تبارزایی جنس گل فراموشم مکن (Myosotis, Boraginaceae) بر اساس توالی‌هسته‌ای ‌nrDNA ITS

مقدمه

تیرهگاوزبان (Boraginaceae s.str.) حدوداً 100 جنس‌ و 1600 گونه با مرکز پراکنش در اوراسیا در دنیا دارد. جنس Myosotis (گل فراموشم مکن) یکی از جنس‌‌‌‌های زیرتیره Boraginoideae از تیره Boraginaceae است. موقعیت قبیله‌ای این جنس‌ با توجه به طبقه‌بندی‌های مختلف متفاوت است. در فلورهای منطقه‌ای از جمله فلور ایران جنس‌ Myosotis جزو قبیله Eritrichieae است (Khatamsaz, 2002). در فلورا ایرانیکا (Riedl, 1967) و فلور شوروی سابق (Popov, 1953) و بر اساس پژوهش‌های Langstrom و Chase (2002) این جنس‌ در قبیله Myosotideae قرار گرفته است. هرچند از نظر داشتن عدد پایه کروموزمی 12 به تعدادی از اعضای قبیله Eritrichieae نزدیک است اما به دلیل وجود فندقه‌های صاف و بدون تزیینات و دانه گرده با 8 شیار ناجور (Khatamsaz, 2001) همچنین، با توجه به داده‌های مولکولی وابستگی Myosotis به قبیله Eritricheae بعید است .(Khoshsokhan Mozaffar et al., 2013). قبیله Myosotideae با تنها جنس‌ خود یعنی Myosotisبا داشتن میوه صاف و بدون تزیینات،گروهی تک‌تبار را تشکیل داده است(Khoshsokhan Mozaffar et al., 2013). جنس‌ Myosotis دارای 100 گونه است که در نواحی معتدله نیمکره شمالی و جنوبی پراکنده شده است .(Winkworth et al., 2002) این جنس‌ دو مرکز تنوع دارد: غرب اوراسیا و زلاندنو. تاکنون در ایران برای جنس Myosotis 15 گونه شناسایی شده است که اغلب در نواحی معتدل و مرطوب از جمله نواحی شمالی ایران می‌رویند (Khatamsaz, 2002). گونه‌های دو یا چند ساله شامل: M. alpestris Schmidt، M. asiatica Schizchk & Serg،
M. ceaspitosa Schultz، M. lithospermifolia (Willd) Hornem، M. olympica Boiss. subsp. demavendica (Bornm. ex Vest.) Riedl،
M. sylvatica Ehrh ex Hoffm،M. palustris (L.) و M. anomala Riedl، گونه‌های یک‌ساله شامل:
M. koelzii Riedl،M. propinqua Fisch. & Mey ex Ledeb،M. pseudopropinqua M.Pop،
M. ramosissima Rochel ex Schultes،
M. refrecta Boiss.، M. sparsiflora Mikan و
M. stricta Linkهستند. در فلورا ایرانیکا (Riedl, 1967)، فلور ایران (Khatamsaz, 2002) و فلور شوروی سابق (Popov, 1953)، این جنس‌ به دو زیرجنس‌ Myosotis و Strophiostoma، مشتمل بر گونه‌های یک‌ساله، دو‌ساله و چند ساله تقسیم شده است که وجه تمایز آنها در نوع گل‌آذین، ضخیم شدن یا نشدن دمگل در محل اتصال به کاسه و وجود یا فقدان زایده سفیدرنگ در محل ناف فندقه است. همچنین، برای زیرجنس‌ Myosotis سه سری‌ به نام‌های Arvenses، Palustres و Silvatica ارایه شده است که هر سری گونه‌هایی را شامل می‌شود. اما زیرجنس‌ Strophiostomaبدون واحدهای تحت جنس است. این زیرجنس‌ در ایران شامل چهار گونه: M. anomala، M. propinqua،
M. pseudopropinqua و M. sparsiflora است.

Grau و Schwab (1982) بر اساس ریخت‌شناسی گرده و ویژگی‌های میکروسکوپی کلاله و جام گل در طبقه‌بندی Myosotisتجدید نظر کردند وآن را به دو بخشه تقسیم نمودند: Myosotisو Exarrhenaمرکز تنوع بخشه Myosotisدر نیمکره شمالی و بخشه Exarrhenaدر نیمکره جنوبی است. اما گروه کوچکی از تاکسون‌ها به نام گروهDiscolor که مربوط به اوراسیا است در بخشه Exarrhena قرار می‌گیرد. زیرا ریخت‌شناسی گرده‌ آنها ارتباط نزدیکی با تاکسون‌های نیمکره جنوبی دارد. بنابراین، بخشه Exarrhena خود دارای دو گروه به نام‌های Austral و Discolor است. اعضای گروه Austral شامل گونه‌های:
M. albosericea، M. australis، M. exarrhena و
M. rakiura و اعضای گروه Discolor شامل گونه‌های:M. abyssinica،M. congesta،M. discolor و
M. persoonii می‌شود Grau and Schwab, 1982)؛ (Winkwort et al., 2002. مطالعات مولکولی که تاکنون در مورد جنس‌Myosotisانجام شده است توسط Winkwort و همکارانش (2002) با استفاده از توالی هسته‌ای nrDNA ITS و سه توالی کلروپلاستی ndhF، matK و trnK-psbA بوده است.

در پژوهش حاضر، از توالی هسته‌ای nrDNA ITS استفاده شده است و اهداف آن الف) تعیین تک تبار بودن واحدهای فرو جنسی Myosotis، ب) بررسی تک تبار بودن گونه‌های یک‌ساله این جنس‌ و ج) بررسی روابط خویشاوندی گونه‌های جنس‌ Myosotis در ایران است.

مواد و روش‌ها

نمونه‌گیری تاکسون‌ها: برای بررسی روابط خویشاوندی و بازسازی درخت فیلوژنی، نمونه‌های موجود در هرباریوم دانشگاه تربیت مدرس و نمونه‌هایی از هرباریوم مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور (TARI) استفاده شد. از فلور ایران (Khatamsaz, 2002) به عنوان مرجع اصلی و در کنار آن از فلورا ایرانیکا (Reidl, 1967) و فلور شوروی سابق (Popov, 1953) برای شناسایی نمونه‌های هرباریومی استفاده گردید. در مجموع، 58 تاکسون (47 گونه از جنس‌ Myosotis، 4 گونه از قبیله Cynoglosseae و 5 گونه از قبیله Eritricheae تاکسون‌های درون‌گروه هستند و دو گونه Echiochilon fruticosum و E. persicum به عنوان برون‌گروه( استفاده شدند (Khoshsokhan Mozaffar et al., 2013). تاکسون‌های بررسی شده در مطالعه حاضر در جدول 1 ارایه شده‌اند. برخی تاکسون‌های استفاده شده در تحلیل به دلیل منحصر بودن به برخی از نقاط جهان با استفاده از داده‌های Winkwort و همکارانش (2002) از بانک ژن انتخاب شدند.

جدول 1- گونه‌های مطالعه شده در تحلیل تبارزایی توالی‌های nrDNA ITS

استخراج، تکثیر و توالی‌یابی DNA: اسخراج DNA از نمونه‌های گیاهی با روش CTAB (Doyle and Doyle, 1987) با اندکی تغییر انجام شد. سپس، DNA استخراج شده با روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) تکثیر شد. در مطالعه حاضر، یک ناحیه از توالی DNA، به نام ITS (Internal Transcribed Spacer) یا ناحیه فاصله‌گذار رونویسی‌شونده درونی که بخشی از DNA ریبوزومی هسته است، استفاده شد. درون این ناحیه، نواحی کدگذار بسیار حفاظت شده 5.8S nrDNA)،
18S nrDNA و (26S nrDNA به همراه نواحی غیرکدگذار ETS) و (ITS قرار دارند. نواحی ITS1 و ITS2 در بالغ شدن و پردازش ریبوزوم نقش مهمی دارند. اما ناحیه ITS پس از پردازش ریبوزوم ترجمه نمی‌شود و به همین علت کمتر تحت فشار عملکردی است و سرعت بالای تکاملی، این ناحیه را برای بررسی روابط فیلوژنتیکی مناسب کرده است (Alvarez and Wendel, 2003).

به منظور تکثیر توالی‌های nrDNA ITS از آغازگرهای AB101F و AB102R (Douzery et al., 1999) یا آغازگرهای (White et al., 1990) ITS4 و ITS1F (Navajas-Pérez et al., 2005) استفاده شد. برنامه PCR برای تکثیر قطعه به شرح زیر بود: واسرشت‌سازی اولیه با دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه، (واسرشت‌سازی ثانویه با دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت یک دقیقه، اتصال با دمای 53 درجه سانتیگراد به مدت یک دقیقه، بسط اولیه با دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 5/2 دقیقه) 37 تا 40 تکرار، بسط ثانویه با دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 7 دقیقه انجام شد. برای اطمینان از وجود DNA تکثیر شده، پس از انجام PCR، محصولات حاصل الکتروفورز شدند. محصولات با تک باند قوی و بدون کشیدگی، جهت تعیین توالی به کشور کره جنوبی فرستاده شدند.

تحلیل فیلوژنی: برای تحلیل داده‌های مولکولی کروماتوگرام‌های حاصل از تعیین توالی توسط نرم‌افزار BioEdit نسخه 0/9/0/7 (Hall, 1999) مشاهده شدند و توالی‌های مورد نظر با فرم فستا توسط برنامه CLUSTAL (Larkin et al., 2007) و نرم‌افزار MUSCLE نسخه 0/4 (Edgar, 2004) هم‌ردیف‌سازی و نقاط مبهم نیز به صورت چشمی تنظیم شدند. داده‌های هم‌ردیف‌سازی شده موجود در ماتریس، با روش بیشینه صرفه‌جویی (maximum parsimony) تعبیه شده در نرم‌افزار PAUP* 4.b10 (Swofford, 2002) روش Bayesian توسط نرم‌افزار Mrbayes نسخه 12/3 (Ronquist and Huelsenbeck, 2003) و روش بیشینه درست‌نمایی (maximum likelihood) با نرم‌افزار raxmlGUI نسخه 1/1 (Silvestro and Michalak, 2012) تحلیل شدند.

روش بیشینه صرفه‌جویی: برای تحلیل داده‌ها، از جستجوی ابتکاری (heuristic search) و روش تبادل شاخه‌ای (swapping)، دو نیمه سازی درخت و اتصال مجدد شاخه‌ها (tree bisection reconnection) و گزینه چندین درخت (MULTrees) با 100 تکرار از random additionsequences و MaxTrees=10000 (بیشینه درختان ذخیره شده) استفاده گردید. برای تعیین حدود اطمینان کلاد‌ها در درخت مطلق مرکزی (strict consensus tree) حاصل از هر یک از تحلیل‌‌های مذکور، تحلیل بوت‌استرپ (Felsenstein, 2004) انجام شد. تعداد تکرارها در تمامی تحلیل‌های بوت‌استرپی برابر با 10000 تکرار در نظر گرفته شد. بیشینه‌ درختان ذخیره شده به ازای هر تکرار در تمامی موارد 100 درخت انتخاب شد.

روش بیزین: این روش بر مدل‌های تکاملی متمرکز شده، تمامی مکان‌های جانشینی را بررسی می‌کند. برای تحلیل داده‌های حاصل، مدل‌های تکاملی توسط برنامه MrModeltest نسخه 3/2 (Nylander, 2004) بر اساس معیار اطلاعاتی AIC (Akaike Information Critrion)، مدل جانشینی نوکلئوتید GTR+I+G برای داد‌ه‌ها انتخاب شد. تحلیل داده‌های 000/000/4 نسل تکرار شد. هر 100 نسل یک درخت نمونه‌برداری شد. سپس 25 درصد درختان سوزانده شد. .PSRF (Potential Scale Reduction Factor) (Gelman and Rubin, 1992)، واریانس بین دو اجرا و درون دو اجرا را با هم مقایسه می‌کند و اگر این مقدار برابر 1 باشد به این معناست که نمونه‌برداری مناسبی برای توزیع احتمالات ثانویه وجود داشته است. همگرایی زنجیره‌ها بر اساس مقدارPSRF برابر با 1 بود در نهایت، از درختان باقی مانده برای مشاهده یک درخت اجماعی 50 درصد استفاده شد.

روش بیشینه درست‌نمایی: در تکامل، جهش‌های نقطه‌ای رویدادهای تصادفی هستند. بنابراین، به طور کلی، احتمال یافتن یک جهش در طول یک شاخه از درخت فیلوژنی را می‌توان با استفاده از چارچوب بیشترین درست‌نمایی محاسبه کرد. هدف از به کار بردنروش بیشینه درست‌نمایی دستیابی به فیلوژنی، تعیین توپولوژی درخت، طول شاخه‌ها و مؤلفه‌های الگوی تکاملی است که احتمال مشاهده توالی موجود را به بیشترین مقدار خود می‌رساند در این روش ابتدا توسط نرم‌افزار Mesquite نسخه 71/2 (Maddison and Maddison, 2011) و سپس توسط نرم‌افزار BioEdit نسخه 0/9/0/7 (Hall, 1999) داده‌هااز فرمت Nexus به فرمت Phylip تغییر یافتند و بر اساس معیار اطلاعاتی Akaike (AIC) مدل GTRGAMMAI برای داد‌ه‌ها در برنامه RaxmlGUI نسخه 1/1 (Silvestro and Michalak, 2012) انتخاب شد، سپس گزینه thorough bootstrap با 1000تکرار انتخاب شد و پس از مشخص نمودن برون‌گروه تحلیل انجام شد.

نتایج

ماتریس داده‌ها دارای 58 گونه، دارای 652 جایگاه نوکلئوتیدی است که از این میان، 213 جایگاه از لحاظ بیشینه صرفه‌جویی اطلاع‌رسان (informative) و بقیه غیر اطلاعاتی (uninformative) بودند. تحلیل داده‌ها با استفاده از روش بیشینه صرفه‌جویی، 10000 درخت با کوتاه‌ترین طول، برابر با 786 گام، با شاخص پایداری یا ثبات (CI) 482/0، شاخص گروه‌پذیری یا ابقا (RI) 770/0 و شاخص هموپلازی (HI) برابر با 518/0 ایجاد کرد. توپولوژی درخت حاصل از روش بیزین مشابه با روش‌های بیشینه درست‌نمایی و بیشینه صرفه‌جویی است. بنابراین، درخت حاصل از تحلیل بیزین نشان داده شده است (شکل 1). پس از برون‌گروه، Asperugo procumbensنخستین شاخه پایه‌ای درون‌گروه‌ها را تشکیل می‌دهد. پس از آن کلادی شامل دو گونه: Omphalodes linifolia Munich و Myosotidium hortensia با حمایت 89 درصد جدا می‌شود. سپس، کلادی شامل برخی جنس‌های قبیله Eritrichieae از جمله: Eritrichium cannum، Heterocaryum szovitsianum و Lappula sinaica با حمایت 95 درصد جدا شدند. به دنبال آن، کلادی شامل دو زیرکلاد است که با حمایت 85 درصد از هم اشتقاق یافتند. یک زیرکلاد شامل: Cynoglossum officinale و Paracaryum leptophyllumاز قبیله Cynoglosseae با حمایت 100 درصد است و زیرکلادی دیگر که خود متشکل از دو شاخه است: Tricodesma aucheri و جنس Myosotis.

Myosotis خود متشکل از شش کلاد A تا F است که این شاخه‌بندی مشابه مطالعات Winkworth و همکاران (2002)است. کلاد B به عنوان پایه‌ای‌ترین دودمان شامل گونه‌های زیرجنس‌ Strophiostoma از جمله:
M. anomala، M. propinqua و M. sparsiflora است. سایر گونه‌ها (از زیرجنس‌ Myosotis) در سرتاسر درخت در پنج کلاد دیگر پراکنده‌اند A)، C، D، E و (F. کلاد C شامل تاکسون‌های: M. arvensis، M. decumbens،
M. olympica subsp. demavendica، M. sylvatica و M. vestergreni؛ کلاد F شامل گونه‌های:M. alpestris، M. asiatica، M. lithospermifolia،
M. semiamplexicaulis و M. suaveolens، کلاد D شامل: M. ceaspitosa، M. debilis، M. palustris و
M. rehsteineri؛ کلاد A متشکل از گونه‌های:
M. abyssinica، M. cadmea، M. congesta،
M. discolor، M. incrassata، M. koelzii،
M. macrosperma، M. persoonii،M. ramosissima و
M. verna و گونه‌های زلاندنویی شامل:
M. albosericea، M. australis، M. exarrhena و
M. rakiura و کلاد E شامل گونه‌های M. refrecta و M. stricta است.

شکل 1- درخت تبارزایی حاصل از تحلیل توالی هسته‌ای nrDNA ITS با استفاده از روش بیزین. اعداد روی شاخه‌ها به ترتیب از چپ به راست: حدود اطمینان، حاصل از روش بیشینه صرفه‌جویی (MP)، روش بیشینه درست‌نمایی (ML) و روش بیزین (PP). گونه‌های منتشره در ایران با * نشان داده شدند. گونه‌های یک‌ساله با حرف A نشان داده شده است. طبقه‌بندی زیرجنسی بر اساس فلورا ایرانیکا (Riedl, 1967) و فلور ایران (Khatamsaz, 2002) برای گونه‌های ایرانی: گونه‌های زیرجنس‌ Myosotis با قلم سیاه پُر رنگ ( در کلادهای A، C، D، E و F و گونه‌های زیرجنس‌ Strophiostoma با قلم سیاه کم رنگ (در کلاد B) مشخص شده است. طبقه‌بندی بخشه‌ای بر اساس Grau و Schwab (1982): بخشه Myosotis با ستون سیاه، گروه Austral بخشه Exarrhena با ستون سفید وگروه Discolor با ستون خاکستری نشان داده شده است.

بحث

تحلیل تبارزایی توالی هسته‌ای ITS نشان می‌دهد که سیستم طبقه‌بندی زیرجنسی Strophiostoma و Myosotis Popov, 1953)، Riedl, 1967؛ Khatamsaz, 2002) مورد حمایت قرار می‌گیرد. اما سیستم طبقه‌بندی بخشه‌ای Myosotis و Exarrhena (Grau and Schwab, 1982) حمایت نمی‌شود. به بیان دیگر، زیرجنس‌‌ها هر کدام کلادی جدا را تشکیل می‌دهند و تک تبار هستند اما بخشه‌ها تک تبار نیستند (شکل 1). وجه تمایز زیرجنس‌ Strophiostoma از زیرجنس‌Myosotis، در داشتن گل‌آذین خوشه‌ای، ضخیم شدن دمگل در محل اتصال به کاسه گل و داشتن زایده سفید رنگ در محل ناف فندقه است. بر اساس داده‌های مولکولی حاضر، زیرکلاد B به عنوان پایه‌ای‌ترین دودمان خواهر سایر کلادهایجنس‌ Myosotis مربوط به زیر‌جنس‌ Strophiostoma است که روابط شاخه‌ها در این زیر کلاد به صورت پلی‌تومی و حل نشده باقی مانده است. در این کلاد، همه اعضای این زیر‌جنس‌ قرار می‌گیرند. توپولوژی و گروه‌بندی درخت حاصل از پژوهش حاضر تقریباً مشابه با نتایج حاصل از مطالعات Winkworth و همکاران (2002)است. با این تفاوت که کلادی به نام F شامل گونه‌های: M. alpestris، M. asiatica، M. lithospermifolia، M. semiamplexicaulis و M. suaveolens گروه خواهری سایر گونه‌های زیرجنس‌ Myosotis است.گونه‌های زیرجنس‌ Myosotis در سرتاسر درخت پراکنده شده‌ و در پنج زیرکلاد A، C، D، E و F قرار گرفته‌اند. بخشه Exarrhena متشکل ازگروه Discolor از اوراسیا M. abyssinica)، M. congesta،
M. discolor و (M. persoonii و گروه Austral شامل گونه‌های زلاندنو M. albosericea)، M. australis، M. exarrhena و (M. rakiura به همراه برخی گونه‌های اوراسیایی از جمله M. koelzii(انحصاری ایران)، M. incrassata و M. ramosissima از بخشه Myosotis در کلاد A قرار گرفته است.
M. persooniiگونه‌ای اوراسیایی و متعلق به گروه Discolor استوبا حمایت بسیار بالا به عنوان خواهر گونه‌های زلاندنویی است، این گونه بر اساس نتایج حاصل از مطالعات Winkworth و همکاران (2002) نیز نزدیکترین خویشاوند اوراسیایی به گونه‌های زلاندنویی و نیمکره جنوبی است. در نتایج حاصل از پژوهش حاضر اعضای گروه Austral از بخشه Exarrhena دارای یک نیای مشترک است در نتیجه گروهی تک تبار هستند. اما اعضای گروهDiscolor شامل گونه‌های: M. abyssinica، M. congesta،
M. discolor و M. persoonii تک تبار نیست. در پژوهش حاضر، کلاد C همانند کلاد C در مطالعات Winkworth و همکاران (2002) است. با این تفاوت که M. olympica subsp. demavendica که جزو زیرجنس‌ Myosotis و انحصاری ایران است نیز در جوار اعضای این کلاد قرار گرفته است. همان ‌طور که ذکر شد در کلاد B تنها اعضای زیرجنس‌ Strophiostoma قرار دارند. برخلاف یافته‌های Winkworth و همکاران (2002)، M .propinqua در کنار M. alpestris و M. lithospermifolia قرار نمی‌گیرد. این دو گونهبه همراه M. suaveolens (گونه‌ای رویش یافته در تاجیکستان)، M. asiatica وM. semiamplexicaulis جزو کلاد F هستند. بر اساس فلور شوروی سابق (Popov, 1953) و فلور اروپا (Grau and Merxmuller, 1972) اعضای کلاد F، به غیر از گونهM. semiamplexicaulis، با داشتن ویژگی‌هایی نظیر: ریزوم‌های کوتاه و متعدد، ریشه‌های بلند و گوشتی، ساقه‌ها اغلب با کُرک‌های خشن،کاسه دارای کُرک‌های متراکم، لوله جام کوتاه‌تر از کاسه و با فندقه‌هایی بیش از 2 میلی‌متر سیاه و براق که با داشتن شیار جانبی به دو قسمت تقسیم می‌شود، گروهی از گونه‌های نزدیک به یکدیگر به نام گروه M. alpestrisرا تشکیل می‌دهند. M. semiamplexicaulis (رویش یافته در آفریقا) بر اساس ویژگی‌های دانه گرده و ویژگی‌های میکروسکوپی کلاله و جام گل، ارتباط نزدیکی با گروه M. alpestrisنشان می‌دهد (Grau and Schwab, 1982). در تحقیق حاضر نیز همچون یافته‌های Winkworth و همکاران (2002)، این گونه ارتباط نزدیکی با اعضای این گروه دارد و در کلادی مشترک با اینها قرار گرفته است (F).

بنابراین، می‌توان نتیجه گرفت که گونه‌های جنوب‌غربی آسیا از جمله گونه‌های ایرانی در سرتاسر درخت و در کنار گونه‌های مختلف ‌جنس‌ Myosotis از سایر نقاط جهان قرار گرفتند. بر این اساس، گونه‌هایMyosotis ایرانی تک تبار نیستند. علاوه بر آن، گونه‌های یک‌ساله ایرانی شامل: M. koelzii،
M. propinqua، M. ramosissima، M. refrecta، M. sparsiflora و M. stricta گروهی تک تبار را تشکیل نمی‌دهند و در میان سه کلاد A، B و E پراکنده شده‌اند. البته به غیر از M. refrecta و M. stricta که در کلاد E گروه خواهری یکدیگر هستند و با حمایت بالا از سایر کلادها جدا شده و با هم کلاد E را تشکیل دادند.

سپاسگزاری

از جناب آقای دکتر علی اصغر معصومی و جناب آقای دکتر مصطفی اسدی به خاطر در اختیار قرار دادن نمونه ‌های هرباریوم مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور برای مطالعه حاضر تشکر و قدردانی می‌شود.