بررسی تکامل و مکانیسم تکوین پرچم در Salvia hypoleuca Benth. (Lamiaceae) و گونه‌های نزدیک با بررسی‌های ‌میکروسکوپ الکترونی و فیلوژنی مولکولی

مقدمه

تیره نعناییان (Lamiaceae/Labiatae) با بیش از 230 سرده و 7000 گونه در دنیا (Stevens, 2001) و بیش از 35 جنس و 370 گونه در ایران یکی از مهم‌ترین تیره‌های گیاهان گل‌دار به شمار می‌آید Kharazian, 2009)؛ (Jamzad, 2012. این تیره به 7 زیرتیره تقسیم شده است و سرده Salvia L. با حدود 1000 گونه در مناطق مختلف دنیا، به زیرتیره Nepetoideae، طایفه Mentheae تعلق دارد (Walker and Sytsma, 2007). همچنین، دو سرده Lepechinia Willd و Melissa L. به این سرده بسیار نزدیک هستند و در کنار یکدیگر گروهی تک‌نیا را درون طایفه Mentheae تشکیل می‌دهند. Bentham (1848) سرده Salviaرا به 12 بخش تقسیم کرد. علیرغم تنوع زیادی که در شکل‌ رویشی، ترکیب شیمیایی متابولیت‌های ثانویه، ریخت‌شناسی گل و مکانیسم گرده‌افشانی گونه‌های مختلف Salvia مشاهده می‌شود، تا مدت‌ها همه آنها به دلیل داشتن صفت مشترک داشتن دو پرچم، هر یک با رابط طویل شده بین دو نیمه بساک به عنوان یک گروه تک‌نیای طبیعی شناخته می‌شدند (Walker et al., 2004). با این وجود، مطالعه Walker و همکاران (2004) و همچنین مطالعه Walker و Sytsma (2007) نشان داد که گونه‌های این سرده گروهی طبیعی و تک‌نیا نیستند.

گروه‌های تشخیص داده شده درون سرده Salvia ارتباطی مشخص با پرچم نشان می‌دهد (Walker and Sytsma, 2007). شکل‌ اجدادی ریخت‌شناسی بساک را می‌توان به صورت پرچمی به نیمه‌های بساک به هم پیوسته در نظر گرفت. در برخی گونه‌ها، دو نیمه پشتی بساک رشد یافته، اما به هم متصل نشده‌اند. در گروهی دیگر، دو نیمه پشتی بساک رشد نیافته، اما دو انتهای عقبی به صورت یک ساختار پیچیده به هم متصل شده‌اند که دسترسی گرده‌افشان‌ها به شهد گل را دشوار می‌سازد. در گروهی دیگر، نیمه‌های پشتی بساک وجود دارد اما به هم متصل نشده‌اند. در برخی گونه‌ها، دو نیمه بساک پشتی عقیم است و به طور کامل به هم متصل نیستند یا اتصال کوچکی دارند. در بخش Calosphace (Benth.) Epling از این سرده، به طور معمول دو نیمه بساک نازا توسط رابط اتصال‌دهنده به هم متصل هستند.

در زیر سرده Audibertia (Benth.) Epling رابط بلند است؛ در برخی گونه‌ها نیمه‌های بساک پشتی عقیم، در بعضی دیگر نیمه‌های بساک پشتی کامل تحلیل رفته هستند. برخی گونه‌های این سرده دارای بساک پشتی کاهش یافته است که یا به میزان ناچیزی دانه گرده تولید می‌کنند یا هیچ گاه دانه گرده تولید نمی‌کنند. در این گروه، پرچم دارای بساک بادبزنی شکل است و دو بساک پشتی ممکن است کاملاً به هم متصل باشد یا به آسانی از هم جدا شوند. در این گروه، بساک‌های پشتی با رشد در خارج از محور بساک، تخت شده و این وضعیت به ایجاد بساک‌های بادبزنی شکل که از گلویی جام گل بیرون زده بودند منجر می‌شود. ممکن است نیمه‌های دو بساک مجاور کاملاً با هم ممزوج شوند، حتی اگر مانع دسترسی جانوران گرده‌افشان به شهد نشود. تنوع ریخت‌شناسی پرچم‌ها ارتباط نزدیکی با نوع گرده‌افشانی در گونه‌های مختلف این سرده دارد و به همین علت به عنوان عنصری کلیدی در فرآیند گونه‌زایی سازشی در نظر گرفته می‌شود (Claβen-Bockhoff et al., 2003; 2004a;b). فرآیند تکامل شکل‌های مختلف ریخت‌شناسی بساک در سرده Salviaکاملاً مورد توافق نیست. در حالی که Claβen-Bockhoff و همکاران (a2004)برای این فرآیند نوعی هم ساختی با منشأ یکسان را در نظر می‌گیرند، مطالعات Walker و Sytsma (2007) نشان می‌دهد که فرآیند تغییرات ریخت‌شناسی رابط بساک‌ها دارای حداقل سه منشأ مستقل از یکدیگر بوده و باعث شباهت ظاهری برخی شکل‌ها (تکامل موازی) شده است. در هر دو دیدگاه، گونه‌های نزدیک به هم دارای ریخت‌شناسی یکسان بساک هستند. در مطالعه حاضر، تکوین پرچم و جایگاه تکاملی گونه S. hypoleuca Benth. بررسی شده است. مطالعات مولکولی، جایگاه تکاملی آن را در گروه Salvia مشخص خواهد نمود. به علاوه، مراحل مختلف تکوین پرچم در این گونه با بررسی‌های میکروسکوپ الکترونی مشخص خواهد شد. همچنین در ایران چندین گونه Salvia با ریخت‌شناسی نزدیک به S. hypoleuca رویش دارد که پژوهش حاضر در نظر دارد تا جایگاه فیلوژنتیک آنها و ارتباطشان را با یکدیگر مشخص کند. این مطالعه به بررسی این گروه کوچک از گونه‌های ایرانی Salvia پرداخته است و فرآیند احتمالی تکوین پرچم در آنها را مشخص کرده است.

مواد و روش‌ها

مطالعات ریخت‌شناسی: نمونه‌های بررسی شده در مطالعه حاضر اغلب به صورت تازه از رویشگاه‌های طبیعی آن جمع‌آوری شد (جدول 1). بخش‌های مورد نیاز برای مطالعات تکوینی، بلافاصله پس از جمع‌آوری در محلول تثبیت‌کننده FAA (الکل 70 درجه به میزان 85 درصد حجمی، فرم‌آلدهید 37 یا 30 درجه به میزان 10 درصد حجمی و استیک اسید گلاسیال به میزان 5 درصد حجمی) (Azizian et al., 2000) قرار داده شد. غنچه‌های گل در مراحل مختلف تکوینی حداقل به مدت 24 ساعت در محلول FAA تثبیت و پس از آن به مدت 24 ساعت با آب جاری شستشو داده شد. نمونه‌ها پس از شستشو با آب جاری و آب مقطر، برای آب‌زدایی در شیب‌های مختلف الکل: 30،50، 70، 90 و 100 درجه، هر کدام به مدت 15 تا 20 دقیقه قرار داده شد. نمونه‌ها پس از آب‌زدایی با لایه‌ای از طلا پوشانده شد و با میکروسکوپ الکترونی اسکن (SEM) عکسبرداری شد. نمونه‌های بررسی شده شامل غنچه‌های گل S. hypoleuca از بدو تشکیل تا پیش از باز شدن کامل گل بود. در هر مورد غنچه‌ها با سوزن تشریح باز شد و از اندام‌های مختلف عکسبرداری شد. برای مقایسه، نمونه‌ها گل باز شده این گونه در کنار گونه‌های نزدیک به آن یعنی: S. candidissima Vahl، S. chloroleuca Rech. f. and Aellen، S. lachnocalyx Hedge،
S. limbata C. A. Mey. و S. sahendica Bioss. and Bushe مطالعه شد.

جدول 1- مشخصات رویشگاهی وهرباریومی نمونه‌های ‌مطالعه شده ازگونه Salvia hypoleuca و گونه‌های نزدیک به آن

مطالعات مولکولی: برای مطالعات مولکولی از برگ گیاهان تازه خشک شده با سیلیکاژل و نمونه‌های هرباریومی استفاده شد. در مجموع، ژنوم کامل تعداد 4 نمونه گونه S. hypoleuca جمع‌آوری شده از مناطق مختلف ایران، در کنار نمونه‌هایی از S. ahendica،
S. candidissima و S. limbata استخراج شد. استخراج ژنوم کامل با روش CTAB تغییر یافته و با کیت استخراج DNeasy Plant mini kit (شرکت Qiagen، آلمان) انجام شد. همانندسازی و تکثیر ناحیه ITS هسته‌ای (شامل فاصله‌انداز ITS1، ناحیه کد کننده 5.8S و فاصله‌انداز ITS2) در یک واکنش PCR و با استفاده از زوج پرایمر عمومی ITSA
(5΄ GGA AGG AGA AGT CGT AAC AAG .
G 3΄) و ITSB |(5΄ CTT TTC CTC CGC TTA TTG ATA TG 3΄) (Blattner, 1999) یا زوج پرایمر ITS18S. (5΄ CCT TMT CAT YTA GAG GAA GGA G 3’) و ITS28S | (5΄ CCG CTT ATT KAT ATG CTT AAA 3’) انجام شد (Muir and Schlotterer, 1999). پروتکل PCR برای زوج پرایمر ITSA و ITSB شامل تقلیب اولیه به مدت 3 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد، 30 چرخه دمایی شامل 30 ثانیه تقلیب در دمای 95 درجه سانتیگراد، 45 ثانیه اتصال در دمای 55 درجه سانتیگراد و 60 ثانیه طویل شدن در دمای 72 درجه سانتیگراد و طویل شدن نهایی به مدت 7 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد بود.

پروتکل PCR برای زوج پرایمرهای ITS18S و ITS28S شامل تقلیب اولیه به مدت 3 دقیقه در دمای 94 درجه سانتیگراد، سپس 35 چرخه دمایی شامل 18 ثانیه تقلیب در دمای 94 درجه، 30 ثانیه اتصال در دمای 55 درجه و 1 دقیقه طویل شدن در دمای 72 درجه سانتیگراد، به علاوه یک دوره اتصال اضافه به مدت 78 ثانیه در دمای 55 درجه سانتیگراد و یک دوره طویل شدن نهایی به مدت 7 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد بود.

پس از توالی‌یابی ترادف ناحیه ITS، کروماتوگرام‌های حاصل از تعیین توالی DNA برای اطمینان و تصحیح اشتباهات احتمالی با کمک توالی‌های معکوس در نرم‌افزار Sequencher به صورت چشمی بررسی شدند. برای مقایسه توالی به دست آمده با توالی ناحیه ITS گونه‌های دیگر سرده Salvia و سرده‌های نزدیک، از توالی‌های موجود در بانک ژن استفاده شد. هم‌ردیف‌سازی ترادف‌ها با استفاده از نرم‌افزار Mac Clade (Maddison and Maddison, 2002) انجام شد. ماتریس داده‌های هم‌ردیف‌سازی شده در نرم‌افزار PAUP 4 (Swofford, 2002) با روش بیشینه صرفه‌جویی (Maximum Parsimony) آنالیز شد. به علاوه، داده‌ها پس از تعیین مدل تکاملی توسط نرم‌افزارهای PAUP و Modeltest 3.7 (Posada, 2008)، در نرم‌افزار MrBayes (Ronquist and Huelsenbeck, 2003) با روش بایسین (Bayesian Analysis) آنالیز شد.

نتایج

مطالعات ریخت‌شناسی: مراحل مختلف تکوین گل گونه S. hypoleuca در شکل 1 نشان داده شده است. شکل 1-A غنچه باز نشده گل و شکل 1-B غنچه باز شده‌ همان گل را نشان می‌دهد. در این مرحله غنچه 2 تا 5/2 میلی‌متر طول و حدود 5/0 میلی‌متر عرض‌ دارد و نیمه‌های زایای بساک شکل گرفته‌اند. اما در این مرحله هنوز رابط اتصال‌دهنده و میله پرچم تکوین نیافته و قابل مشاهده نیست (شکل 1-B). خامه گل بسیار کوتاه، با طولی حدود 5/0 میلی‌متر است. به علاوه، دیواره میانی تخمک‌ها شکل گرفته، چهار برجستگی کوچک تخمدان قابل مشاهده است. با رشد گل و رسیدن طول غنچه به حدود 3 و عرض حدود 1 میلی‌متر، اندازه نیمه‌های زایای بساک افزایش یافته، هنوز رابط و میله پرچم قابل مشاهده نیست (شکل 1-C). در این مرحله خامه گل رشد یافته و طول آن به حدود یک میلی‌متر رسیده است. تخمدان نیز رشد کرده، حدود 5/0 میلی‌متر قطر دارد. از این مرحله به بعد شکاف کلاله قابل مشاهده است. با افزایش رشد غنچه گل و رسیدن آن به طول حدود 4 و عرض حدود 2 میلی‌متر، نیمه‌های زایای بساک بزرگتر شده، میله پرچم به طول 5/0 تا 1 میلی‌متر و رابط اتصال‌دهنده قابل مشاهده است اما هنوز از دو انتهای بخش نازا به هم متصل نشده‌اند (شکل 1-D). به علاوه، در این مرحله، طول خامه گل به حدود 2 میلی‌متر و قطر تخمدان به حدود یک میلی‌متر رسیده است. با افزایش ابعاد غنچه گل و رسیدن طول آن به حدود 5 و عرض حدود 3 میلی‌متر، نیمه‌های زایای بساک تقریباً به شکل و اندازه نهایی خود می‌رسند (شکل 1-E). در این مرحله، طول میله پرچم به حدود 1 تا 2 میلی‌متر رسیده است. خامه گل طویل‌تر شده (حدود 3 میلی‌متر)، لوب‌های آن به سختی قابل تشخیص هستند. قطر تخمدان نیز بیشتر شده، به حدود 5/1 میلی‌متر رسیده است. رابط اتصال‌دهنده در حال تشکیل است اما هنوز رابط دو پرچم به هم متصل نیستند، هر چند که نسبت به مرحله قبل، فاصله کمتری از یکدیگر دارند. با رسیدن طول غنچه به حدود 6 و عرض حدود 4-5/4 میلی‌متر و پیش از شکوفایی گل، همه اندام‌ها شکل نهایی خود را یافته، به طور کامل تشکیل شده‌اند (شکل 1-F). نیمه‌های زایای بساک در شکل و اندازه نهایی خود، رابط اتصال‌دهنده به طور کامل تشکیل شده و در انتهای آن نیمه‌های نازای بساک دیده می‌شود. خامه گل کاملاً رشد یافته و به شکل و اندازه نهایی خود رسیده، در انتهای آن کلاله دو شاخه قابل مشاهده است.

بررسی گل بالغ در گونه‌های S. candidissima،
S. chloroleuca، S. lachnocalyx، S. limbata و
S. sahendica نشان داد که ساختار پرچم در این گونه‌ها با ساختار پرچم در گونه S. hypoleuca مشابه است. در تمامی این گونه‌ها، بساک‌ها دارای رابط طویلی هستند که نیمه زایای گل را به نیمه نازای آن متصل می‌کند و نیمه‌های نازای دو پرچم در انتها به یکدیگر متصل شده‌اند (شکل 2).

مطالعات مولکولی: در آنالیز مولکولی داده‌های حاصل از ناحیه ITS در مجموع 4 نمونه از گونه
S. hypoleucaهمراه با نمونه‌هایی از
S. candidissima، S. limbata و S. sahendica برای نخستین بار تعیین ترادف شد. در کنار این نمونه‌ها، ترادف ناحیه ITS از 147 گونه Salvia، دو گونه از Lepechinia Willd.، دو گونه از Perovskia Kar.، یک گونه Rosmarinus L.، یک گونه Zhumeria Rech.f. and Wendelbo، یک گونه Dorystaechas Bioss. and Helder. ex Benth. و یک گونه Meriandra Benth. در کنار نمونه‌ای از Melissa officinalis L. به عنوان برون گروه آنالیز شد. مجموعه داده‌های حاصل از تعیین ترادف ناحیه ITS شامل 665 باز بود که از آن میان 287 جایگاه ثابت، 91 جایگاه از نظر پارسیمونی غیر اطلاعاتی و 287 جایگاه از نظر پارسیمونی اطلاعاتی بودند. درخت اجماع قاطع حاصل از تحلیل پارسیمونی از ترکیب 5000 از کوتاه‌ترین درختان تشکیل شد که 2022 گام طول داشت و دارای شاخص ثبات 326/0 بود. برای تعیین درجه حمایت شاخه‌ها، آزمون بوت‌استرپ با روش سریع با 20000 تکرار انجام شد.

شکل 1- مراحل مختلف تکوین پرچم در گونه Salvia hypoleuca. (A غنچه باز نشده S. hypoleuca؛ (B غنچه باز شده به طول 2 میلی‌متر؛
(C غنچه باز شده به طول 3 میلی‌متر؛ (D غنچه باز شده به طول 4 میلی‌متر؛ (E غنچه باز شده به طول 5 میلی‌متر؛ (F غنچه باز شده به طول 6 میلی‌متر (AT: نیمه‌های جلویی بساک؛ C: رابط اتصال‌دهنده؛ f: میله؛ o: تخمدان؛ sti: کلاله؛ sty: خامه).‌

شکل 2- مورفولوژی پرچم در گونه‌های نزدیک به Salvia hypoleuca. (A پرچم در S. sahendica؛ (B پرچم در S. limbata؛ (C پرچم در
S. candidassimi؛ (D پرچم در S. cloroleuca؛ پرچم در S. lachnocalyx. (AT: نیمه‌های جلویی بساک؛ C: رابط اتصال‌دهنده؛ f: میله؛
o: تخمدان؛ sti: کلاله؛ sty: خامه).