حاصل به مدت 30 دقیقه در دمای 95 درجه حمام آبگرم حرارت داده شد. سپس بلافاصله در حمام یخ سرد گردید و دوباره مخلوط به مدت 10 دقیقه در 10000 سانتریفیوژ گردید.

برای محاسبه غلظت MDA در طول موج 532 نانومتر از ضریب خاموشی معادل Cm^-1 M^{-1 5}1.55×10
(Heath and Packer, 1968) و برای سایر آلدهیدها در طول موج 455 از ضریب خاموشی معادل
0.457×10⁵ M^-1Cm^-1 (Miers et al., 1992) استفاده شد. نتایج حاصل از اندازه‌گیری بر حسب میکرو‌مول بر گرم وزن تر برگ محاسبه و ارائه گردید.

اندازه‌گیری محتوی رنگیزه‌های فتوسنتزی

در این روش رنگیزه‌ها با استفاده از استون 80% استخراج شدند و غلظت آنها بر اساس روابط زیر محاسبه شد.

سنجش ترکیبات فنلی

محتوای فنل‌های محلول کل با استفاده از معرف فولین اندازه‌گیری شد (Gao et al., 2000). 1/0 گرم از بافت گیاهی در 1 میلی‌لیتر اتانول 80 درصد ساییده شد. عصاره حاصل به مدت 24 ساعت در دمای اتاق قرار داده شد و سپس به مدت 10 دقیقه در g×2000 سانتریفیوژ گردید. از محلول رویی برای سنجش فنل‌های محلول استفاده شد. برای محاسبه غلظت فنل‌های محلول از منحنی استاندارد گالیک اسید استفاده گردید و نتایج بر حسب میلی‌گرم در گرم وزن تر ارائه شد.

استخراج عصاره آنزیمی و اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان

5/0 گرم از برگ منجمد شده در بافر فسفات پتاسیم 50 میلی‌مولار با اسیدیته 7، حاوی پلی وینیل پیرولیدون 1% و EDTA یک میلی‌مولار همگن شدند. همگنای حاصل در ×g20000 به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ گردید و بخش رویی برای سنجش آنزیم‌های مورد نظر برداشته شد (Gapinska et al., 2008).

اندازه‌گیری فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT)

فعالیت کاتالاز با روش اسپکتروفتومتری و بر اساس کاهش جذب پراکسید هیدروژن در مدت 30 ثانیه در طول موج 240 نانومتر اندازه‌گیری شد. مخلوط واکنش حاوی بافر فسفات پتاسیم 50 میلی‌مولار با اسیدیته 7، آب اکسیژنه 15 میلی‌مولار و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. واکنش با اضافه کردن H₂O₂ آغاز شد و کاهش جذب در مدت 30 ثانیه اندازه‌گیری گردید. مقدار پراکسید هیدرژن تجزیه شده با مقایسه منحنی استاندارد محاسبه شد (Dhindsa et al., 1981).

اندازه‌گیری فعالیت گایاکول پراکسیداز (gPOX)

فعالیت گایالول پراکسیداز با استفاده از گایاکول به عنوان سوبسترا اندازه‌گیری شد. مخلوط واکنش حاوی 25 میکرولیتر عصاره آنزیمی، 77/2 میلی‌لیتر بافر فسفات پتاسیم 50 میلی‌مولار با اسیدیته 7، 100 میکرولیتر آب اکسیژنه 1% و 100 میکرولیتر گایاکول 4% بود. افزایش جذب به دلیل اکسیداسیون گایاکول در طول موج 470 نانومتر در مدت
3 دقیقه اندازه‌گیری شد. هر واحد فعالیت آنزیمی به عنوان مقداری از آنزیم تعریف می‌شود که باعث 01/0 تغییر در جذب می‌شود (Zhang et al., 2005).

اندازه‌گیری فعالیت آسکوربات پراکسیداز (APX)

فعالیت آسکوربات پراکسیداز با استفاده از اسپکتروفتومتر و بر اساس اکسیداسیون آسکوربات اندازه‌گیری شد. مخلوط واکنش حاوی بافر فسفات پتاسیم 50 میلی‌مولار با اسیدیته 7، آسکوربات 5/0 میلی‌مولار، آب اکسیژنه 1/0 میلی‌مولار و 150 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. فعالیت آنزیم APX براساس کاهش جذب آسکوربات در مدت 1 دقیقه در طول موج 290 نانومتر اندازه‌گیری شد. در این روش مقدار آسکوربات اکسید شده با مقایسه با منحنی استاندارد محاسبه گردید (Nakano and Asada, 1981).

سنجش فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL)

فعالیت آنزیم PAL براساس مقدار تبدیل فنیل آلانین به سینامیک اسید اندازه‌گیری شد. مخلوط واکنش حاوی بافر Tric-HCl 100 میلی‌مولار با اسیدیته 5/8،
2- مرکاپتواتانول 1 میلی‌مولار، L- فنیل آلانین 50 میلی‌مولار و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود.

مخلوط واکنش به مدت 15 دقیقه در 30 درجه سانتیگراد انکوباته شد. واکنش با اضافه کردن کلریدریک اسید 6 مولار خاتمه یافت و جذب محلول شفاف در 290 نانومتر خوانده شد. هر واحد آنزیمی معادل مقدار آنزیمی است که باعث تبدیل یک میکرومولار سوبسترا به سینامیک اسید در یک دقیقه می‌شود (D'cunha et al., 1996).

سنجش مقدار پروتئین کل

محتوای پروتئین کل با روش برادفورد و استفاده از آلبومین گاوی به عنوان استاندارد اندازه‌گیری شد (Bradford, 1976).

آنالیز آماری

این آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار در هر تیمار انجام شد. آنالیز داده‌ها با نرم‌افزار SPSS نسخه 10 انجام گرفت و میانگین‌ها با استفاده از آزمون دانکن مقایسه شدند. برای رسم شکل‌ها از نرم‌افزار Excel استفاده شد.

نتایج

پراکسیداسیون لیپید

پراکسیداسیون لیپید از علایم عمومی تنش اکسیداتیو است. برگ‌هایی از گیاه گوجه‌فرنگی که تحت تنش خشکی قرار گرفتند، افزایش در پراکسیداسیون لیپیدی را نشان دادند. بر اساس نتایج، وقتی گیاهان با 100 میکرومولار SNP پیش تیمار شدند، مقدار پراکسیداسیون لیپیدها کاهش یافت، اما وقتی با 200 یا 500 میکرومولار SNP پیش تیمار شدند، پراکسیداسیون لیپیدها و خسارت به غشا بسیار بیشتر از گیاهانی بود که فقط تحت تیمار خشکی قرار گرفته بودند (شکل 1).

شکل 1- اثر پیش تیمار غلظت‌های متفاوت SNP بر مقدار مالون‌دآلدهید و سایر آلدهیدها به عنوان شاخص پراکسیداسیون غشا در برگ‌های گیاه گوجه‌فرنگی تحت شرایط کنترل و تنش خشکی. میانگین‌ها با آزمون دانکن مقایسه شدند. P<0.05 به‌عنوان اختلاف معنی‌دار در نظر گرفته شد. حروف متفاوت نشانه معنی‌دار بودن و حروف مشابه نشانه معنی‌دار نبودن داده‌ها در مجموعه تیمارها‌ در مقایسه با یکدیگر است. حروف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن است.

محتوای کلروفیل

گیاهان گوجه‌فرنگی تیمار شده با PEG کاهش معنی‌داری در محتوای کلروفیل کل نشان دادند. نتایج نشان داد که پیش تیمار گیاهان با 100 و 200 میکرومولار SNP باعث کاهش خسارات ناشی از تنش خشکی بر کلروفیل شد، اما وقتی گیاهان با 500 میکرومولار SNP پیش تیمار شدند، مقدار کلروفیل کل در گیاهان شاهد و تحت تنش کمتر از گیاهانی بود که فقط تنش خشکی دریافت کرده بودند (شکل 2).

شکل 2- اثر پیش تیمار غلظت‌های متفاوت SNP بر محتوی کلروفیل کل در برگ‌های گیاه گوجه‌فرنگی تحت شرایط کنترل و تنش خشکی. داده‌ها تحت آنالیز واریانس قرار گرفتند و میانگین‌ها با آزمون دانکن مقایسه شدند. P<0.05 به‌عنوان اختلاف معنی‌دار در نظر گرفته شد. حروف متفاوت نشانه معنی‌دار بودن و حروف مشابه نشانه معنی‌دار نبودن هرچهار تیمار در مقایسه با یکدیگر است.حروف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن است.

فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان

وقتی گیاهان تحت تیمار محلول PEG قرار گرفتند، فعالیت همه آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان در مقایسه با گیاهان شاهد افزایش یافت. فعالیت APX در گیاهانی که با100و200 میکرومولارSNP و خشکی تیمار شده بودند، بیشتر از گیاهانی بود که فقط تحت تیمار خشکی قرار گرفته بودند. پیش تیمار گیاهان با100،200 و500 میکرومولار SNP اثر معنی‌داری بر فعالیت gPOX تحت تنش خشکی نداشت، اما فعالیت CAT در گیاهانی که باSNP پیش تیمار شده بودند و سپس تحت تنش خشکی قرار گرفتند، در مقایسه با گیاهان تحت تنش خشکی، کاهش یافت (شکل 3).

شکل 3- اثر پیش تیمار غلظت‌های متفاوت SNP بر فعالیت آنزیم‌های APX، CAT و gPOX در برگ‌های گیاه گوجه‌فرنگی تحت شرایط کنترل و تنش خشکی. داده‌ها تحت آنالیز واریانس قرار گرفتند و میانگین‌ها با آزمون دانکن مقایسه شدند. P<0.05 به‌عنوان اختلاف معنی‌دار در نظر گرفته شد. حروف متفاوت نشانه معنی‌دار بودن و حروف مشابه نشانه معنی‌دار نبودن داده‌ها در مقایسه با یکدیگر است. حروف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن است.

فعالیت PAL و محتوی فنل

تنش خشکی فعالیت آنزیم PAL را افزایش داد، اما پیش تیمار گیاهان با SNP تأثیر معنی‌داری بر فعالیت آنزیم PAL در گیاهان شاهد و تحت تیمار خشکی نداشت. تنها پیش تیمار با 500 میکرومولار SNP باعث کاهش فعالیت آنزیم تحت تنش خشکی گردید (شکل 4).

تنش خشکی در این بررسی اثر معنی‌داری بر محتوی فنل‌ها نداشت. پیش تیمار با 100 میکرومولار SNP نیز اثر معنی‌داری نشان نداد، اما مقدار فنل‌ها در گیاهان تیمار شده با 200 و 500 میکرومولار SNP کاهش معنی‌داری نشان دادند (شکل 4).

شکل 4- اثر پیش تیمار غلظت‌های متفاوت SNP بر فعالیت آنزیم PAL و محتوی فنل کل در برگ‌های گیاه گوجه‌فرنگی تحت شرایط کنترل و تنش خشکی. داده‌ها تحت آنالیز واریانس قرار گرفتند و میانگین‌ها با آزمون دانکن مقایسه شدند. P<0.05 به‌عنوان اختلاف معنی‌دار در نظر گرفته شد. حروف متفاوت نشانه معنی‌دار بودن و حروف مشابه نشانه معنی‌دار نبودن داده‌ها در مقایسه با یکدیگر است. حروف مشترک بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار با استفاده از آزمون دانکن است.

بحث

در شرایط عادی رشد، بسیاری از فرآیندهای متابولیک تولید ROS می‌کنند. گیاهان دارای سیستم‌های آنتی‌اکسیدانی پیچیده‌ای برای گریز از آثار مضر ROS هستند. تنش‌های محیطی مثل خشکی تولید ROS را افزایش می‌دهند که باعث اکسید کردن رنگیزه‌های فتوسنتزی، لیپیدهای غشایی، پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک می‌شوند(Smirnoff, 1993) .

در این شرایط، گیاهانی که دارای سطوح بالای آنتی‌اکسیدانی دائمی یا القایی هستند، در برابر خسارات اکسیداتیو مقاوم‌تر هستند (Lei et al., 2007). از آنجایی‌که پراکسیداسیون لیپید یکی از اولین نتایج خسارات اکسیداتیوی است، مواد واکنش دهنده با تیوباربیتوریک اسید (TBARS) به عنوان شاخص تولید ROS القا شده توسط خشکی و تنش اکسیداتیو اندازه‌گیری شد. افزایش در محتوای MDA و سایر آلدئیدها در گیاهان تحت تنش خشکی نشان داد که خشکی باعث خسارت به غشا شده است (شکل 1). وقتی گیاهان با غلظت پائین SNP (100 میکرومولار) پیش تیمار شدند و سپس در معرض خشکی قرار گرفتند، آثار مضر خشکی بر غشا کاهش یافت. این اثر می‌تواند به توانایی NO در جمع کردن ROS و جلوگیری از افزایش تولید TBARS و سایر آلدئیدها مربوط باشد (Beligni and Lamattina, 1999). گزارش شده است که نقش NO در جلوگیری از پراکسیداسیون لیپید مربوط به توانایی NO در واکنش با رادیکال‌های لیپید آلکوکسیل (LO^•) و لیپید پراکسیل (LOO^•) و توقف زنجیره پراکسیداسیون است (Lei et al., 2007; Wendehenne et al., 2001) که با نتایج مشاهده شده در این پژوهش که در آن مقدار مالون‌دآلدهید و سایر آلدهید‌ها کاهش نشان داد، مطابقت دارد. نقش NO در کاهش میزان پراکسیداسیون لیپید قبلاً توسط Laspina و همکاران (2005) و Hsu و Kao (2004)، در تنش فلز سنگین کادمیوم نیز گزارش شده است. Tian و Li (2007) نیز اثر NO در کاهش پراکسیداسیون لیپیدها در گیاهچه گندم تحت تنش خشکی را گزارش کردند. در غلظت‌های بالای SNP؛ بخصوص 500 میکرومولار به نظر می‌رسد که NO با تولید بیش از حد رادیکال ONOO¯ (پراکسی نیتریت) ایجاد تنش نیتروزاتیو می‌کند و با رادیکال‌های اکسیژن در تخریب سلول به صورت همکاری عمل می‌نماید.

کاهش در محتوای کلروفیل در برگ‌های گیاه گوجه‌فرنگی تحت تنش خشکی مشاهده شد و این اثر وقتی گیاهان با 100 میکرومولار SNP پیش تیمار می‌شوند، کاملاً مرتفع می‌شود. در این بررسی وقتی گیاهان با 500 میکرومولار SNP پیش تیمار شدند، کاهش کلروفیل چشمگیرتر شد. Hsu و Kao (2004)، گزارش کردند که غلظت‌های بالای کادمیوم (Cd) نیز باعث کاهش محتوی کلروفیل در برگ‌های برنج شده است و وقتی که برگ‌های با ترکیب رها کننده NO پیش تیمار شدند، این اثر برطرف شده که موید این نتایج است.

در این مورد نیز به نظر می‌رسد که اثر NO به واکنش آن با ROS بر می‌گردد، زیرا رادیکال‌های آزاد اکسیژن اصلی‌ترین عاملی هستند که در شرایط تنش باعث خسارت و شکستن رنگیزه‌های فتوسنتزی و پروتئین‌های ساختاری دستگاه فتوسنتزی می‌شوند. این اثر رادیکال‌های آزاد اکسیژن در فتوسیستم 2و به خصوص بر پروتئین D₁ اثبات شده است (Kim and Lee, 2005; Laspina et al., 2005). علاوه بر این، پروتئین‌هایی که در متابولیسم کلروفیل شرکت می‌کنند نیز می‌توانند هدف ROS ها قرار گرفته و تخریب شوند (Beligni and Lamattina, 1999). همچنین در برخی بررسی‌ها گزارش شده است که در حضور NO دسترسی گیاه به آهن بیشتر است و این نیز می‌تواند یکی از نقش‌های NO در حفظ محتوی کلروفیل گیاه باشد (Neill et al., 2003).

در این مطالعه مشاهده گردید که پیش تیمار 100 و 200 میکرومولار SNP فعالیت آنزیم APX را تحت تنش خشکی القا نمود (شکل 3). نتایج مشابه در ریشه کدو تحت تیمار شوری و ریشه لوبیا تحت تیمار کادمیوم (Cd) نیز گزارش شده است (Kopyra and Gwozdz, 2003). در این بررسی فعالیت آنزیم APX در شرایط تنش خشکی و پیش تیمار100و200 میکرومولارSNP از فعالیت سایر آنزیم‌‌های آنتی‌اکسیدان بیشتر بود که بیانگر نقش بیشتر این آنزیم در فعالیت آنتی‌اکسیدانی گیاه تحت این شرایط بود و به نظر می‌رسد که آنزیم‌های gPOX و CAT دارای نقش کمتری در فعالیت دفاعی گیاه تحت این شرایط بودند. فعالیت آنزیم APX تحت تیمار 500 میکرومولار SNP کاهش یافت که احتمالاً به علت عدم توانایی گیاه در حفاظت پروتئین‌ها در برابر رادیکال‌های آزاد اکسیژن و غلظت بالای رادیکال پراکسی نیتریت تولید شده است. فعالیت آنزیم CAT با افزایش غلظت SNP کاهش معنی‌داری نشان داد.

در مطالعات قبلی گزارش شده است که NO تبدیل آنیون سوپر اکسید به پراکسید هیدروژن را تشویق می‌کند و این مرحله مهمی در حفاظت سلول در برابر رادیکال‌های آزاد اکسیژن است. اگر پراکسید هیدروژن تولید شده به‌موقع از سلول دفع نشود، آنیون‌های سوپر اکسید واکنش داده، تولید رادیکال هیدروکسیل می‌کنند که برای سلول بسیار خطر ناک است (Shi et al., 2007). در برخی مطالعات نقش NO در القای آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان گزارش شده، اما در غلظت‌های بالا فعالیت برخی آنزیم‌ها مثل CAT و gPOX کاهش یافته است که محققان معتقدند این اثر احتمالاً به تنش نیتروزاتیو ایجاد شده در این غلظت‌ها مربوط بوده است (Wendehenne et al., 2001).

آنزیم PAL یکی از آنزیم‌های مهم در مسیر فنیل پروپانوئید و سنتز ترکیبات فنلی است که در پاسخ به برخی تنش‌های زیستی و غیر زیستی القا شده است و می‌تواند به عنوان آنزیم آنتی‌اکسیدان در نظر گرفته شود، زیرا دارای خاصیت به دام اندازی رادیکال‌های اکسیژن از طریق ترکیبات فنلی تولید شده است (Tian and Li, 2007). در این بررسی مشاهده شد که تنش خشکی باعث افزایش فعالیت این آنزیم شده است (شکل 4)، اما پیش تیمار گیاهان با 100 و 200 میکرومولار SNP تأثیر معنی‌داری بر فعالیت این آنزیم نداشت. در غلظت 500 میکرومولار SNP کاهش فعالیت آنزیم مشاهده شد که احتمالاً به علت اختلال سیستم دفاعی گیاه در این شرایط است.

محتوی فنل‌های کل تحت شرایط تنش خشکی به تنهایی و پیش تیمار 100 میکرومولار SNP و خشکی تغییر معنی‌داری نداشت، اما در غلظت‌های بالای SNP (200 و 500 میکرومولار) مقدار فنل‌ها تحت تنش کاهش نشان داد. گزارش شده است که ترکیبات فنلی با دادن الکترون به آنزیم‌های تیپ پراکسیداز و سمّ‌زدایی آب اکسیژنه تولید شده، می‌توانند در سلول به عنوان آنتی‌اکسیدان عمل کنند (Sakihama et al., 2002)، اما در این پژوهش به نظر می‌رسد که پیش تیمار NO نقشی در القای تولید آنها نداشته است.

بنابراین، در مطالعه ما بر روی گیاه گوجه‌فرنگی تحت تنش خشکی، به نظر می‌رسد که ماده رها کننده اکسید نیتریک در غلظت‌های پایین (100 میکرومولار) مانع عملکرد ROS می‌شود و خسارات ناشی از این رادیکال‌های اکسیژن کاهش می‌یابد. البته، این نکته را نیز باید مد نظر داشت که غلظت‌های بالای SNP نقش همکاری با ROS داشته، شدت تنش را افزایش می دهند. البته، مقدار دقیق غلظت بالا در گیاهان مختلف متفاوت است که با انجام آزمایش‌ها بر روی آنها می‌توان سطح این غلظت را تخمین زد. همچنین به نظر می رسد که غلظت‌های پایین NO در گیاهان به‌عنوان یک پیامبر ثانویه، باعث افزایش فعالیت و یا القای بیان برخی آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان مانند APX می‌شود و این به گیاه کمک می‌کند تا بهتر بتواند شرایط تنش را تحمل کند.