بررسی پتانسیل آللوپاتیک گیاه دارویی مورخوش (Zhumeria majdae) بر رقم طلایه کلزا (Brassica napus)

گیاه دارویی مورخوش (Zhumeria majdae)، از زمان‌های قدیم در طب سنتی منطقه هرمزگان و جنوب فارس مورد استفاده افراد بومی قرار می‌گرفته است. این گیاه از تیره نعنائیان بوده، در پایه و بُن چوبی و سخت و به رنگ سفید یا خاکستری است. این گیاه بسیار معطر، در سال 1967 توسط محقق نروژی به نام Majdae Zhumer از منطقه قطب آباد استان هرمزگان جمع‌آوری و به اسلو نروژ برده شد. Rechinger و Wendelbo، این گیاه را جنس جدیدی از خانواده نعنائیانشناسایی کردند و به نام جمع‌آوری کننده‌اش، Zhumeria majdae نامیدند (Rechinger and Wendelbo, 1967).

افراد بومی مناطق هرمزگان و جنوب فارس از برگ این گیاه دارویی به صورت دم کرده و برای درمان ناراحتی‌های گوارشی ، سرماخوردگی، رفع سردرد و التیام زخم‌ها و به عنوان خنکی برای رفع گرمای بدن استفاده می‌کنند. از مواد مؤثر موجود در اسانس این گیاه، می‌توان به لینالول، کامفور، کامفن، لیمونن، اسیمن، ترپینولن، آلفا پینن، میرسن و ژرانیول اشاره کرد که همگی جزو ترپنوئیدها هستند (Majrouhi, 2009). تحقیقات نشان داده است که اسانس‌های روغنی و عصاره‌های استخراج شده از اندام‌های مختلف گیاهان دارای آثار آللوپاتیک هستند. مواد آللوشیمیایی می‌توانند در همه بافت‌ها و اندام‌های گیاهان، همانند ریشه، ساقه و برگ موجود بوده، به روش‌های مختلفی نظیر تراوش از ریشه، نشت کردن و تجزیه بقایای گیاه از بافت‌های گیاهی آزاد شوند (Dulce, 1985). همچنین مواد شیمیایی متنوعی می‌توانند از بخش‌های هوایی گیاه به وسیله باران یا قطرات شبنم نشت کنند
(Cook, 1921). با توجه به اهمیت تیره نعنائیان در بین گیاهان دارویی، بومی و بکر بودن گیاه مورخوش که عضوی از این تیره است و استفاده فراوان افراد بومی از این گیاه برای مصارف درمانی، پژوهش حاضر در مورد خواص آللوپاتیک اسانس برگ گیاه مورخوش بر برخی ارقام کلزا و با هدف تعیین تغییرات درصد جوانه‌زنی، محتوای رنگدانه‌ای و فعالیت دو آنزیم کاتالاز و گایاکول پراکسیداز در کلزاهای تیمار شده با اسانس، انجام شد.

مواد و روش‌ها

تهیه اسانس

ابتدا نمونه‌های گیاه مورخوش از منطقه لارستان جمع‌آوری گردید. برگ نمونه‌‌های تهیه شده در سایه و دور از نور خورشید برای چند روز قرار داده شدند تا خشک شوند. سپس به قطعات کوچک‌تری خرد شده، برای تهیه اسانس استفاده شدند. اسانس‌گیری توسط دستگاه دستگاه تقطیر با آب (کلونجر) و به روش تقطیر با آب صورت گرفت؛ به این ترتیب که میزان 60 گرم از برگ گیاه در بالن دستگاه ریخته و 600 میلی‌لیتر آب مقطر به آن اضافه شد. اسانس‌گیری هر بار به مدت 2 ساعت انجام شد.

تهیه غلظت‌های مختلف اسانس برگ گیاه مورخوش

در آزمایش‌های زیست‌سنجی، به دلیل غیر قابل حل بودن اسانس در آب، یافتن ماده مناسبی که در زیست‌سنجی‌های مختلف اثر گذار نبوده، در عین حال حلال خوبی برای اسانس باشد، ضروری به نظر می‌رسد. برای این منظور از صمغ عربی استفاده شد. صمغ عربی یکی از صمغ‌های گیاهی محلول در آب است. این ترکیب حاوی پلی‌ساکاریدهای پیچیده‌ای است که از چندین مولکول قند متفاوت و گروه‌های یورونیک اسید تشکیل شده است. صمغ عربی واسطه مناسبی برای مخلوط کردن کامل اسانس روغنی با آب است. ابتدا 125 میلی‌گرم از صمغ عربی توزین و در مقداری آب مقطر حل گردید. سپس یک میلی‌لیتر اسانس به آن افزوده و توسط دستگاه Sonicator به شدت به هم زده شد، تا جایی که امولسیونی شیری رنگ و یکنواختی به دست آمد. پس از آن حجم امولسیون با افزودن آب مقطر به 50 میلی‌لیتر رسانده شد. امولسیون به دست آمده به عنوان غلظت 100 درصد اسانس در نظر گرفته شد و غلظت‌های 20 و 60 درصد از آن تهیه و برای انجام مراحل بعدی آزمایش استفاده شد. همچنین از آب مقطر و محلول صمغ عربی به عنوان تیمارهای شاهد استفاده گردید.

اندازه‌گیری رنگدانه‌های کلروفیل و کاروتنوئید

برای اندازه‌گیری رنگدانه‌های کلروفیل و کاروتنوئید قطعاتی از برگ گیاهچه‌های تیمار شده کلزا (رقم پاییزه طلایه) به طور تصادفی جدا شد. پس از شستشو با آب مقطر، ۲۰۰ میلی‌گرم از بافت برگ با استون ۸۰ درصد، کاملاً ساییده شد و حجم آن با استون به 25 میلی‌لیتر رسانده شد. محلول حاصل با سرعت ۴۸۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ گردید. از محلول فوقانی برای اندازه‌گیری رنگدانه‌ها استفاده گردید. بدین منظور، جذب محلول توسط دستگاه اسپکتروفتومتر که قبلاً با استون ۸۰ درصد تنظیم شده بود، در طول موج‌های ۶۴۵ و ۶۶۳ نانومتر برای کلروفیل (Arnon, 1959) و در طول موج‌های 412، 431، 460 و 480 نانومتر برای کاروتنوئید (Eijcklehoff and Dekker, 1997) اندازه‌گیری گردید و از فرمول‌های زیر برای محاسبه مقدار کلروفیل و کاروتنوئید برگ استفاده شد:

اندازه‌گیری فعالیت آنزیمی

برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز در گیاهچه‌های تیمار شده کلزا، ابتدا محلول 8/0 مولار KCl تهیه شد ( 6/0 گرم KCl به 10 میلی‌لیتر محلول بافر فسفات 1/0 مولار با 6=PH اضافه ‌شد). سپس یک گرم از بافت برگ پس از شستشو با آب مقطر به وسیله نیتروژن مایع منجمد و خشک و به محلول فوق اضافه و همگن گردید (Lee, 1973). فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز به روش Mac-Adam و Nelson-Sharp (1992) و در دو گروه شاهد و تیمار بر اساس تغییرات جذب نور در طول موج‌‌های 436 نانومتر در فواصل زمانی 15 ثانیه‌ای برای مدت 5 دقیقه ثبت و با یکدیگر مقایسه گردید. در مورد آنزیم کاتالاز، یک گرم از بافت برگ‌های آماده شده با 10 میلی‌لیتر بافر فسفات پتاسیم 200 میلی‌مولار با 7=pH همگن گردیده، سپس با 100 میکرولیتر Triton X-100 با غلظت 1/0 درصد مخلوط شد. محلول به دست آمده صاف و برای تعیین فعالیت آنزیم استفاده شد.

برای تعیین فعالیت آنزیم کاتالاز از روش Aebi (1984) استفاده شد و کاهش جذب نور دوز طول موج 240 نانومتر در فواصل زمانی 5 ثانیه و به مدت یک و نیم دقیقه اندازه‌گیری گردید. در این بررسی‌ها، طرح آزمایشی کاملاً تصادفی و برای هر تیمار سه تکرار در نظر گرفته شد.

شایان ذکر است که در آزمایش‌های انجام شده بذرهای جوانه‌زده رقم طلایه کلزا درون ظروف محتوی پرلیت کشت داده شده، با محلول غذایی هوگلند 2/1 قدرت تغذیه گردیدند. کلیه تیمارها بر روی گیاهان 21 روزه به مدت 4 روز انجام شد. برای انجام تیمارها، محلول‌ها و آب مقطر روی برگ‌ها و پرلیت اسپری گردیدند. داده‌ها با استفاده از برنامه آماری SPSS نسخه 13 و توسط آزمون‌های Anova و دانکن در سطح 05/0=α تجزیه و تحلیل شدند.

نتایج

به علت آثار شگفت انگیز اسانس‌ها و عصاره‌های گیاهان دارویی و استفاده‌های فراوان از آنها در طب سنتی، پژوهش‌های مختلفی در مورد آثار آللوپاتیک و آنتی‌اکسیدانی آنها انجام شده است. بسیاری از این تأثیرات به متابولیت‌های ثانویه‌ای مانند فنل‌ها، ترپنوئید‌‌ها، آلکالوئیدها و مشتقات آنها نسبت داده شده است. شکل 1، نشان دهنده اثر اسانس بر میزان کلروفیل گیاهچه‌های کلزاست. میزان کلروفیل در حضور آب مقطر و محلول صمغ عربی تفاوت معنی‌داری نداشت. در غلظت 20 درصد اسانس نیز میزان تغییر کلروفیل نسبت به گیاهان تیمار شده با آب مقطر و صمغ عربی معنی دار نبود. با افزایش غلظت اسانس، کاهش بیشتری در میزان کلروفیل مشاهده شد؛ به طوری که در غلظت‌های 60 و 100 درصد اسانس میزان کلروفیل به ترتیب برابر 061/1 و 045/1 میلی‌گرم به ازای گرم وزن تر برگ شد. بنابراین، در رقم طلایه کلزا افزایش غلظت اسانس به تدریج باعث کاهش بیشتر میزان کلروفیل گردید.

شکل 1- اثر اسانس برگ گیاه مورخوش بر میزان کلروفیل در رقم طلایه کلزا. گیاهان 21 روزه به مدت 4 روز در معرض تیمارهای مختلف قرار گرفتند. ستون‌های مشخص شده با حروف متفاوت دارای اختلاف معنی‌دار هستند. هر عدد میانگین سه تکرار ± SD است.

هنگامی که اثر اسانس بر میزان کاروتنوئیدها در رقم طلایه کلزا بررسی گردید (شکل 2)، مشاهده شد که در حضور صمغ عربی، افزایش محتوای کاروتنوئیدها از لحاظ آماری معنی دار نیست. در حضور غلظت 20 درصد اسانس میزان کاروتنوئیدها نسبت به گروه‌های شاهد افزایش معنی‌داری نشان داده و با بالا بردن درصد اسانس به مقادیر 60 و 100 درصد، محتوای کاروتنوئید به بیش از دو برابر نسبت به دو گروه شاهد رسید.

شکل 2- اثر اسانس برگ گیاه مورخوش بر میزان کاروتنوئید در رقم طلایه کلزا. گیاهان 21 روزه به مدت 4 روز در معرض تیمارهای مختلف قرار گرفتند. ستون‌های مشخص شده با حروف متفاوت دارای اختلاف معنی‌دار هستند. هر عدد میانگین سه تکرار ± SD است.

بررسی اثر اسانس بر فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز کلزا در شکل 3 نشان داده شده است. در حضور صمغ عربی میزان فعالیت آنزیم نسبت به گروه شاهد تیمار شده با آب مقطر، کاهش یافته، اما در حضور غلظت‌های 20 و 60 درصد اسانس افزایش معنی‌داری در فعالیت آنزیم نسبت به گروه‌های شاهد مشاهده می‌گردد. در حضور غلظت 100 درصد اسانس، فعالیت آنزیم کاهش پیدا کرده که میزان فعالیت، حد واسط دو گروه شاهد (آب مقطر و صمغ عربی) است. بنابراین، در مجموع می‌توان نتیجه گرفت که اثر اسانس در گیاهچه‌های کلزا، در مواردی به صورت افزایش فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز برای مقابله با تنش احتمالی اکسیداتیو حاصل از حضور ترکیبات مختلف در اسانس بوده است.

شکل 3- اثر اسانس برگ گیاه مورخوش بر فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز استخراج شده از برگ رقم طلایه کلزا. گیاهان 21 روزه به مدت 4 روز در معرض تیمارهای مختلف قرار گرفتند. ستون‌های مشخص شده با حروف متفاوت دارای اختلاف معنی‌دار هستند. هر عدد میانگین سه تکرار ± SD است.

بررسی واکنش آنزیم کاتالاز در رقم طلایه کلزا نسبت به اسانس نشان می‌دهد که در مورد هر دو گروه گیاهان شاهد و در حضور غلظت‌های 20 و 60 درصد اسانس فعالیت آنزیم کاتالاز فاقد اختلاف معنی‌دار بوده، اما در غلظت 100 درصد اسانس فعالیت آنزیم کاتالاز به حدود 4/1 برابر افزایش یافته است (شکل 4).

شکل 4- اثر اسانس برگ گیاه مورخوش بر فعالیت آنزیم کاتالاز استخراج شده از برگ رقم طلایه کلزا. گیاهان 21 روزه به مدت 4 روز در معرض تیمارهای مختلف قرار گرفتند. ستون‌های مشخص شده با حروف متفاوت دارای اختلاف معنی‌دار هستند. هر عدد میانگین سه تکرار ± SD است.

بحث

در زمینه اثر اسانس‌ها و متابولیت‌های ثانویه گیاهی بر محتوای رنگدانه‌ای گیاهان، بررسی‌های بسیاری صورت گرفته است. ابراهیمی‌کیا در سال 1379 کاهش میزان کلروفیل در گیاهان تره تیزک، ترشک، سوروف، یولاف وحشی و ذرت را در معرض غلظت‌های مختلف عصاره آبی اکالیپتوس (Eukalyptus camaldulensis) گزارش کرد. همچنین در یک بررسی اسانس برگ گیاه
E. globulesمیزانکلروفیل گیاهان LensesculentaوPhaseulus aureusرا کاهش داد (Kohli and Singh, 1991). طیف وسیعی از مواد آللوشیمیایی قادرند با تغییر در مقدار کلروفیل، فرآیند فتوسنتز گیاهان را تحت تأثیر قرار دهند. در بیشتر گزارش‌های مربوط به دگرآسیبی، مهار رشد گیاهان در معرض مواد آللوشیمیایی با کاهش کلروفیل در آنها همراه بوده است که ممکن است این کاهش کلروفیل یک اثر ثانویه ناشی از عملکرد مواد آللوشیمیایی ویژه باشد (Babu and Kandasamy, 1997). کاهش ر مقدار کلروفیل می‌تواند بر اثر افزایش فرآیندهای متابولیسمی مربوط به سنتز رنگدانه‌های فتوسنتزی جدید باشد. علاوه بر این، کاهش کلروفیل ممکن است مربوط به آسیب‌هایی باشد که به سیستم‌های فتوسنتزی وارد آمده است (Juboory and Ahmad, 1994).

کاروتنوئیدها رنگدانه‌های گیاهی هستند که به عنوان ترکیبات آنتی‌اکسیدان و ترکیبات ضروری دستگاه فتوسنتزی ایفای نقش می‌کنند. همچنین این ترکیبات در از بین بردن گونه‌های فعال اکسیژن در کمپلکس فتوسنتزی دخیل‌اند (Howltt and Pogson, 2006). Grassmann  در سال 2005 طی مقاله ای بیان می‌دارد که مواد مؤثر موجود در اسانس‌های روغنی به عنوان عوامل آللوپاتیک، سبب افزایش آنتی‌اکسیدان‌هایی نظیر رنگدانه‌های کاروتنوئیدی می‌شوند. همچنین El-Rokiek و Eid در سال 2009 اثر افزایشی اسانس E. citriodoraبر کاروتنوئید برگ‌های تازه Amaryllis را گزارش کردند. به نظر می‌رسد اسانس برگ گیاه مورخوش تخریب در غشاهای زیستی اندامک‌هایی نظیر میتوکندری و هسته (Fischer, 1991) و آسیب‌هایی از این دست، سبب تحریک سنتز و فعالیت رنگدانه‌های آنتی‌اکسیدانی نظیر کاروتنوئیدها می‌شود.

برای محافظت سلول در برابر تنش‌های اکسیداتیو، بافت‌های گیاهی دارای آنزیم‌های حذف‌کننده گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) نظیر سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و پراکسیداز، ترکیبات سمّیت‌زدا در برابر لیپوکسیژنازها (گلوتاتیون s- ترنسفراز، آسکوربات پراکسیداز) و شبکه‌ای از آنتی اکسیدان‌های کم وزن (آسکوربات، گلوتاتیون، ترکیبات فنلی و توکوفرل‌ها) هستند (Bolkhina et al., 2003). آنزیم گایاکول پراکسیداز از آنزیم‌هایی است که پراکسید هیدروژن تولید شده طی تنش‌های اکسیداتیو را از طریق گلوتاتیون احیایی کاهش می دهد (Bolkhina et al., 2003). در پژوهشی توسط Singh و همکاران (2006) نشان داده شد که موادی نظیر آلفا پینن، که در اسانس برگ گیاه مورخوش نیز یافت می‌شود (سلطانی‌پور، 1381)، در گیاه تحت تنش سبب افزایش فعالیت آنزیم‌های اکسیداتیو نظیر گایاکول پراکسیداز به میزان 2 تا 3 برابر نسبت به گروه شاهد می‌شوند. موادی همانند آلفا پینن همچنین سبب ایجاد اختلال در فسفریلاسیون اکسیداتیو و ممانعت از زنجیره انتقال الکترون می‌شوند (Abrahim et al., 2000). اسانس گیاه مورخوش با داشتن موادی نظیر آلفا پینن که القا‌کننده تنش اکسیداتیو و تولید‌کننده ROS نیز هستند (Singh et al., 2006)، سبب تخریب غشاهای زیستی، افزایش لیپید پراکسیداسیون و در نتیجه فعال شدن سیستم آنزیمی آنتی‌اکسیدانی می‌شود. در این حالت، فعالیت آنزیم‌هایی نظیر کاتالاز، گایاگول پراکسیداز و سایر آنزیم‌های اکسیداتیو افزایش یافته، به عنوان سیستم دفاعی گیاه عمل می‌کنند. کاتالاز در پراکسیزوم‌ها فعالیت کرده، سبب کاهش H₂O₂ می‌گردد. افزایش سیستم‌های آنزیمی جاروب‌کننده (scavenging enzymes) در شرایط تنش‌های اکسیداتیو، بیان‌کننده القای این سیستم‌ها و عملکرد آنها به عنوان مکانیسم دفاعی است. البته، به نظر می‌رسد در مواردی که آسیب اسانس به سیستم‌های آنزیمی و آنتی‌اکسیدانی گیاه بسیار بالاست، این سیستم‌ها قادر به واکنش مناسب نبوده، فعالیت آنها کاهش می‌یابد (نظیر غلظت 100 درصد اسانس در شکل 3). در نهایت، می‌توان بیان کرد که افزایش محتوای رنگدانه‌های کاروتنوئیدی و فعالیت آنزیم‌های آنتی اکسیدان می‌تواند از واکنش‌های گیاه برای غلبه بر تنش‌های آللوپاتیکی نظیر اسانس به کار رفته در این پژوهش باشد.

جمع‌بندی

در نهایت، می‌توان نتیجه گرفت که متابولیت‌های ثانویه گیاهی به عنوان مواد آللوشیمیایی، تنها بر یک عمل فیزیولوژیک مؤثر نبوده، بر جنبه‌های متعددی، از جمله میزان رنگدانه‌ها و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان اثر دارند و حتی تغییر ژنتیکی در گیاهان (Patel et al., 2002) نیز می‌تواند تحت تأثیر این مواد باشد. اسانس برگ گیاه مورخوش نیز با داشتن انواعی از متابولیت‌های ثانویه دارای تأثیرات آللوپاتیک قوی بر گیاهان مجاور است.