مطالعه ژن عامل رونویسی متصل‌شونده به عناصر پاسخ‌دهنده به تنش کم آبی در برخی ارقام گندم نان ایران

عوامل محیطی بر روی رشد و نمو گیاهان اثر فراوانی دارند. شناسایی مکانیسم‌های مولکولی در تحمل‌پذیری گیاهان به تنش‌های محیطی برای گیاهان زراعی دارای اهمیت اقتصادی است. سرما یکی از تنش‌های محیطی است که همه ساله خسارات قابل توجهی را به گیاهان زراعی وارد می‌کند. سرما به عنوان یک تنش اسمزی، جذب آب از ریشه گیاه را محدود کرده، باعث افت پتانسیل آب و انتقال آب از سیمپلاست به آپوپلاست می‌شود و در نتیجه کم آبی شدیدی را به دنبال خواهد داشت. سازش‌پذیری گیاه به سرما حاصل تغییرات بیوشیمیایی و فیزیولوژیک متنوعی است که اساساً از تغییر در بیان تعدادی از ژن‌های مسؤول در تحمل‌پذیری به تنش سرما ناشی می‌شود (Thomashow, 1999). از جمله ژن‌های تنظیمی درگیر در پاسخ به تنش‌ها، عوامل رونویسی هستند که نقش مهمی را در پاسخ به تنش در گیاهان ایفا می‌کنند. یکی از مهم‌ترین آنها پروتئین DREB
(Dehydration Responsive Element Binding) است که اعضای آن نقش اصلی را در تنش‌های غیر زیستی چون خشکی، شوری و سرما دارند و در گیاهان مختلفی، مانند آرابیدوپسیس، جو، برنج، گوجه‌فرنگی، آفتابگردان و غیره شناسایی شده‌اند (Liu et al., 2000; Sakuma et al., 2002; Agarwal et al., 2006; Xiong and Fei, 2006; Badawi et al., 2007).
عامل رونویسی DREB توالی‌ها یا عناصر خاصی به نام DRE (Dehydration Response Element) را روی پروموتر ژن‌های القا‌ شونده توسط تنش اسمزی شناسایی می‌کند. خانواده DREB پروتئین‌های مخصوص گیاهی هستند که دارای یک ناحیه بسیار حفاظت‌شده شامل 60 تا 70 اسید آمینه هستند که ناحیه AP2 (Apetala 2) نام دارند (Shen et al., 2003). تاریخ شناسایی DREB به آزمایشی که بر روی آرابیدوپسیس انجام شد، بر می‌گردد. دو cDNA مختلف DREB1A و DREB2A کلون شد و مشاهدات بعدی نشان داد که ژن کد کننده پروتئینی DREB1A و دو همولوگ آن B) و (C تحت تنش سرما و ژن کد کننده پروتئینی DREB2A و همولوگ آن (B) تحت تنش‌های خشکی و شوری القا می‌شوند (Liu et al., 1998). همچنین با مطالعه آرابیدوپسیس تراریخت، عملکرد محصولات این ژن‌ها را ارزیابی کردند و دریافتند که پروتئین‌های مذکور هر چند که ناحیه AP2 مشابهی دارند، ولی مسیرهای متفاوتی را تحت این تنش‌ها در القای ژن ها دارند. خصوصیات توالی DRE و توالی حفاظت شده ناحیه AP2 در آرابیدوپسیس بررسی شده است(Sakuma et al., 2002).

نتایج تحقیقات نشان داد مسیرهای القای مقاومت در تنش‌های خشکی، شوری، سرما و حتی ABA در عین جدا بودن، برهمکنش‌های بسیاری با هم دارند و ممکن است افزایش مقاومت به یک تنش سبب القای مقاومت به تنش‌های دیگر شود (Thomashow, 1999; Kasuga et al., 1999; Liu et al., 2000; Fowler and Thomashow, 2002). تنش‌های غیر زیستی مختلف نظیر خشکی، شوری و سرما گرچه به شکل‌های مختلف اعمال می‌شوند، ولی همگی اثر مشابهی بر میزان آب گیاه دارند. در اثر این تنش‌ها آب سلول‌های گیاهی از دست رفته، فشار تورژسانس آنها کاهش می‌یابد و همه این تنش‌ها نوعی تنش اسمزی محسوب می‌شوند (Sakuma et al., 2002). با توجه به اینکه پهنه وسیعی از حاصلخیزترین مناطق تولیدی و قسمت عمده محصولات اقتصادی مهم کشور، از جمله گندم همه ساله در معرض تهدید تنش‌های محیطی است که آثار نامطلوبی بر تولید و کیفیت محصولات کشاورزی دارد، پیشرفت در زمینه ایجاد مقاومت به این تنش‌ها مخصوصاً در گیاهان غله‌ای یکی از اهداف مهم کشاورزی است.

گندم نان امید، توده بومی ایران و نیمه حساس به تنش خشکی و سرماست. این رقم کیفیت نانوایی متوسط تا خوب دارد و در اکثر مناطق کشور کاشته می‌شود. گندم نان سرداری، بومی ایران و منطقه کردستان و مقاوم به سرماست. این رقم گندم کیفیت نانوایی ضعیفی دارد و بیشتر در مناطق دیم کوهستانی کشور کشت می‌شود. گندم نان زرین، غیر بومی است و نیمه مقاوم به تنش سرماست اما کیفیت نانوایی بسیار عالی دارد و در اکثر مناطق کشور که سرمای ملایمی دارد، کشت می‌شود. در این پژوهش از سه رقم گندم مقاوم، نیمه مقاوم و نیمه حساس به سرما، ژن عامل نسخه‌برداری DREB جداسازی و تعیین خصوصیات شد. هدف اساسی از این پژوهش، جداسازی و تعیین خصوصیت ژن DREB از ارقام گندم نان ایرانی به منظور شناخت مکانیسم‌های تحمل‌پذیری این گیاهان به تنش سرما و برسی امکان انتقال این ژن به گیاهان این خانواده و یا دیگر گیاهان زراعی حساس و همچنین شناسایی ژرم‌پلاسم ارقام ایرانی بود.

مواد و روش‌ها

بذر سه رقم گندم نان نیمه حساس، مقاوم و نیمه مقاوم به تنش سرما به ترتیب به نام‌های امید، سرداری و زرین از بانک ژن گیاهی ایران واقع در کرج تهیه شد. این بذرها ابتدا با محلول هیپوکلریت سدیم 5 درصد به مدت 10 دقیقه ضد عفونی و سپس در گلدان‌های مجزا کاشته شد. نمونه‌ها در اتاقک کشت با شرایط طول روز 16 ساعت، طول شب 8 ساعت، دمای روز 22 درجه سانتیگراد، دمای شب 15 درجه سانتیگراد، رطوبت 60 درصد قرار داده شدند. برای القا تنش سرما، گیاهچه‌های 16 روزه به مدت یک هفته و هر روز 5 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد در یخچال گذارده شدند.

جداسازی و تعیین خصوصیات عامل رونویسی DREB در ارقام گندم شامل استخراج DNA، طراحی آغازگرهای اختصاصی، PCR، ژل الکتروفورز، عبور از ستون به منظور خالص‌سازی محصول PCR، تعیین توالی DNAو تجزیه و تحلیل‌های بیوانفورماتیک و تأیید ناحیه AP2 با نرم‌افزارهایی همچون BLAST، ProDom، PROSITE، SMART، CDD، CDART، BLOCKS و Pfam و ثبت توالی‌ها‌ در بانک جهانی ژن بود. استخراج DNA با روش CTAB تغییر یافته (Sumer et al., 2003) و از برگ گیاهچه‌های
16 روزه گندم صورت گرفت. با بهره‌گیری از نرم‌افزار الیگو 5 و هم‌آرایی توالی‌های مشابه ثبت شده در بانک جهانی ژن (NCBI) یک جفت آغازگر مناسب ژن DREB به قرار زیر طراحی و توسط شرکت آلمانی MWG ساخته شد: توالی پیشرو:

5´-TATGGATTGCCTTGATGAACA-3´

و توالی برگشت:

5′-GACTCCGATTCATCCTTCCC-3′

برنامه زمانی و دمایی واکنش PCR به صورت دمای اولیه 94 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه و سپس 35 سیکل به صورت 94، 53 و 72 درجه سانتیگراد هر کدام به مدت 1 دقیقه و دمای نهایی 72 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه تنظیم شد.

پرایمرهای اکتین مورد استفاده برگرفته از مقاله پژوهشی Pellegrineschi و همکاران (2004) و از این قرار بود، توالی پیشرو:

5'- GACCCAGACAACTCGCAACT -3'

و توالی برگشت:

5'-CTCGCATATGTGGCTCTTGA -3'

برنامه زمانی و دمایی واکنش PCR به صورت فوق بود.

برای استخراج RNA از کیت مخصوص
Bio-RAD (Aurum Total RNA Mini Kit, USA) استفاده شد. در این کیت از آنزیم DNase به منظور عدم آلودگی نمونه RNA به DNA ژنومی استفاده گردید. سپس اولین رشته cDNA از روی mRNA فاقد DNA ژنومی با کیت Roche ساخته شد که از روی آن رشته مکمل در اولین دور واکنش PCR سنتز می‌شود. از ژن اکتین نیز برای سنجش صحت انجام RT-PCR استفاده گردید. پس از انجام PCR نمونه‌ها بر روی ژل آگاروز 1 درصد الکتروفورز شدند. به منظور خالص‌سازی محصول PCR و آماده کردن آن برای تعیین توالی از کیت شرکت Roche
(High Pure PCR Product Purification Kit, Germany) استفاده شد و سپس توسط شرکت MWG آلمان تعیین توالی گردید.

نتایج و بحث

توالی ژن DREB گندم یا TADREB که در این پژوهش از دو منبع ژنومی و cDNA در سه نوع گندم امید، زرین و سرداری به دست آمد، در واقع قسمتی از ژن کامل است که طولی بین 436 تا 438 جفت نوکلئوتید دارد. برای اطمینان از استخراج mRNA و ساخت درست cDNA، محصول واکنش با آغازگر ژن اکتین که همیشه در سلول‌های گیاهی بیان می‌شود PCR و الکتروفورز شد. شکل 1 ژل الکتروفورز محصول PCR با نواری به طول حدود 500 جفت نوکلئوتید مربوط به cDNA سه نوع گندم با آغازگر اکتین را نشان می‌دهد. شکل 2، ژل الکتروفورز محصول PCR سه رقم گندم امید، سرداری و زرین از دو منبع ژنومی و cDNA است. مقایسه ژل الکتروفورز این دو منبع نشان می‌دهد که TADREB به دست آمده از منبع ژنومی و cDNA هر سه نمونه گندم، در باندهایی با اندازه یکسان قرار گرفتند و مقایسه توالی آن‌ها نیز حاکی از شباهت 100 درصدی از نظر طول توالی‌ها بود که نشان می‌دهد ژن مورد نظر حداقل در طول قطعه جدا شده، فاقد اینترون بوده، طول و توالی DNA و cDNA مشابه دارد و دست کم در این محدوده از ژنوم، اینترونی وجود ندارد. آنالیز بیوانفورماتیک نیز این مورد را تأیید نمود. شکل 3، تجزیه و تحلیل‌های بیوانفورماتیکی از توالی اسید آمینه حاصل از ترجمه توالی ژن DREB به دست آمده از ارقام گندم مذکور را نشان می‌دهد. وجود ناحیه AP2 دومین اثبات نمود که ژن‌های مذکور از اعضای زیر خانواده مهم DREB هستند. شکل 4 نشان می‌دهد که ناحیه AP2 در توالی جداسازی شده حاوی 3 زنجیره
β-sheets و یک زنجیره α-helix است و اسید آمینه والین در موقعیت 14 و اسید آمینه گلوتامیک در موقعیت 19 آن قرار دارند که نقش مهمی در تشخیص توالی متصل‌شونده به DNA ایفا می‌کنند. توالی نوکلئوتید و آمینو اسید به دست آمده از
DREB cDNA گندم‌های نان مذکور نشان داد که این منطقه حاوی 3 زنجیره β-sheets و یک زنجیره
α-helix است که جایگاه هر قطعه دقیقاً در توالی مشخص شد. همچنین سایر قسمت‌های این ناحیه به لوپ‌های بینابینی مربوط می‌شود. با بررسی در بانک ژنی آرابیدوپسیس 145 ژن کد کننده پروتئین‌های دارای ناحیه AP2 یافته شد. بر این اساس 14 ژن دارای دو ناحیه AP2 و 131 ژن دارای یک ناحیه AP2 بودند که 56 ژن از آن، پروتئین‌های زیر خانواده DREB را کد می‌کنند (Sakuma et al., 2002). فرض بر این است که انتقال جانبی ژن‌های سیانو باکترها و ویروس‌ها از طریق پدیده همزیستی داخلی به گیاهان صورت گرفته و منشأ تشکیل خانواده بزرگ عوامل رونویسی دارای ناحیه AP2 شده است. سپس در گیاهان از طریق پدیده‌های مختلفی چون حذف یا اضافه شدن اینترون‌ها و اگزون‌ها و جابه‌جایی و یا طرق دیگر اعضای مختلف و زیر خانواده‌های گوناگون این خانواده بزرگ به وجود آمده‌اند (Magnaniet al., 2004).

هم ردیفی توالی‌های cDNA سه رقم گندم امید، زرین و سرداری نشان می‌دهد که شباهت زیادی با یکدیگر دارند. توالی‌ها با شماره‌های دسترسی FC556848، FC556849 و FC556851 در بانک جهانی ژن NCBI به ثبت رسید. مهندسی ژنتیک این ژن با توجه به اینکه عامل رونویسی DREB قادر است همزمان القای چندین ژن القا شونده در تنش را تحت تنظیم خود داشته باشد، اهمیت زیادی دارد. در روش‌های معمول انتقال ژن گیاهان تراریخت فراوانی معرفی شداند، ولی به دلیل انتقال تنها یک ژن، بهبود نسبی مشاهده شده است، امّا انتقال ژنDREB به دلیل اینکه تنظیم بیان چندین ژن را بر عهده دارد، می‌تواند آثار چند گانه داشته باشد (Dubouzet et al., 2003; Savitch et al., 2005). نتایج این پژوهش علاوه بر شناسایی ژرم‌پلاسم ایرانی به یافتن راه‌های القا مقاومت در ارقام پر بازده به منظور افزایش محصول و کاهش خسارات ناشی از تنش‌های محیطی حساس کمک می‌نماید.

شکل 1- ژل الکتروفورز محصول PCR مربوط به استخراج mRNA و ساخت درست cDNA با آغازگر اکتین.

1، 2 و 3 به ترتیب مربوط به گندم‌های نانامید، سرداری و زرین و M مارکر bp100 است.

شکل 2- ژل الکتروفورز محصول PCR سه رقم گندم از منبع cDNA (1، 2 و 3 به ترتیب مربوط به گندم‌های نانامید، سرداری و زرین) و از منبع DNA (4، 5 و 6 به ترتیب مربوط به گندم‌های نانامید، سرداری و زرین)، M مارکر bp100 است.

شکل 3- ناحیه AP2 در توالی اسید آمینه DREB جداسازی شده از این ارقام گندم با استفاده از نرم افزار CDD search

شکل 4- ساختار سه بعدی پروتئین از ناحیه AP2 از توالی اسید آمینه DREB جداسازی شده از این ارقام گندم با استفاده از نرم‌افزار Pfam